药物组合物及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种药物组合物及其用途。

背景技术：

脂肪肝(fattyliver)是常见的弥漫性肝病之一，是由多种原因引起的肝脏脂肪代谢紊乱的一种代谢性疾病，主要是肝细胞摄取的脂肪增加而氧化减少所致的肝细胞内蓄积脂肪过多的病理状态。脂肪肝的病因比较复杂，常见如酗酒、肥胖、糖尿病、脂质代谢异常等，特别是与高脂血症有密切关系。脂肪肝的发病机制至今尚未完全明确。一般认为肝细胞合成甘油三酯及分泌低密度脂蛋白之间的不平衡是形成脂肪肝的主要原因。根据形成脂肪肝病因的不同，通常分为酒精性脂肪性肝病(alcoholicfattyliverdisease，afld)和非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholicfattyliverdisease,nafld)。nafld是指过多的脂肪以甘油三酯(脂肪变性)的形式在肝脏中堆积，其发病机制与胰岛素抵抗(insulinresistance，ir)和代谢综合征(metabolismsyndrome，ms)有关。nafld的疾病谱从单纯的肝脏脂肪变性(nonalcoholicfattyliver，nafl)到非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，nash)，以致发展为肝纤维化及肝硬化甚至肝细胞癌。nafld不仅是欧美发达国家的第一大肝病，据估计发达国家有20％～30％人口有非酒精性脂肪肝，预计到2030年该数值将攀升至50％，但目前却仍无获批上市的药物；其在全球范围内也正迅猛增加，在我国同样如此，已成为富裕地区第一大慢性肝病，由脂肪肝引发的肝病发病势头也越来越猛。在体检人群中，40至49岁的男性脂肪肝发病率最高，达28％。更令人担心的是，查出脂肪肝之后，到医院进一步检查的人寥寥无几。我国脂肪肝的发病率占平均人口的10％，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，其肝纤维化的发生率高达25％，且约1.5％～8.0％的患者可发展成为肝硬化甚至肝癌。nafld若进展为nash，发生肝硬化，肝衰竭和肝细胞癌的危险将大大增加，据报道nafld目前已经影响到了20％～40％的成人人群，其中约30％nafld进展为nash，而nash患者肝硬化发病率15％～25％，最终死于肝病的约30％～40％。因此脂肪性肝病已成为当代肝病领域的新挑战。

目前治疗nafld的主要药物包括胰岛素增敏剂(双胍类药物如二甲双胍、噻唑烷二酮类化合物如罗格列酮和匹格列酮)、降脂药物(他汀类、贝特类)、利胆药物(熊去氧胆酸)、护肝类药物(维生素e、水飞蓟素、乙酰半胱氨酸)以及中药(何首乌、丹参、泽泻、 川芎、决明子、山楂等)。种类繁多，作用机制单一，疗效差异不大，整体效果不佳，且伴随副作用、患者耐受性差，仍有待改进。nafld目前没公认有效的治疗方法，许多新药仍在临床试用中。尽管胰岛素增敏剂如噻唑烷二酮类药物已被证实在改善肝脏炎症和脂肪含量方面有一定疗效，但无法阻断nash所致的纤维化进展。

因此，目前用于治疗脂肪肝病的药物还有待进一步研究。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效治疗或预防非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎的药物组合物。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明具体实施例的药物组合物包括：第一组分和第二组分。其中第一组分为选自法尼醇x受体激动剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少之一；第二组分为选自npc1l1受体抑制剂及其前体、活性代谢产物、立体异构体、药学上可接受的盐、酯类和溶剂合物中的至少一种。

因此，本发明所述药物组合物具有降低总胆固醇和/或甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、和/或谷丙转氨酶和/或天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平、肝系数的功效，进而在预防和/或治疗nafld、糖尿病或心血管疾病，以及预防和/或治疗肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等方面具有显著效果。尤其对预防/治疗非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎效果优异。

根据本发明的具体实施例，所述法尼醇x受体激动剂为选自胆酸(ca)、石胆酸(lca)、奥贝胆酸(oca)、鹅去氧胆酸(cdca)、熊去氧胆酸(udca)、脱氧胆酸(dca)、gw4064、way-362450、px-102和px20350中的至少一种。

根据本发明的具体实施例，所述npc1l1受体抑制剂为胆固醇吸收抑制剂化合物。由此将胆酸(ca)、石胆酸(lca)、奥贝胆酸(oca)、鹅去氧胆酸(cdca)、熊去氧胆酸(udca)、脱氧胆酸(dca)、gw4064、way-362450、px-102和px20350中的至少一种与胆固醇吸收抑制剂化合物进行联合使用得到的组合物预防/治疗非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎具有显著。

根据本发明的具体实施例，所述法尼醇x受体激动剂优选为奥贝胆酸。根据本发明的具体实施例，npc1l1受体抑制剂优选为海折麦布、依折麦布。根据本发明的具体实施例，所述依折麦布的活性代谢物为依折麦布酚葡糖苷酸。由此通过将奥贝胆酸与海折麦布和/或依折麦布进行联合组成上述药物组合物可以进一步提高预防/治疗非酒精性脂肪肝和非酒 精性脂肪肝炎作用。

根据本发明的具体实施例，上述药物组合物中npc1l1受体抑制剂优选典型代表药物依折麦布。依折麦布是一种选择性胆固醇吸收抑制剂，其作用于小肠黏膜的刷状缘，特异性结合于肠黏膜上niemann-pickc1-like1(npc1l1)转运蛋白，选择性抑制外源性胆固醇和相关植物甾醇类在小肠部位的吸收，使肝脏胆固醇储存减少，降低血浆中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的同时，提升高密度脂蛋白胆固醇水平。但对其他营养物质，如维生素，脂肪，蛋白质和糖等吸收抑制作用不明显，主要针对饮食引起的高脂血症起作用。与他汀类药物不一样，其对肝脏内源性合成的胆固醇无抑制作用。根据目前技术发展现状，对依折麦布的研发重点仍然集中于作为他汀类药物的联合用药，以降低糖尿病以及代谢综合征引起高胆固醇血症患者的ldl-c水平；以及其对动脉粥样硬化、通过强化降脂以降低心脑血管事件发生等。

近来研究表明依折麦布的作用靶点npc1l1不仅分布在小肠绒毛凹陷，在灵长类动物或人类的肝脏也有表达和分布。所以依折麦布也可作用于在肝脏上npc1l1受体蛋白，促进低密度脂蛋白(ldl)和含有大量脂质的乳糜微粒或极低密度脂蛋白(vldl)从肝胆排除，具有改善脂肪肝的作用。尽管有人提出依折麦布基于其优秀的在降低ldl-c的表现，可能会成为nafld治疗中的希望，但尚未见任何明确结论。

根据本发明的具体实施例，所述药物组合物中所选用的依折麦布，为安全性极高的药物。依折麦布口服后可被迅速吸收，在肠腔和肝脏中糖化为更有活力的产物，经而经肝肠循环，反复用途于npc1l1。以¹⁴c为标记的依折麦布药物代谢实验观察发现，依折麦布几乎不通过主要药物代谢酶——细胞色素p450代谢，故几乎不与其它药物发生作用。

发明人经过研究发现，依折麦布与奥贝胆酸联合应用可以明显加强奥贝胆酸的改善非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎的作用，同时还可以降低奥贝胆酸单用带来的ldl升高等副作用，进而将上述两种药物进行联合应用，很好地弥补了奥贝胆酸在治疗非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎中的缺陷。另外，依折麦布与奥贝胆酸联合应用未出现药物之间的相互作用，因此，该药物组合物具有良好的安全性。

根据本发明的具体实施例，发明人将奥贝胆酸与依折麦布联合应用得到上述实施例的药物组合物是基于下列发现完成的。

首先，奥贝胆酸是一种半合成鹅去氧胆酸，在肝脏、肠道和肾脏等参与胆红素代谢的细胞中大量表达，胆汁酸是其天然配体。相比于安慰剂对照，奥贝胆酸治疗组患者的总胆固醇和低密度脂蛋白水平更高，而高密度脂蛋白下降。部分患者接受了血脂干预，甚至因此提前停药。由治疗引起的胆固醇升高及胰岛素抵抗，或增加动脉粥样硬化风险，进而导致心血管事件，长期安全性成为最大的顾虑，尚需要进一步研究加以明确。

为减少这一副作用，目前的技术人员通常会联想到联合使用他汀类药物。根据目前技术发展现状，他汀类药物作为应用范围最广的调脂药物，对它的单方研究已较为成熟。心血管疾病的患者目前主要获益于他汀类药物降低胆固醇的作用，并且大量体内和体外研究表明，他汀类药物同样具有独立于调脂之外的抗炎作用，表现为调节免疫、抗氧化、抗血栓形成及抗菌等方面的作用。由于炎症及氧化还原机制与nafld及nash的发病机理密切相关，各国指南均推荐他汀类药物应用于血脂异常的nafld及nash治疗。

目前，对他汀类药物治疗对nafld、nash的有效性及安全性的研究较多。他汀类药物治疗降低转氨酶，减轻肝脂肪变性的程度，但是不能改善肝纤维化的严重程度，可能延缓nafld至nash的进展。即他汀对nafld、nash合并血脂异常(高ldl-c血症)的治疗具有一定疗效。但是这些临床试验存在样本量相对较小、随访时间不够长的问题，同时大部分实验没有进行组织学检查。并且他汀类药物一方面存在严重的安全隐患：肌肉疾病可能算是他汀类药物最严重的不良反应，肌病的发生率和严重程度均与他汀的剂量呈正相关性，主要表现为肌痛或肌无力，伴有ck升高至正常上限10倍以上，也可有发热和全身不适症状。肌病未能及时被发现，仍旧继续用药，则可能导致横纹肌溶解和急性肾功能衰竭。同时他汀类药物还可能会引起患者血糖异常，肝酶异常、记忆和认知障碍等。另一方面，也是最为关键的：他汀类药物是通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(hmg-coa)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体数量和活性增加，使血清胆固醇清除增加、水平降低。其对外源性胆固醇作用并不佳。而脂肪肝病人的血胆固醇有极大部分属于因饮食摄入的外源性胆固醇。并且，他汀类药物在联合其它药物使用时，如贝特类、烟酸类、环孢霉素、hiv蛋白酶抑制剂等，常会出现不良反应。因此，发明人认为常规联用他汀类药物，并非合适选择。

为此，发明人经过实验，意外发现，法尼醇x受体激动剂与胆固醇吸收抑制剂具有协同效应，特别是奥贝胆酸与依折麦布组合用药有着意想不到的治疗nafld和nash的效果，特别是该组合物可降低奥贝胆酸单用带来的ldl升高的副作用。从而可以预期该组合药物可以作为治疗非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和高脂血症性脂肪肝的组合药物继续开发。

根据本发明的具体实施例，上述实施例的药物组合物中含有：1～100重量份的所述第一组分；以及1～100重量份的所述第二组分。由此通过采用上述配比，可以进一步提高二者协同效应，进而提高治疗nafld和nash的效果。

根据本发明的具体实施例，优选地，上述实施例的药物组合物中含有2.5～50重量份的所述第一组分；以及5～50重量份的所述第二组分。由此通过采用上述配比，可以进一步提 高二者协同效应，进而提高治疗nafld和nash的效果。

根据本发明的第二方面，本发明提出了一种药物制剂，该药物制剂包括前面所述的药物组合物作为活性成分。由此该制剂发挥活性成分的药理作用，进而具有该药物组合物的所用功效。具体地，该制剂具有降低总胆固醇和/或甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、和/或谷丙转氨酶和/或天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平、肝系数的功效，进而在预防和/或治疗nafld、糖尿病或心血管疾病，以及预防和/或治疗肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌等方面具有显著效果。尤其对预防/治疗非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪肝炎效果优异。

根据本发明的具体实施例，上述药物制剂除以前面所述的作为活性成分外，还包括药学上可接受的载体。根据本发明的实施例，所述药学可接受的载体为选自药学上可接受的溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、粘合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗粘合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂、高分子骨架材料和成膜材料中的至少一种。由此可以使得所述药物组合物能够制剂成型，呈现临床用药物制剂适于给药的形式。

根据本发明的具体实施例，上述药物制剂可以为任一适于口服的剂型。当口服给药时，本发明以药物组合物为活性成分的药物剂型包括但不仅限于片剂、舌下含片、泡腾片、包衣片、糖衣片、分散片、肠溶片、颗粒剂、明胶胶囊、肠溶胶囊、缓释胶囊、控释胶囊、口服液，优选为片剂或胶囊。

根据本发明的具体实施例，上述药物制剂中的活性成分药物组合物中的第一组分的含量为1mg～100mg，优选为2.5mg～50mg；第二组分的含量为1mg～100mg，优选为5mg～50mg。

根据本发明的具体实施例，上述药物制剂中的活性成分药物组合物中的第一组分的含量为1mg，第二组分的含量为1mg。

根据本发明的再一方面，本发明提出了前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：降低总胆固醇和/或甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、和/或谷丙转氨酶和/或天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平、肝系数。

根据本发明的第四方面，本发明提出了前面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：预防和/或治疗nafld、糖尿病或心血管疾病。

根据本发明的具体实施例，所述药物用于：预防和/或治疗肝炎、肝纤维化、肝硬化、肝癌。

根据本发明的第五方面，本发明提出了前面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗 nash药物中的用途。

根据本发明的第六方面，本发明提出了前面所述的药物组合物在制备预防和/或治疗高脂血症性脂肪肝药物中的用途。

根据本发明的具体实施例，药物组合物在制备药物中的用途中，药物组合物的给药方式采用口服的方式，或以混合物形式给药，或给予不同时间的先后次序形式给药。

根据本发明的具体实施例，药物组合物在制备药物中的用途中，药物组合物的用药剂量为1～1000mg/天。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1显示了根据本发明的实施例4，给药4周对nafld金黄地鼠肝组织外观的影响的图谱；

图2显示了根据本发明的实施例4，给药4周对nafld金黄地鼠肝组织颜色的影响的图谱。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1制备奥贝胆酸

将1.3kg3α-羟基-6-亚乙基-7-酮基-5β-胆烷酸、13.0kg纯化水、0.65kg50％氢氧化钠水溶液和0.13kg10％钯碳加入反应釜中。反应混合物在1～3个大气压下氢化，直至反应完全。用氮气置换后，反应液过滤回收催化剂，收集母液并转移入反应釜中，升温至95～100℃，搅拌直至反应结束。加入11.5kg乙酸丁酯，搅拌下用约5.2kg柠檬酸水溶液调节ph至4～5。继续搅拌0.5小时后，静置分层，分离有机相经水洗后加入活性炭，在55℃左右处理约0.5小时，滤出活性炭，滤液减压浓缩至大量固体析出。过滤，滤饼用0.6kg乙酸丁酯洗涤后，在不高于60℃减压真空干燥，得到1.2kg3α-羟基-6α-乙基-7-酮基-5β-胆烷酸。

将1.15kg3α-羟基-6α-乙基-7-酮基-5β-胆烷酸、9.2kg纯化水和1.1kg50％氢氧化钠水溶液加入反应釜中。将混合物升温至80℃左右，搅拌至全部溶清。将溶解于5％氢氧化钠水溶液中的硼氢化钠(0.104kg)碱水溶液加入反应釜中，随后继续升温至95～105℃，保温搅 拌直至反应完成。反应液冷却至55℃左右，加入8.1kg乙酸丁酯和8.6kg50％的柠檬酸水溶液，调节ph至4～5，静置分层，分离有机相经水洗后减压浓缩，过滤收集析出固体，用乙酸丁酯重结晶后，真空干燥得到0.75kg奥贝胆酸粗品。将粗品加入6.0kg纯化水和0.17kg50％氢氧化钠水溶液中，搅拌溶解后经滤膜过滤，滤液加入到由16.7kg纯化水和0.25kg37％浓盐酸配制成的稀盐酸中，控制体系温度不低于40℃。滴加完毕后继续在40～45℃搅拌约1小时。将反应液降温至20℃左右，过滤，滤饼用纯化水洗涤至滤液ph为6.0～7.0，在50℃左右真空干燥，得0.7kg奥贝胆酸。

实施例2制备依折麦布

氮气保护下，将(4s)-3-[(5s)-5-(4-氟苯基)-5-羟基-1-氧代戊基]-4-苯基-2-噁唑烷酮(2.0kg)，4-[[(4-氟苯基)亚胺]甲基]-苯酚(2.4kg)，二氯甲烷(15.0kg)加入50l反应釜中，控温低于-5℃，加入dipea(3.8kg)，搅拌下缓慢滴加三甲基氯硅烷(2.3kg)，滴加完毕后继续搅拌直至反应结束，记为体系a。

将四氯化钛(1.26kg)加入含有二氯甲烷(4.5kg)的100l反应釜中，降温至-15℃左右，加入四异丙醇钛(0.68kg)，搅拌20分钟后降温至-30℃，缓慢滴加上述tms保护的主原料体系a，控制温度不超过-20℃，滴加完毕后，剧烈搅拌约3小时，反应完毕。

控制温度低于0℃，滴加异丙醇(16.0kg)，再加入二氯甲烷(34.5kg)，搅拌0.5小时，加入饱和酒石酸水溶液(35.0kg)，自然升温至室温，继续搅拌3小时至反应完全。分液用二氯甲烷萃取水相，合并有机相用纯化水(24.0kg)洗涤，再向有机相加入20％亚硫酸氢钠水溶液(35.0kg)搅拌约3小时，有固体析出，过滤收集固体并用纯化水洗涤。母液转移入反应釜中，分出水层，有机相用纯化水(16.0kg)洗涤后减压浓缩直至无馏分，再加入二氯甲烷(5.6kg)和纯化水(4.0kg)搅拌，固体析出，过滤，得到固体与上述固体合并，烘干，得到1.82kg(s)-3-((s)-5-(4-氟苯基)-5-(三甲基硅氧基)戊酰基)-4-苯基-2-噁唑烷酮。

将(s)-3-((s)-5-(4-氟苯基)-5-(三甲基硅氧基)戊酰基)-4-苯基-2-噁唑烷酮(1.82kg)，二氯甲烷(10.5kg)，bsa(2.55kg)加入100l的反应釜中，加热至回流，搅拌至反应结束，降温至常温，加入甲基叔丁基醚(4.9kg)搅拌1小时，再加入tbaf·3h2o(36.4g)，搅拌至反应结束，减压浓缩至无馏分流出，向浓缩液中加入丙酮(3.8kg)，0～10℃滴加2mol/l的硫酸溶液(2.0kg)，常温搅拌至反应结束，加入二氯甲烷(9.0kg)和纯化水(4.0kg)搅拌，固体析出，抽滤，收集固体。母液重新加入反应釜中，分出水相，有机相再次加入纯化水(10kg)，控温0～10℃搅拌，固体析出，抽滤，得到的固体与上述固体合并，再加入二氯甲烷(5kg)和纯化水(5kg)，打浆后降温至0～5℃抽滤，滤饼在45～55℃减压真空 干燥，所得固体加入无水乙醇(14kg)，溶清后过滤，滤液在45～55℃减压浓缩至约1/2体积，加纯化水(6.6kg)后，降温至0～5℃析晶，搅拌约1小时后抽滤，收集固体，在约50℃减压真空干燥，得依折麦布770g。

实施例3制备依折麦布的酚葡糖苷酸

在-25℃将0.091ml三氟化硼乙醚加入到3.33g3,4,6-三邻乙酰基-α-d-吡喃葡萄糖1,2-(原酸甲酯)和4.24g3-o-乙酰基依折麦布的二氯甲烷溶液中。在-20℃反应2小时，升温至10℃继续反应至完全后，以饱和氯化铵水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取分层。分离得有机相，分别以饱和氯化铵水溶液、水和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，浓缩并经硅胶柱层析纯化获得5.39g反应中间体。

将5.08g该中间体溶于127ml甲醇和127ml三乙胺中，在室温缓慢加入445ml水。所得澄清反应液搅拌过夜直至反应完全。浓缩去除甲醇和三乙胺，残留溶液用1m盐酸酸化后，以乙酸乙酯萃取。合并萃取所得有机相，分别以1m盐酸、水和氯化钠水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，浓缩并经硅胶柱层析纯化和干燥获得2.6g依折麦布酚葡糖苷酸。

实施例4奥贝胆酸与依折麦布联合用药与分别单独用药对单纯高脂饮食诱导的nafld的影响

1、仪器

sysmexchex-180全自动生化仪；beckman22r离心机；sartoriuscp124s电子天平；kudossk7200h超声波清洗器。

2、试药

tc(批号20150912)、tg(批号20151012)、ldl-c(批号20151122)、hdl-c(批号20150322)、alp(批号20151112)、glu(批号20150822)试剂盒均由上海科华生物工程股份有限公司提供；alt(批号zg5005)和ast(批号zg5004)试剂盒购自希森美康；

奥贝胆酸、依折麦布药物均用10％kolliphorhs15配制所需浓度(basf，批号21466288k0)。

3、动物

雄性spf级金黄地鼠78只，bw70～90g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：scxk(京)2012-0001。

4、模型制备

10只金黄地鼠作为正常组喂以普通饲料，其余68只动物于购进当日喂以高脂饲料(配方：0.3％胆固醇，12.5％棕榈油，87.2％基础饲料)，自由饮水，光照周期10h/14h，饲养3w后，禁食14h，自由饮水，次日眼眶后静脉采血0.8ml，肝素钠抗凝，5000r·min^-1离心10min，移取300μl上清液于微量杯，用全自动生化仪测定血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c和alt含量，并根据测定结果对地鼠进行筛选分组。

5、分组与给药

筛选出6只常规饮食地鼠作为正常组，30只高脂饮食地鼠均匀随机分为3组，每组10只，分别为模型组，奥贝胆酸组(1mg/kg)、奥贝胆酸(1mg/kg)+依折麦布组(1mg/kg)。筛选分组当天下午4:00开始给药，各组动物均按10ml·kg^-1体积给药，模型组给予等体积的10％kolliphor。除正常组外，其他3组给药期间继续喂以高脂饲料，给药2周后，所有地鼠禁食不禁水，次日上午将动物乙醚麻醉后，眼眶后静脉采血0.8ml，肝素钠抗凝，5000r·min^-1离心10min，取300μl血浆，用全自动生化仪测定血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平。给药4周后，取血浆继续测定各组血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平；采血完毕后，乙醚深度麻醉，称取动物体质量，腹正中切口开腹，观察肝脏的大小、颜色、质地并拍照，同时取出肝脏，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称取质量用于计算肝指数，并迅速剪下肝左叶置10％中性福尔马林中固定，制成石蜡切片，he染色后光镜观察肝组织病理学变化。

6、统计学处理

数据结果以表示，组间比较采用t检验。

7、实验结果

给药2周后各组地鼠血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平结果见表1。与正常组比较，模型组血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平均显著性升高(p<0.05或p<0.01)；与模型组比较，奥贝胆酸单用组能显著降低地鼠血浆中ast水平(p<0.05)，但对tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt和alp无显著性影响(p>0.05)；与模型组比较，奥贝胆酸联合依折麦布组能显著降低血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast水平(p<0.05或p<0.01)，但血浆中alp水平无明显变化(p>0.05)。

给药4周后各组地鼠血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast和alp水平以及肝系数结果见表2。与正常组比较，模型组血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c、alt、ast水平和肝系数均显著性升高(p<0.01)，但alp无明显差异(p>0.05)；与模型组比较，奥贝胆酸单用组能显著降低地鼠血浆中tc、ldl-c、alt、ast水平(p<0.05或p<0.01)，但数值仍较高，且对tg、hdl-c、alp、肝系数无显著性影响(p>0.05)；与模型组比较，奥贝胆酸联合依折麦布组能显著降低肝系数(p<0.01)以及血浆中tc、tg、ldl-c、hdl-c、 alt、ast、alp水平(p<0.01)。

给药4周后，各组金黄地鼠肝组织标本见图1和图2，其中，图1表示给药4w对nafld金黄地鼠肝组织外观的影响，其中a-1,2,3：正常组；b-1,2,3：模型组；c-1,2,3：奥贝胆酸组；d-1,2,3：奥贝胆酸+依折麦布组，1、2、3表示中各组中任意选择的小鼠。图2显示了给药4w对nafld金黄地鼠肝组织颜色的影响，其中a：正常组；b：模型组；c：奥贝胆酸组；d：奥贝胆酸+依折麦布组。肝脏大体标本观察正常组肝脏呈鲜红色，边缘锐利，表面光滑，质地柔软；模型组地鼠肝脏体积明显增大，外形饱满，包膜紧张，表面粗糙，呈红黄或奶油黄色，趋于白化，边缘变钝，触之有油腻感，质地较脆。奥贝胆酸单用组肝组织较模型组差异不大，但奥贝胆酸联合依折麦布组的地鼠肝脏较模型组红润，有弹性，肝外观均接近正常组。

说明奥贝胆酸单用对金黄地鼠nafld的治疗效果不明显，但奥贝胆酸与依折麦布联用对其表现出理想的疗效。

由此可见，法尼醇x受体激动剂奥贝胆酸与胆固醇吸收抑制剂依折麦布联合用药有着意料不到的治疗nafld和nash效果，特别是该组合物可降低奥贝胆酸单用带来的ldl升高的副作用。从而可以预期该组合药物可以作为治疗非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和高脂血症性脂肪肝的组合药物继续开发。目前尚无相关奥贝胆酸的组合药物治疗的报道，更未见奥贝胆酸与依折麦布的组合。本发明人通过动物模型，发现了两者的药效协同作用，且没有药物-药物相互作用的干扰，更安全。因此奥贝胆酸与依折麦布组合用药对于治疗非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎和高脂血症性脂肪肝等疾病均具有明确的创新性。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。