技术领域本发明涉及一种肾阴虚证+肾源性水肿的复合模型的建立方法，属于中药新用途技术领域。
背景技术：
玄参为玄参科草本植物，可达1米余。支根数条，纺锤形或胡萝卜状膨大，粗可达3厘米以上。生于海拔1700米以下的竹林、溪旁、丛林及高草丛中。味甘、苦、咸，性微寒，有清热凉血，滋阴降火，解毒散结的功效。玄参在神农本草经中记载了其“下水”的功效，可以认为现代中医的“利水”作用，但其利水作用在历史的沿革过程中被忽略了。为了更好地探索开发中药的新用途，国家成立了973课题组，选择了四个“古存今失”的中药，有玄参、知母、黄芩、淫羊藿四味中药，本发明就是研究玄参利水功效中所采用的一种新模型。中医肾阴虚证是传统证候之一，是国内最早开始研究的动物模型之一，建立一个合理的中医动物模型对于研究中药是至关重要的，以往的研究表明，中医肾阴虚证可影响多个代谢通路。现代研究证明肾阴虚证的关键病理环节在下丘脑中枢细胞，比如说它可以引起下丘脑-垂体-各腺轴的功能的异常，包括甲状腺、性腺、肾上腺等腺轴。肾阴虚证模型的研究起源于20世纪50年代，至今有60多年的研究历史，这期间科研人员不断总结出8种可以稳定复制的实验动物模型，例如甲状腺素、甲状腺素联合利血平、肾动脉结扎法、发热中药以及其他等等，它们中甲状腺素联合利血平的方法是最为常见的经典方法，也是被本实验所选用的复制肾阴虚证模型的方法。
技术实现要素：
为了更好地探索开发中药的新用途，本发明采用了一种新的复合模型，下面是本发明肾阴虚证+肾源性水肿的复合模型的建立方法：（1）造模试剂及实验器材甲状腺片（40mg/片）、氨基核苷嘌呤霉素（500mg）、利血平注射液（1ml:1mg）；（2）造模试剂及药物的配置方案造模试剂：将甲状腺素片和利血平注射液配置成每毫升含有甲状腺素片16mg，利血平注射液0.1mg，按照1ml/100g体重，连续灌胃10天；氨基核苷嘌呤霉素：将氨基核苷嘌呤霉素溶于生理盐水，配置成每毫升含有60mg氨基核苷嘌呤霉素；（3）实验动物SD大鼠，雄性，清洁级，体重为200±20g，大鼠置于清洁实验室中，保持12h光照，12h避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，控制室内温度为22±1℃,相对湿度在40%左右。大鼠适应环境一周，放入代谢笼中饲养，继续适应一周后方可开始实验；（4）诱发肾阴虚证于代谢笼内饲养，每日上午9:00-10:00点，按照1ml/100g体重灌胃给予甲状腺素和利血平注射液混合物，连续10日；（5）诱发肾源性水肿于第11日按照1ml/100g体重腹腔注射氨基核苷嘌呤霉素（PAN）溶液；通过上述方法于第18日成功的在同一生物体实现同时发生肾阴虚证+肾源性水肿。并成功利用此复合模型的建立方法得到的模型研究中药玄参对肾阴虚证和肾源性水肿的干预作用。本发明的有益效果是：本发明是在肾阴虚证的基础上建立肾源性水肿的动物模型，即在同一生物体实现同时发生肾阴虚证+肾源性水肿，创造一个中医病证结合的动物模型。肾阴虚证的造模方案一般均具有一定的自愈性，即持续的周期有限，而常见的肾源性水肿的诱发周期较长，一般为一至二个月，如何能够在肾阴虚证的持续时间内诱发肾源性水肿，是本模型的技术关键！本研究采用甲状腺素结合利血平注射液这样的阴虚证造模方式，不仅实现了单纯使用甲状腺素而造成的机体大量消耗的类似“甲亢”的症状，同时使用利血平能够导致植物神经系统发生紊乱，与临床上肾阴虚证的患者发生的症状最为接近（并且这种模型诱发成功后，能够持续数十日，文献记载造模结束后能持续17-21日之多）。一般的肾源性水肿的诱发需要经过数周尾静脉注射，造模周期长，运用常规的造模方法无法在阴虚证持续期间成功诱发肾源性水肿，而本发明采用氨基核苷嘌呤霉素能够在注射后的第七日达到肾源性水肿的高峰，通过腹腔注射，不仅造模方法易于操作，而且实验动物致死率几乎为零。这种先诱发肾阴虚证，并且在阴虚证候下，诱发肾源性水肿这样的造模方法，有效的模仿了病因及疾病的发展过程，同时，实现了创造符合中医及中药的研究方法的动物模型。本发明从中医学角度来建立肾阴虚证结合肾源性水肿的病证结合的病理模型，并利用此模型来研究中药玄参的“滋阴、利水”功效。汉代的名医张仲景创立了“滋阴利水”这一治则，并且创造了著名方剂猪苓汤，滋阴而不碍水，利水而不伤阴，用于治疗阴虚水停，开创了“滋阴利水法”的先河。玄参的滋阴作用可以理解为滋养作用，玄参可以“壮肾水”，古人以此来解释玄参的滋阴降火作用，现代研究中我们通过观察T、E2、T3、T4、Cort等反应肾阴虚证状态生化指标的变化，来阐释玄参的“滋阴”功效；玄参的“利水”功效不应理解为单纯的利尿作用，“利水”作用本身包含着“通利”和“渗除”的作用，即将机体多余的“水液”及代谢产物排出体外。玄参的“滋阴”和“利水”作用可以共同理解为调节机体的“水液”运化，即“水液”之间的微循环和微平衡，从而机体能够处在相对平衡、稳定的状态。试验研究结果表明，玄参的“滋阴”和“利水”功效之间是相互协同的作用，且通过实验研究阐释了张仲景创立的“滋阴利水法”的科学内涵。另外，玄参的滋阴作用体现了其“微寒”的药性特点，佐证了中药玄参发挥“利水”功效的中医学原理。附图说明图1为肾阴虚证+肾源性水肿的造模过程的描述。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。1.造模试剂及实验器材甲状腺片（40mg/片）购自上海长城药业有限公司；氨基核苷嘌呤霉素（500mg）购自Sigma公司；利血平注射液（1ml:1mg）购自广东邦明制药厂有限公司；福尔马林、戊二醛试剂购自天津市百世化工有限公司；全自动尿液分析仪：ClinitekAdvantusTM全自动生化分析仪:ROCHEcobasC311电镜设备：透射电镜TECNAIG2（荷兰）切片机型号：LEICAULTRACOTVCT(德国)光镜设备：SEEPACKPH100（荷兰）2.造模试剂及药物的配置方案造模试剂：将甲状腺素片和利血平注射液配置成每毫升含有甲状腺素片16mg，利血平注射液0.1mg，按照1ml/100g体重，连续灌胃10天；氨基核苷嘌呤霉素：将氨基核苷嘌呤霉素溶于生理盐水，配置成每毫升含有60mg氨基核苷嘌呤霉素，按照0.25ml/100g体重腹腔注射；玄参药液：取玄参冻干粉末，溶于娃哈哈水中超声溶解，配置成含有0.27g/ml的混悬液；呋塞米药液：呋塞米溶于娃哈哈水中，超声溶解，配置成含有0.36mg/ml的呋塞米水溶液3.实验动物SD大鼠，雄性，56只，清洁级，体重为200±20g（北京维通利华实验动物技术有限公司提供），动物合格证号：SCXK（京2013-0079），大鼠置于清洁实验室中，保持12h光照，12h避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，控制室内温度为22±1℃,相对湿度在40%左右。大鼠适应环境一周，放入代谢笼中分笼饲养，继续适应一周后方可开始实验。3.1实验分组及处置方案阴虚水肿试验分为空白组，阴虚组，阴虚持续组，阴虚水肿组，玄参给药组，和呋塞米组，各组n=8;空白组：于代谢笼内饲养，每日上午9:00-10:00点，按照1ml/100g体重灌胃给予生理盐水，连续10日，于第11日取肾、血等处理后，待测；阴虚组：每日上午9:00-10:00点，按照1ml/100g体重灌胃给予甲状腺素和利血平注射液混合物，连续10日，于第11日取肾、血等处理后，待测；阴虚持续组：于代谢笼内饲养，每日上午9:00-10:00点，按照1ml/100g体重灌胃给予甲状腺素和利血平注射液混合物，连续10日，于第11日按照1ml/100g体重腹腔注射生理盐水，于第18日，取肾、血等处理后，待测；阴虚水肿组：于代谢笼内饲养，每日上午9:00-10:00点，按照1ml/100g体重灌胃给予甲状腺素和利血平注射液混合物，连续10日，于第11日按照1ml/100g体重腹腔注射氨基核苷嘌呤霉素（PAN）溶液，于第18日，取肾、血等处理后，待测；玄参给药组:于代谢笼内饲养，每日上午9:00-10:00点，按照1ml/100g体重灌胃给予甲状腺素和利血平注射液混合物，连续10日，于第11日按照1ml/100g体重腹腔注射氨基核苷嘌呤霉素（PAN）溶液，于12-18日，每日10:00-11:00和17:00-18:00分别灌胃给予玄参药液（1ml/100g体重），于第19日，取肾、血处理后，待测；呋塞米组：于代谢笼内饲养，每日上午9:00-10:00点，按照1ml/100g体重灌胃给予甲状腺素和利血平注射液混合物，连续10日，于第11日腹腔注射10mg/100g体重的氨基核苷嘌呤霉素（PAN）溶液，于12-18日，每日上午10:00~11:00点灌胃给予呋塞米水溶液（1ml/100g体重），于第19日，取肾、血等处理后，待测；各代谢笼中的实验动物分别在造模前1日，造模后1，3，5，10，11，12，14，16，18日的11：00~11:30分别收集各组实验动物24h尿液，并且清理代谢笼。3.2样品处理方法血样处理方法：各组实验动物均经腹主动脉采血存于真空采血管内，于4℃低温高速离心机中，以3000r/min离心15min，取血清0.5μL待全自动生化仪检测；0.5μL待放免方法分析；另取3个0.2μL血清分别待试剂盒检测；其余血清留样保存于-80℃低温冰箱内保存备用；光镜检测样品处理：取各组大鼠左侧肾脏，在冰水域中沿中线纵切，将左半颗肾脏浸泡于体积约为自身体积8-10倍的4%福尔马林溶液中固定，其他组织（心、肝、脾、肺等）均按此方法保存；电镜检测样品处理：从剩下的右半侧肾脏中，切取肾组织皮质部，约1.5×1.5×2mm的长方形组织，迅速固定在4℃的5%戊二醛溶液中，避光保存于4℃冰箱内；尿液处理方法：取收集的尿液1ml于4℃低温离心机1000r/min离心10min，取上清液，与剩余尿液，冻存于-80℃冰箱，待UPLC-MS进行检测。3.3各指标的检测方法全自动生化分析仪检测的指标：血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、总甘油三酯（TC）、总胆固醇（TG）、谷氨酸氨基转移酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）、血清总蛋白（TP）、血浆白蛋白（ALB）等指标；放免试剂盒检测指标：睾酮（T）、雌二醇（E2）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4），具体操作按照说明书严格进行；酶标仪检测的指标：环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）和皮质醇（Cort）由ELISA试剂盒来检测，具体操作按照说明书严格进行；全自动尿液分析仪检测：尿蛋白。4.实验结果4.1实验动物基础代谢水平的数据通过观察大鼠体态及行为学变化来判断大鼠的肾阴虚证状态，阴虚证大鼠体重应下降或者缓慢增长，一般多食、暴躁易怒、易动、易惊、怕人、大便干结、自主活动次数明显减少、体温较高、心脏跳动强而有力、毛发光泽度下降等外观体现，加入肾源性水肿造模剂后，阴虚水肿组大鼠腹部逐渐膨胀，四肢爪足红肿，并伴有尿量减少，本实验监测了各组大鼠的基础代谢水平，通过体重、尿量、饮食及饮水量的改变，来衡量大鼠的体征状态。具体信息见表3-2：注：*与空白组比较，各模型组具有显著性差异（P<0.05）**与空白组比较，各模型组具有极显著性差异（P<0.01）#与模型组比较，各给药组具有显著性差异（P<0.05）##与模型组比较，各给药组具有极显著性差异（P<0.01）实验结果与讨论：1.各组实验动物的体重数据随着实验的进程呈现缓慢的增长趋势，虽然阴虚证机体应处于一种消耗的生理状态，但是体重呈现缓慢的增长态势仍然是合理的一种表现；2.从食量的变化可以看出，阴虚证及阴虚证持续组的食量略有上升虽无统计学意义，但是这种趋势符合肾阴虚证的表现，阴虚证水肿组的食量下降推测与肾脏的功能性损伤具有一定的关联性，而各给药组实验动物食量也呈现下降趋势，这种现象的出现除了与造模试剂对肾脏的损伤作用相关之外，与灌胃给药造成的胃部饱胀感亦有一定的关系；尿量的数据分析结果如表3-2所示，饮水量数据在阴虚证和阴虚持续组中略有上调，与肾阴虚证的表现相一致，水肿证诱发后阴虚水肿组的饮水量显著性下降的原因推测与肾损伤导致机体水代谢失常而使饮水量下降，另外两个给药组的饮水量也显著性下降的原因，一方面与肾脏损伤有关系，另外一方面每日灌胃一定量的液体药物，从而减少了实验动物的自由饮水。通过以上四个基础代谢指标的观察，初步认为该动物模型符合中医的肾阴虚证和肾源性水肿的基本表现。4.2反应阴虚证各指标4.2.1反应垂体各腺轴功能的指标本实验选择反映垂体-性腺轴功能的指标分别是睾酮（T）和雌二醇（E2）；反映垂体-甲状腺轴功能的指标分别是三碘甲状腺原氨酸（T3）和甲状腺素（T4）；反映垂体-肾上腺轴功能的指标皮质醇（Cort）选择以上几个具有代表性意义的生化指标作为检测对象，来分析该病证结合模型的病理状态，而这些指标又是近年来众多试验研究使用，用来说明机体“阴虚证”状态的指标结果如表3-3所示。注：*与空白组比较，各模型组具有显著性差异（P<0.05）**与空白组比较，各模型组具有极显著性差异（P<0.01）#与模型组比较，各给药组具有显著性差异（P<0.05）##与模型组比较，各给药组具有极显著性差异（P<0.01）实验结果：1.与空白组比较，以上五个指标在各阴虚证模型组中均具有显著性改变，表明造模试剂对垂体各腺轴具有一定影响，并且阴虚持续组中各指标仍然具有显著性差异，表明肾源性水肿病可以在肾阴虚证候下诱发；2.与空白组比较，各阴虚证模型组T3、T4值显著上升，玄参给药组对此二指标均有显著性回调作用，呋塞米则无显著性回调作用；表明中药玄参和呋塞米对阴虚证大鼠垂体-甲状腺轴的调节功能具有一定的影响，能够使异常调节发生回调；3.与空白组比较，各阴虚模型组T显著下降、E2显著升高，而与阴虚证水肿组比较，玄参给药组能够使T显著提升、E2显著下调，说明中药玄参对阴虚证大鼠的垂体-性腺轴的功能具有调节作用，而呋塞米则无明显作用；4.与空白组比较，各阴虚证组Cort含量显著升高，表明阴虚证大鼠垂体-肾上腺轴功能亢进，与阴虚水肿组比较，中药玄参可以使该指标回调接近正常水平，表明中药玄参具有调节阴虚证大鼠垂体-肾上腺轴的功能，而呋塞米没有这种功能。4.2.2反应机体能量代谢的指标本实验选取乳酸脱氢酶（LDH）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和环磷酸腺苷（cAMP）/环磷酸鸟苷（cGMP）等指标来分别反映机体能量代谢变化水平，结果如表3-4所示。注：*与空白组比较，各模型组具有显著性差异（P<0.05）**与空白组比较，各模型组具有极显著性差异（P<0.01）#与模型组比较，各给药组具有显著性差异（P<0.05）##与模型组比较，各给药组具有极显著性差异（P<0.01）实验结果：1.与空白组比较，乳酸脱氢酶在各阴虚证组均显著性升高，表明机体代谢水平升高，而玄参对该指标有显著地回调作用，呋塞米组也有一定的回调作用，但不具有显著性差异；2.与空白组比较，阴虚组及阴虚持续组的环磷酸腺苷显著下降，环磷酸鸟苷上升，cAMP/cGMP显著下调，玄参给药组具有显著回调作用。cAMP/cGMP的比值发生失调是某些疾病发病机制的一项客观指标，例如在甲状腺机能发生亢进时，血浆中的cGMP浓度略高于正常，肾病中（尤其是尿毒症患者中）该指标也明显上升，另外在中医学中阴虚患者血浆cGMP升高与本实验的结果相一致；环磷酸鸟苷（cAMP）是人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，能够影响糖、脂肪、核酸、蛋白质等的合成起到至关重要的作用，另外对改善心肌细胞功能具有一定的作用，在我们建立的“甲亢型”肾阴虚证模型中，大鼠心跳强烈，并且呈现多食、体重缓慢增长的消耗性体征，与血浆中cAMP含量下降相互吻合，玄参可以有力的调整cAMP/cGMP来缓解肾阴虚证候，表明玄参具有一定的“滋阴”作用。4.3反应肾功能生化的指标本实验选择临床上常用的评价肾功能的指标血肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN），血清总甘油三酯（TG）和血清总胆固醇（TC）等评价实验动物肾功能，结果如表3-5所示。注：*与空白组比较，各模型组具有显著性差异（P<0.05）**与空白组比较，各模型组具有极显著性差异（P<0.01）#与模型组比较，各给药组具有显著性差异（P<0.05）##与模型组比较，各给药组具有极显著性差异（P<0.01）实验结果：1.各阴虚组（阴虚持续组）与空白组比较无显著性差异，表明肾阴虚证大鼠的肾脏功能并没有与正常大鼠有显著性的差异，即肾阴虚证不代表肾脏功能具有实质性的损伤，与中医肾阴虚证的概念相吻合；2.与空白组比较，阴虚水肿组的总甘油三酯、总胆固醇、血肌酐、尿素氮等指标均显著性升高，表明阴虚水肿组的大鼠肾功能发生了损伤性的改变，即造成肾病模型；3.呋塞米和中药玄参均可以使血肌酐、尿素氮和总胆固醇含量显著性回调，并且接近正常水平，表明呋塞米和玄参对于改善肾功能均具有一定的疗效，且呋塞米作用优于玄参。4.4反应机体水肿状况的指标肾病性水肿发病机制的中心环节是低蛋白血症及因而引起的血浆胶体渗透压下降，他是造成组织间液积聚的原发因素。低蛋白血症的原因是血浆蛋白（主要是白蛋白）大量随尿液丢失即尿蛋白升高。故而我们以检测血浆白蛋白和血清总蛋白以及尿蛋白的含量作为评价机体的水肿状况的重要指标，结果如表3-6所示。注：*与空白组比较，各模型组具有显著性差异（P<0.05）**与空白组比较，各模型组具有极显著性差异（P<0.01）#与模型组比较，各给药组具有显著性差异（P<0.05）##与模型组比较，各给药组具有极显著性差异（P<0.01）实验结果:1.阴虚组与阴虚持续组的以上三个指标变化均不明显，表明肾阴虚证对机体的胶体渗透压无明显的影响；2.与空白组比较，阴虚水肿组的血清总蛋白和血浆白蛋白含量均显著性下降、给药各组的尿蛋白也均较自身空白有显著性升高，表明机体呈现了水肿的状态；3.通过给药，呋塞米组对血清总蛋白和血浆白蛋白含量均有显著性回调，中药玄参组对血浆白蛋白有显著性回调作用，以上两种药物对尿蛋白的回调情况均不明显，表明以上两种药物均能够缓解水肿的症状，中药玄参的利尿作用不及高效利尿剂呋塞米。4.5测定给药后大鼠不同时段的尿量通过对各组大鼠的不同时段尿量进行检测，将各给药组与模型组之间的对比，判断药物的是否具有利尿作用，呋塞米为强效利尿药，通过玄参给药组和呋塞米给药组的对比，从而进一步判断玄参的利尿时效特点，分别考察了实验动物在给予中药玄参和西药呋塞米后0-2h,2-8h,8-24h的尿量，具体结果如表3-7所示。注：*与空白组比较，模型组具有显著性差异（P<0.05）**与空白组比较，模型组具有极显著性差异（P<0.01）#与模型组比较，给药组具有显著性差异（P<0.05）##与模型组比较，给药组具有极显著性差异（P<0.01）实验结果：1.与空白组比较，阴水肿模型组的尿量在各时段均有显著性下降，同时各阴虚组中并未见尿量显著性减少，表明阴虚证对肾脏的排泄功能基本不产生影响；2.与阴虚水肿模型组相比较，各给药组的大鼠尿量在各给药时间段内均有显著性提高，并且在给药后短时间内呋塞米的利尿作用较玄参强，符合呋塞米起效快，作用强大的特点；3.与阴虚水肿模型组比较，各给药组24h尿量均有显著性提升，并且玄参组尿量比呋塞米组高，表明玄参具有较强的长效利尿作用。小结：通过监测大鼠基础代谢水平和血生化指标等方面检测，较为直观的反映了机体肾阴虚证和肾源性水肿的状态以及中药玄参和西药呋塞米在“滋阴”和“利水”功效上的对比。我们可以看到阴虚证大鼠基础代谢水平改变包括饮食、饮水量增加，体重缓慢增长，而肾源性水肿组大鼠尿量明显减少，给药后给药组尿量有明显提高；通过生化指标的分析，发现肾阴虚大鼠血清T下降、E2升高；T3、T4和Cort均升高，表明垂体-甲状腺轴、肾上腺轴机能亢进，并且与空白组有显著性差异，并且阴虚持续组各项指标也与空白组有显著性差异，表明该模型没有进行自身恢复；另外阴虚模型组中LDH、ALT的含量在阴虚模型中显著升高，并且cAMP/cGMP比值显著下降，表明机体的能量代谢水平升高，物质合成的水平下降，与“甲亢型”阴虚证的表征相一致。此外，阴虚水肿组血肌酐、血尿素氮、总甘油三酯和总胆固醇含量都有所升高，表明阴虚水肿组的肾功能发生了障碍，证明试验诱导的肾病模型成功。