本发明属于兽用生物制品领域，具体涉及一种含犬瘟热病毒抗原及其他常见犬病病毒抗原的疫苗组合物、试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术：
犬瘟热病毒(caninedistempervirus,cdv)是世界范围内存在的一种高发病率、高死亡率病毒性疾病，伴随着生态环境的变化及动物和病毒的进化，其宿主已由传统的犬科(包括犬、狐狸、貉子等)、浣熊科和鼬科(水貂等)动物扩展到食肉目所有8个科及偶蹄目猪科、灵长目猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，并且呈现不断扩大的趋势。
犬细小病毒(canineparvovirus,cpv)所引发的疾病发病急、病程短、死亡率高，传染性强，可感染各种年龄、性别、品种的犬、狐狸、水貂、貉子和狼，特别易感染幼龄动物(8周龄内的发病死亡率高达70％，1岁内的死亡率也达30％)。
犬腺病毒(canineadenovirus,cav)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，有2个血清型，其中i型腺病毒(cav-i)引起犬传染性肝炎(ich)和狐狸脑炎(fe)；ii型腺病毒(cav-ii)则引起犬的传染性喉气管炎和肠炎。
狂犬病病毒(rabiesvirus,rv)的主要宿主为犬、猫等动物，为人畜共患传染病，多数的人狂犬病是与人类密切接触的带毒犬或猫传播的，其危害已经引起广泛关注。
犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus,cpiv)主要感染犬的呼吸道，临床表现发热、流涕和咳嗽，病理变化以卡他性鼻炎和支气管炎为特征。
犬冠状病毒(caninecoronavirus,ccv)呈急性胃肠炎综合症，导致食欲缺乏、腹泻、呕吐等，是养犬业与养狐业危害较大的疾病之一。
犬钩端螺旋体(leptospiracanicola，lep)有十几个血清型，均能引起发病，且为人畜共患病；国内以黄疸出血型和犬型的致病力最高，其中黄疸出血型常致急性出血性黄石综合症，犬型以肾炎症状为主。
临床上cdv单独感染约占20％左右，与其它病毒(包括cpv、cav、rv、cpiv、ccv、lep)的混合感染高达50％以上，特别地混合感染的病例治愈率比单纯感染率低40％。而目前所使用的犬用疫苗疫苗根据犬不同日龄和不同免疫程序单独或混合免疫，但是这些疫苗中犬瘟热病毒抗原都为上世纪30-40年代在北美流行的毒株onderstepoort株或synderhill株，与流行的cdv病毒差异极大，存在免疫逃避的可能，特别是在这些进口疫苗自引入国内起的临床病例中，犬瘟热单独或混合感染均未得到显著抑制或减少的现象，仍然给宠物犬、养犬业和毛皮经济动物等养殖行业造成极大危害和严重的损失。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种含犬瘟热病毒抗原的疫苗组合物，该疫苗组合物可以有效预防和/或治疗包括犬瘟热病毒在内的多种病原的感染。
本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的犬瘟热病毒抗原、免疫量的其他抗原和兽医学上可接受的载体；其中，所述犬瘟热病毒抗原为基因组中含有编码seqidno.2所示的h蛋白的基因和/或编码seqidno.4所示的f蛋白的基因的犬瘟热病毒抗原，所述犬瘟热病毒抗原包括灭活的全病毒抗原和/或至少一种亚单位抗原。本发明的疫苗组合物对于现在流行的cdv病毒株的攻毒能够有效地预防，且能同时预防和治疗多种病原的感染。
本发明还涉及一种所述疫苗组合物的制备方法。
本发明还涉及一种所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬瘟热相关疾病的药物中的应用。
本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括免疫量的犬瘟热病毒抗原、免疫量的其他抗原和兽医学上可接受的载体，其中，所述犬瘟热病毒抗原为基因组中含有编码seqidno.2所示的h蛋白的基因和/或编码seqidno.4所示的f蛋白的基因的犬瘟热病毒抗原，所述犬瘟热病毒抗原包括灭活的全病毒抗原或至少一种亚单位抗原；所述试剂盒中犬瘟热病毒抗原与其他抗原为灭活抗原和/或亚单位抗原形式时，犬瘟热病毒抗原与其他抗原混合后放置；所述犬瘟热病毒抗原为灭活抗原和/或亚单位抗原形式，所述其他抗原中包含活抗原形式成分时，所述活抗原形式抗原成分与灭活抗原和/或亚单位抗原形式抗原成分分别放置。
本发明还涉及一种所述试剂盒的制备方法。
本发明还涉及所述试剂盒在制备预防和/或治疗犬瘟热相关疾病的药物中的应用。
本发明的有益效果：本发明所制备的疫苗组合物、试剂盒对当前流行的犬瘟热单独或混合感染有良好的预防和控制效果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的犬瘟热病毒抗原、免疫量的其他抗原和兽医学上可接受的载体；其中，所述犬瘟热病毒抗原为基因组中含有编码seqidno.2所示的h蛋白的基因和/或编码seqidno.4所示的f蛋白的基因的犬瘟热病毒抗原，所述犬瘟热病毒抗原包括灭活的全病毒抗原和/或至少一种亚单位抗原。
术语“疫苗组合物”又称免疫原性组合物，是指一种含免疫原的制剂，包括如蛋白质、肽、全细胞、灭活的、亚单位或减毒的活的病毒或细菌，或者多糖，或其组合，其被施用来刺激受体对存在于免疫原性组合物中一种或多种抗原的体液和细胞免疫反应。免疫接种是施用疫苗组合物并在宿主中刺激对抗原的免疫或免疫原性反应的过程。优选的宿主为哺乳动物诸如犬。
术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。
术语“犬瘟热病毒”(caninedistempervirus，cdv)是指隶属于副粘病毒科麻疹病毒属的感染犬科、鼬科和浣熊科等的单股负链不分节段rna病毒，所引发的临床症状包括双相热、发烧、呼吸困难、可见皮肤发红、眼有大量分泌物、鼻流脓性分泌物、后肢不能站立的自然发病而死；剖检肺脏大面积出血坏死、脾脏肿大、肠系膜淋巴结肿大。
术语“犬瘟热病毒抗原”是指至少含有一种犬瘟热病毒抗原形式的任何组合物，所述犬瘟热病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬瘟热病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、减毒的活的或亚单位的抗原，所述亚单位抗原为包含h蛋白、f蛋白和/或m蛋白。减毒和灭活方法是本领域技术人员熟知的。减毒方法包括但不限于在细胞培养物中在核实的细胞系上连续传代(病毒和一些细菌)、在肉汤培养物中连续传代(细菌)、紫外线照射(病毒和细菌)和化学诱变(病毒和细菌)。病毒或细菌的灭活方法包括但不限于用福尔马林、β-丙内酯(betapropriolactone,bpl)或二乙烯亚胺(binaryethylenimine,bei)处理或本领域技术人员已知的其他方法。
术语“兽医学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中其他成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如quila、qs-21(cambridgebiotechincorporation,cambridgema)、gpi-0100(galenicapharmaceuticalsincorporation，birminghamal)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明的疫苗组合物中所述犬瘟热病毒抗原为犬瘟热病毒c/hn/001株抗原，所述犬瘟热病毒c/hn/001株(caninedistempervirus,strainc/hn/001)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno.v201604，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2016年3月29日。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒灭活的全病毒抗原的含量为灭活前103-109tcid50/ml。
术语“tcid50”是指组织培养感染剂量，并且其被定义为感染50％的给定批次的已接种细胞培养所需的病毒稀释。各种方法可用于计算tcid50，包括sperman-karber方法，其用在通篇说明书中。关于spearman-karber方法的描述，参见bwmahy,hokangro.virologymethodsmanual,1996:25-46。在本发明中当抗原含量为灭活抗原含量时，表示灭活前的抗原含量。
作为本发明的一种优选实施方式，所述犬瘟热病毒灭活的全病毒抗原的含量为灭活前104-106tcid50/ml。作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒亚单位抗原包括h蛋白，所述h蛋白氨基酸序列为seqidno.2所示序列。
作为本发明的一种实施方式，所述h蛋白含量为10-200μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒亚单位抗原还包括f蛋白和/或m蛋白，所述f蛋白氨基酸序列为seqidno.4所示序列。
作为本发明的一种实施方式，所述f蛋白含量为10-160μg/ml，所述m蛋白含量为10-180μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述其他抗原包括犬细小病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬伪狂犬病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性乳头瘤病毒抗原、犬微小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原、支气管败血波氏杆菌抗原的一种或多种。
术语“犬细小病毒抗原”指至少含有一种犬细小病毒(canineparvovirus，cpv)抗原形式的任何组合物，所述犬细小病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬细小病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬细小病毒抗原包括活的抗原如吉林省五星动物保健药厂生产的犬五联活疫苗的cpvcr86106株，杨凌绿方生物工程有限公司生产的犬五联活疫苗的cpvan1株，辉瑞公司生产的犬多联苗的cpvnl-35-d株，英特威公司生产的犬四联疫苗的cpv154株，梅里亚公司生产的犬多联苗的cpv115-780916株，海博莱公司生产的犬多联苗的cpvc-780916株；灭活的抗原如中国专利cn102657860a公开的cpv毒株，jl09-11株(参见孙相鑫，犬细小病毒jl09-11株得分离鉴定及免疫研究.中国人民解放军军事医学科学院博士学位论文.2011)，nl-35-d株(参见siedekem,schmidth,stureghetal.vaccinationwithcanineparvovirustype2(cpv-2)protectsagainstchallengewithvirulentcpv-2bandcpv-2c.berlmunchtierarztlwochenschr.2011,124(1-2):58-64)，cpvjs12株(参见李月华等.犬细小病毒js12株vp2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达.中国兽医科学,2013,43(10):991-998)；亚单位的抗原如含cpv抗原性蛋白vp2蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
术语“犬腺病毒ii型抗原”指至少含有一种犬腺病毒ii型(canineadenovirus-ii，cav-ii)抗原形式的任何组合物，所述犬腺病毒ii型抗原可诱导、刺激或能抵抗犬腺病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬腺病毒ii型抗原包括活的抗原如吉林省五星动物保健药厂生产的犬五联活疫苗的cav-iiyca18株，杨凌绿方生物工程有限公司生产的犬五联活疫苗的cav-iixn3株，辉瑞公司生产的犬多联苗的cav-iinl-cpi株，英特威公司生产的犬四联疫苗的cav-iimanhattanlpv3株，梅里亚公司生产的犬多联苗的cav-iicgf2004/75株、海博莱公司生产的犬多联苗的cav-iimanhattan株，亚单位的抗原如含cav抗原性蛋白e3蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
术语“狂犬病毒抗原”指至少含有一种狂犬病毒(rabiesvirus,rv)抗原形式的任何组合物，所述狂犬病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗狂犬病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述狂犬病毒抗原包括活的抗原如乾元浩生物公司生产的狂犬活疫苗的rvflury株，rvrb/e3株(参见中国专利cn1876181a)；灭活的抗原如吉林正业公司生产的狂犬病灭活疫苗的rvflurylep株，上海海利公司生产的狂犬病灭活疫苗的rvsad株，中国人民解放军军事医学科学院研制的狂犬病灭活疫苗的rvcvs-11株，唐山怡安生物工程公司等生产的狂犬病灭活疫苗的rvctn-1株，英特威公司生产的狂犬病灭活疫苗的rvpasteurriv株、辉瑞公司生产的狂犬病灭活疫苗的rvhcp-sad株、梅里亚公司生产的狂犬病灭活疫苗的rvg52株、维克公司生产的狂犬病灭活疫苗的rvvp12株；亚单位的抗原如含rv抗原性蛋白g蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
术语“犬副流感病毒抗原”是指至少含有一种犬副流感病毒(canineparainfluenzavirus，cpiv)抗原形式的任何组合物，所述犬副流感病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬副流感病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬副流感病毒抗原包括活的抗原如cy-c株(保藏号为cgmccno.5268，参见中国专利cn102343088a)，a-20/8株(参见中国专利cn1876181a)，xn-4株(金昌德，李六金，李秦等.犬副流感病毒弱毒株的分离与鉴定.第四军医大学学报，2000,21(6):722-724)，solvary株(金昌德，李六金，娄庆林等.犬副流感流行毒株的分离鉴定.中国畜禽传染病,1997(1):24-27)，以
术语“犬冠状病毒抗原”是指至少含有一种犬冠状病毒(caninecoronavirus,ccv)抗原形式的任何组合物，所述犬冠状病毒抗原可诱导、刺激或能抵抗犬冠状病毒感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬冠状病毒抗原包括活的抗原如ccvys1/v60株(参见中国专利cn1876181a)；灭活的抗原如辉瑞公司生产的犬多联苗的ccvnl-18株；亚单位抗原如含ccv免疫原性蛋白s蛋白或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
术语“犬钩端螺旋体抗原”是指至少含有一种犬钩端螺旋体(leptospiracanicola，lep)抗原形式的任何组合物，所述犬钩端螺旋体抗原可诱导、刺激或能抵抗犬钩端螺旋体感染的免疫应答，所述抗原形式包括但不限于灭活的、活的或亚单位的抗原。所述犬钩端螺旋体抗原包括活的抗原如外膜蛋白(outermembraneprotein,omps)，灭活的抗原如辉瑞公司生产的犬多联苗的lep犬型c-51株、黄疸型nadl11403株，英特威公司生产的犬多联苗的lep犬型ca-12-000株、钩端型820k株；亚单位抗原如含lep免疫原性蛋白、外膜蛋白(omps)或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合。
作为本发明的一种优选实施方式，所述其他抗原包括犬细小病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原的一种或多种。
作为本发明的一种实施方式，所述犬细小病毒抗原包括cpvcr86106株抗原、cpvan1株抗原、cpvnl-35-d株抗原、cpv154株抗原、cpv115-780916株抗原、cpvc-780916株抗原，cpvjl09-11株抗原、cpvjs12株抗原、cpvvp2亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；所述犬腺病毒ii型抗原包括cav-iixn9株抗原、cav-iiyca18株抗原、cav-iixn3株抗原、cav-iinl-cpi株抗原、cav-iimanhattanlpv3株抗原、cav-iicgf2004/75株抗原、cav-iimanhattan株抗原，cave3亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原；以及这些抗原形式组分的混合；所述狂犬病病毒抗原包括rvflury株抗原、rvrb/e3株抗原、rvflurylep株抗原、rvsad株抗原、rvcvs-11株抗原、rvctn-1株抗原、rvpasteurriv株抗原、rvhcp-sad株抗原、rvg52株抗原、rvvp12株抗原；rvg亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；所述犬副流感病毒抗原包括cy-c株抗原、a-20/8株抗原、solvary株抗原、d008株抗原、manhattan株抗原、fdl株抗原、nl-cpi-5株抗原、cornell株抗原、a-20/8株抗原、
作为本发明的一种实施方式，所述兽医学上可接受的载体包括佐剂，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽或gel佐剂中的一种或几种。
术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(europeanpharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoidoil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squaleneoil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其pluronic产品，特别是l121。参见hunter等编写的《thetheoryandpracticalapplicationofadjuvants》(ed.bydesstewart-tull,johnwileyandsons,newyork,1995:51-94)和todd等编写的《vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用powellm和newmanm编写的《vaccinedesign,thesubunitandadiuvantapproach》(plenumpress,1995)第147页描述的spt乳剂及第183页描述的mf59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(carbomer，商品名carbopol)(phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利us2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphaticradical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenicallyunsaturatedgroup)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(bfgoodrich,ohio,usa)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974p、934p和971p，最优选使用卡波普971p。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物ema(monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理ph，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，ribi佐剂系统(ribiincorporation)、blockco-polymer(cytrx,atlantaga)、saf-m(chiron,emeryvilleca)、单磷酰脂质a(monophosphoryllipida)、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽、gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽或gel佐剂中的一种或几种。
本发明的疫苗组合物可直接施用于肌内、鼻腔或皮下，用于肠胃外施用的合适的方法包括肌内、滴鼻和皮下注射。作为本发明的一种优选实施方式，所述药物经肌肉注射给药。
本发明还涉及所述疫苗组合物的制备方法，其中，所述制备方法包括：(1)分别制备所述犬瘟热病毒抗原、所述其他抗原；以及(2)按比例将所述步骤(1)中所述制备的犬瘟热病毒抗原、其他抗原放置，添加兽医学上可接受的载体。
本发明还涉及所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗犬瘟热相关疾病的药物中的应用。
术语“预防和/或治疗”在涉及犬瘟热病毒感染时是指抑制犬瘟热病毒的复制、抑制犬瘟热病毒的传播或防止犬瘟热病毒在其宿主体内定居，以及减轻犬瘟热病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括免疫量的犬瘟热病毒抗原、免疫量的其他抗原和兽医学上可接受的载体，其中，所述犬瘟热病毒抗原为基因组中含有编码seqidno.2所示的h蛋白的基因和/或编码seqidno.4所示的f蛋白的基因的犬瘟热病毒抗原，所述犬瘟热病毒抗原包括灭活的全病毒抗原或至少一种亚单位抗原；所述试剂盒中犬瘟热病毒抗原与其他抗原为灭活抗原和/或亚单位抗原形式时，犬瘟热病毒抗原与其他抗原混合后放置；所述犬瘟热病毒抗原为灭活抗原和/或亚单位抗原形式，所述其他抗原中包含活抗原形式成分时，所述活抗原形式抗原成分与灭活抗原和/或亚单位抗原形式抗原成分分别放置。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒抗原为犬瘟热病毒c/hn/001株抗原，所述犬瘟热病毒c/hn/001株(caninedistempervirus,strainc/hn/001)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno.v201604，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2016年3月29日。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒灭活的全病毒抗原的含量为灭活前103-109tcid50/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述犬瘟热病毒灭活的全病毒抗原的含量为灭活前104-106tcid50/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述犬瘟热病毒亚单位抗原包括h蛋白，所述h蛋白氨基酸序列为seqidno.2所示序列，所述h蛋白含量为10-200μg/ml。
作为本发明的一种优选实施方式，所述犬瘟热病毒亚单位抗原还包括f蛋白和/或m蛋白，所述f蛋白氨基酸序列为seqidno.4所示序列；所述f蛋白含量为10-160μg/ml，所述m蛋白含量为10-180μg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述其他抗原包括犬细小病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原、犬呼肠病毒抗原、犬伪狂犬病毒抗原、犬轮状病毒抗原、犬疱疹病毒抗原、犬病毒性乳头瘤病毒抗原、犬微小病毒抗原、犬腮腺炎病毒抗原、犬淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒抗原、支气管败血波氏杆菌抗原中的一种或多种。
作为本发明的一种优选实施方式，所述其他抗原包括犬细小病毒抗原、犬腺病毒i型抗原、犬腺病毒ii型抗原、犬钩端螺旋体抗原、犬冠状病毒抗原、犬副流感病毒抗原、狂犬病病毒抗原、犬流感病毒抗原的一种或多种。
作为本发明的一种实施方式，所述犬细小病毒抗原包括cpvcr86106株抗原、cpvan1株抗原、cpvnl-35-d株抗原、cpv154株抗原、cpv115-780916株抗原、cpvc-780916株抗原，cpvjl09-11株抗原、cpvjs12株抗原、cpvvp2亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；所述犬腺病毒ii型抗原包括cav-iixn9株抗原、cav-iiyca18株抗原、cav-iixn3株抗原、cav-iinl-cpi株抗原、cav-iimanhattanlpv3株抗原、cav-iicgf2004/75株抗原、cav-iimanhattan株抗原、cave3亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；所述狂犬病病毒抗原包括rvflury株抗原、rvrb/e3株抗原、rvflurylep株抗原、rvsad株抗原、rvcvs-11株抗原、rvctn-1株抗原、rvpasteurriv株抗原、rvhcp-sad株抗原、rvg52株抗原、rvvp12株抗原、rvg亚单位蛋白抗原或其结构域的抗原，以及这些抗原形式组分的混合；所述犬副流感病毒抗原包括cy-c株抗原、a-20/8株抗原、solvary株抗原、d008株抗原、manhattan株抗原、fdl株抗原、nl-cpi-5株抗原、cornell株抗原、a-20/8株抗原、
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中活抗原部分还包括冻干保护剂，所述灭活抗原和/或亚单位抗原部分还包括佐剂；所述冻干保护剂包括脱脂牛奶、明胶、海藻糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸钠、vc、蔗糖、甘氨酸和/或精氨酸中的一种或几种；所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、ribi佐剂系统、blockco-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims1314、胞壁酰二肽或gel佐剂中的一种或几种。术语“犬”通常被称为狗者，但也包括犬科家族的其他成员如狼、貉子、狐狸。
本发明还涉及所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)分别制备所述犬瘟热病毒抗原、所述其他抗原；以及步骤(2)按比例将所述步骤(1)中所述制备的犬瘟热病毒抗原、其他抗原放置，添加兽医学上可接受的载体。
本发明还涉及所述试剂盒在制备预防和/或治疗犬瘟热相关疾病的药物中的应用。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1犬瘟热病毒毒株的分离鉴定及含量测定
1.1犬瘟热病毒毒株的分离鉴定
犬瘟热病毒由普莱柯生物工程股份有限公司技术人员从疑似爆发犬瘟热的患病犬的肺脏病变处分离得到，命名为cdvc/hn/001株。
以cdvh-f:5'ttagggctcaggtagtcca3'、cdvh-r:5'ctaagkccaattgaratgtgt3'为引物，按照easyscriptone-steprt-pcrsupermix(购自北京全式金生物技术有限公司)试剂盒说明书进行一步法rt-pcr技术扩增cdvc/hn/001株的h基因序列，扩增目的片段连接t载体后转化，挑选阳性克隆质粒予英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，结果如seqidno.1所示，与核酸电泳带1800bp左右相符；并与genbank中cdvh蛋白基因序列进行megalign处理以分析比对，结果表明：该毒株为亚洲i型病毒，与传统疫苗株onderstepoort株h蛋白基因序列的同源性为90％。
同时，以cdvf-f:5'-ccggaattcacaggcaagccccatgcac-3'、cdvf-r:5'-ccgctcgagaattaggcgggacttatgga-3'为引物，按照easyscriptone-steprt-pcrsupermix(购自北京全式金生物技术有限公司)试剂盒说明书进行一步法rt-pcr技术扩增cdvc/hn/001株的f基因序列，扩增目的片段连接t载体后转化，挑选阳性克隆质粒予英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，结果如seqidno.3所示，与核酸电泳带2000bp左右相符；并与genbank中cdv序列进行megalign处理以分析比对，结果表明：该毒株为亚洲i型病毒，与传统疫苗株onderstepoort株f蛋白基因序列的同源性为90％。
1.2犬瘟热病毒毒株含量的测定
将cdvc/hn/001株在单克隆细胞系vero/dogslam细胞系vero/dongslam-1f5株(vero/dogslamcellline,strainvero/dongslam-1f5)(保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctccno.c201611，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2016年03月29日)上扩增，将扩增后的c/hn/001株按照reed-muench方法(参见殷震.动物病毒学.北京:科学出版社,1997)进行病毒含量测定，结果表明：该毒株的含量为104-109tcid50/ml。
实施例2疫苗组合物的制备
2.1cdv灭活全病毒抗原的制备
将cdvc/hn/001株经终浓度为0.025％v/vbpl(β-丙内酯)进行灭活，并按照《中国兽药典》(中国兽药委员会，2010年版三部，中国农业出版社，2010)方法对cdvc/hn/001在进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验，结果表明：cdvc/hn/001株灭活后，未受到细菌、霉菌的污染，也未受到支原体和外源病毒的感染，纯净性良好。
2.2cdv亚单位抗原的制备
根据实施例1所测得的cdvc/hn/001株的h蛋白、f蛋白基因序列(依次见seqidno.1、seqidno.3)，以及cdvsy株的m蛋白基因序列(参见ncbi登录号：kj466106)，分别设计引物序列如下：
cdvh-f:5’-ttagggctcaggtagtcca-3’
cdvh-r:5’-ctaagkccaattgaratgtgt-3’
cdvf-f:5’-ccggaattcacaggcaagccccatgcac-3’
cdvf-r:5’-ccgctcgagaattaggcgggacttatgga-3’
cdvm-f:5’-ccgctcgagaaaactgctttcactatcgc-3’
cdvm-r:5’-ggaagatctcaggagcaacaccgagacaa-3’
按照liufx等(liufx,zhaoy,liledal.buddingofpestedespetitsruminantsvirus-likeparticlesfrominsectcellmembranebasedonintracellularco-expressionofpestedespetitsruminantsvirusm,handnproteinsbyrecombinantbaculoviruses.jvirolmethods.2014,207:78-85)文献的操作方法依次构建表达犬瘟热病毒h、f和m蛋白，并纯化获得h、f和m蛋白。最终分别获得纯化后h、f和m重组蛋白，并分别用bca蛋白定量试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)按照说明书测定蛋白含量，结果：h、f和m蛋白含量依次为0.8、0.8、1mg/ml。
2.3疫苗组合物的制备
用生理盐水溶液将实施例2.1、2.2依次制备的cdvc/hn/001株抗原、亚单位抗原、现有技术中的其他抗原以及petgela佐剂(购自法国seppic公司，终浓度为5％)按照表1所示组分及含量进行配制。其中，灭活的或亚单位的抗原、活的抗原组成疫苗组合物(包括疫苗2、3、4、6)时，将灭活的或亚单位的抗原、petgela佐剂用pbs溶液按表1中所示终浓度进行混合配制得混合液，并对各混合液分别进行性状检验(久置后上层为无色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液)、无菌检验(按现行《中国兽药典》进行检验，均无菌生长)；并对活抗原进行性状检验(为乳白色海绵状树洞团块，易于瓶壁脱离)、无菌检验(按现行《中国兽药典》进行检验，均无菌生长)。免疫使用时，使用含灭活的或亚单位的抗原、佐剂的混合液稀释活的抗原，使活的抗原的终浓度如表1所示。
表1含犬瘟热病毒抗原的疫苗组合物所含组分及含量
注：疫苗1、5中的cpv抗原为灭活的jl09-11株(参见孙相鑫，犬细小病毒jl09-11株得分离鉴定及免疫研究.中国人民解放军军事医学科学院博士学位论文.2011)；疫苗2、3、4、6中的cpv抗原为弱毒的nl-35-d株(参见siedekem,schmidth,stureghetal.vaccinationwithcanineparvovirustype2(cpv-2)protectsagainstchallengewithvirulentcpv-2bandcpv-2c.berlmunchtierarztlwochenschr.2011,124(1-2):58-64)；疫苗3、6中的cavⅱ抗原为的弱毒yca18株(参见夏咸柱，范泉水，扈荣良等.ⅱ型犬腺病毒自然弱毒yca18株的实验免疫研究.中国兽药杂志,2001,35(2):1-4)。
实施例3疫苗组合物的应用
3.1疫苗组合物的安全性试验
选取cdv抗原、抗体阴性、cpv抗原阴性及cav抗原阴性的2-3月龄健康龄比格犬30只，随机分为6组，5组/只，分别免疫实施例2制备的疫苗1-6，每只比格犬均注射10个使用剂量的疫苗，观察14日。结果：免疫接种比格犬精神、饮食均正常；体温无明显变化，均在正常38.5℃-39.5℃范围内；接种部位没有出现肿胀、坏死，无全身不良反应。
表明：疫苗1-6的安全性试验均合格。
3.2疫苗组合物之犬瘟热病毒抗原的动物试验
选取cdv抗原、抗体阴性的2-3月健康龄比格犬40只，随机分为8组，5只/组，分别免疫疫苗1-6，1头份/只。第7组为现有技术对照组，免疫购自英特威公司的犬瘟热、犬细小病毒二联活疫苗(作为现有疫苗1)，1头份/只。另设第8组作为空白对照组，不免疫，隔离饲养。分别于免疫前以及免疫后14天、21天采血以检测犬瘟热病毒的中和抗体即cdvsn抗体(参见殷震,刘景华.动物病毒学.第2版.北京：科学出版社,1997:204-437)。免疫21天后，对所有犬分别通过滴鼻和腹腔注射途径攻击犬瘟热病毒c/hn/001株病毒液6ml(病毒含量为2×106.0tcid50)，观察14日，结果见表2。
表2犬瘟热病毒抗原动物试验结果
注：#表示现有疫苗对照组中有1只体温升高、1只食欲减退、1只拉稀便并且死亡，*表示对照组各犬均出现体温升高、精神萎靡、食欲减退、稀便等犬瘟热病毒病的典型症状。
由表2可知：(1)免疫后的抗体效价，疫苗1-3免疫犬后所产生的cdvsn抗体效价相当，高于疫苗4-6免疫后的，也高于现有疫苗免疫后的，表明犬瘟热病毒灭活抗原所产生的免疫效果优于犬瘟热病毒亚单位抗原、现有疫苗的；疫苗4-6免疫犬后所产生的cdvsn抗体效价以含犬瘟热病毒h、f蛋白所制备的亚单位抗原免疫后的最高，其次为含犬瘟热病毒h、f、m蛋白的抗体效价，再次为含犬瘟热病毒h蛋白的抗体效价，但仍高于现有疫苗的抗体效价；(2)攻毒保护，疫苗1-6免疫后用cdv流行的强毒株攻毒均未出现犬瘟热病毒病的症状，且保护率均为100％；而现有疫苗免疫后用cdv流行的强毒株攻毒后有3只出现犬瘟热病毒病的症状，保护率为80％，低于疫苗1-6的抗体效价。
3.3疫苗组合物之犬细小病毒抗原的动物试验
选取cpv抗原阴性(hi≤1:4)、2-3月龄健康龄比格犬40只，随机分为8组，5只/组，1-6组分别免疫疫苗1-6疫苗，1头份/只。第7组免疫购自辉瑞公司的犬细小病毒病活疫苗(卫佳-5，作为现有疫苗2)，1头份/只。另设第8组作为空白对照，不免疫，隔离饲养。分别于免疫前以及免疫后14天、21天采血，检测hi抗体效价(hi抗体效价的检测根据：殷震,刘景华.动物病毒学.第2版.北京：科学出版社,1997:204-437)。免疫后21天，对所有犬分别通过口服途径攻击犬细小病毒cpv-825/98株(参见siedekem,schmidth,stureghetal.vaccinationwithcanineparvovirustype2(cpv-2)protectsagainstchallengewithvirulentcpv-2bandcpv-2c.berlmunchtierarztlwochenschr.2011,124(1-2):58-64)病毒液1ml(病毒含量为103.5tcid50)，观察14日。结果见表3。
表3疫苗组合物之犬细小病毒抗原的动物试验结果
注：*表示对照组各犬均出现食欲减退、精神沉郁、腹泻、粘便、血便等犬细小病毒病的典型症状。
由表3可知：(1)免疫后的抗体效价，疫苗1、5免疫犬后所产生的cpvhi抗体效价相当，高于疫苗2、3、4、6免疫后的抗体效价，也高于现有疫苗免疫后的抗体效价，表明犬细小病毒减毒的活的抗原所产生的免疫效果优于犬细小病毒灭活抗原、现有疫苗的抗体效价；疫苗2、3、4、6免疫犬后所产生的cpvhi抗体效价相当，高于现有疫苗的抗体效价，表明犬细小病毒抗原与犬瘟热病毒抗原混合使用时可协同提高犬细小病毒抗原的免疫效果；(2)攻毒保护，疫苗1-6免疫后用cpv流行的强毒株攻毒均未出现犬细小病毒病的症状，且保护率均为100％，与现有疫苗免疫后的攻毒效果相当。
3.4疫苗组合物之犬腺病毒抗原的动物试验
选取cav抗原阴性、抗体≤1:2、2-3月龄的健康龄比格犬20只，
随机分为4组，5只/组，1-2组分别免疫疫苗3和疫苗6，1头份/只。第3组作为现有技术对照组，免疫购自美国辉瑞公司的卫佳-5(作为现有疫苗3)。另设第4组作为空白对照组，不免疫，隔离饲养。分别于免疫前和免疫后14天、21天采血，检测cav中和抗体(即cavsn抗体检测根据：殷震,刘景华.动物病毒学第2版.北京：科学出版社,1997:204-437)。二免后28天，对所有犬分别鼻腔途径攻击犬腺病毒cav-ⅰ型a8301株(参见夏咸柱，范泉水，扈荣良等.ⅱ型犬腺病毒自然弱毒yca18株的实验免疫研究.中国兽药杂志,2001,35(2):1-4)病毒液1ml(病毒含量为105.5tcid50)，观察14日，结果见表4。
表4疫苗组合物之犬腺病毒抗原的动物试验结果
注：*对照犬均出现体温升高、食欲减少、渴饮增加、沉郁、血便、“兰眼”、咳嗽等犬腺病毒感染的典型症状。
由表4可知：(1)免疫后的抗体效价，疫苗3、6免疫犬后所产生的cavsn抗体效价相当，略高于现有疫苗的抗体效价，表明犬腺病毒ⅱ型抗原与犬瘟热病毒抗原混合使用时可协同提高犬腺病毒ⅱ型抗原的免疫效果；(2)攻毒保护，疫苗3、6免疫后用犬腺病毒流行的强毒株攻毒均未出现犬腺病毒病的症状，且保护率均为100％，与现有疫苗免疫后的攻毒效果相当。
综上所述：本发明制备的含犬瘟热病毒抗原的疫苗组合物免疫后不仅没有双相热、发烧、呼吸困难、可见皮肤发红、眼有大量分泌物、鼻流脓性分泌物、后肢不能站立的临床症状，而且免疫效果优于现有商品化疫苗，特别地，对疫苗组合物中所含其他抗原的免疫效果还具有协同增效作用。
以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法和功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。