一种视网膜变性模型及其药物筛选方法与流程

文档序号:13109120
技术领域本发明涉及一种动物模型,尤其是涉及一种视网膜变性模型及其药物筛选方法。

背景技术:
目前视网膜变性的模型分为遗传性和化学性两种,化学性模型的一种典型模型是利用碘酸钠诱导,对于碘酸钠诱导的记性视网膜变性模型由于病程非常急,碘酸钠作为一个强氧化剂,虽然破坏了视网膜色素上皮细胞(RPE),同时也破坏光感受器细胞,因此虽然有相关碘酸钠诱导猴子视网膜变性模型的报道(比如中国专利CN102198278A即公开了一种恒河猴视网膜变性模型及其药物筛选方法),但是其重复性较差,很难重复出来。对于遗传性模型,有单基因突变导致的遗传性年龄相关性黄斑变性(AMD)大鼠模型(RCS大鼠),由于Mertk基因突变因其RPE细胞吞噬功能减退,引起继发性视网膜变性。

技术实现要素:
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种能够模拟特发性AMD发病特征的视网膜变性模型及其药物筛选方法。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:一种视网膜变性模型,用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射。所述的慢病毒介导的反义mir-24的病毒具体是指将反义miR-24序列克隆到慢病毒载体上得到的病毒,所述的miR-24碱基序列如SEQIDNO.1所示。所述的慢病毒介导的反义mir-24的病毒的注射剂量是3ul,病毒滴度为5-10*10^7tu\/ml。所述的模型动物包括大鼠与猴子,优选为SD大鼠或食蟹猴。一种筛选治疗视网膜变性的药物的方法,包括如下步骤:a、用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射,建立视网膜变性模型;b、将候选药物施用于变性模型;c、观察候选药物对视网膜变性、损伤程度的量化指标的影响情况,并进行评分,评价潜在治疗视网膜变性的药物。步骤a中,所述的慢病毒介导的反义mir-24的病毒的注射剂量是3ul,病毒滴度为5-10*10^7tu\/ml。所述的模型动物包括大鼠与猴子,优选为SD大鼠或食蟹猴。与现有技术相比,本发明首次采用用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射,建立视网膜变性模型,选择性破坏RPE细胞,引起继发性视网膜膜变性,具有视网膜变性的病例特征。本发明提供的这种模型可用于研究视网膜变性的机制和药物筛选。本发明模型是封闭一个RPE细胞重要的一个miRNA-mir-24,根据miRNA的作用机制(一个miRNA作用多个靶基因),更能模拟特发性AMD发病的特征。附图说明图1为anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的视功能降低和视网膜相关基因表达的变化,opsin、rhodopsin和recoverin为光感受器细胞的标记蛋白显著下调;bim、bax、bak等促凋亡基因未见。图2为anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的视网膜核层变薄,Muller细胞活化。图3为anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的促炎因子CHI3L1表达上调,RPE65表达下调,提示RPE功能减弱。图4为ELISA检测anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的CHI3L1产生增多。图5为anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射视网膜引起的RPE细胞破坏,RPE65免疫荧光降低(RBCC铺片)。图6为anti-miR-24食蟹猴视网膜下腔注射引起的渗漏(FFA和眼底照相)。图7为食蟹猴视网膜正常的OCT检测结果;anti-miR-24食蟹猴视网膜下腔注射7周OCT检测,发现视网膜结构紊乱,RPE曾与外核层粘连。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。实施例1用慢病毒介导的反义mir-24的病毒进行模型动物视网膜下腔注射,得到视网膜变性模型。反义mir-24为的反义序列如SEQIDNO.1所示,为CTGTTCCTGCTGAACTGAGCCA。将反义miR-24序列克隆到慢病毒载体上得到慢病毒介导的反义mir-24的病毒是本领域常规的技术手段,也可以购买,即反义mir-24病毒也是商品化的。获得病毒后,分装冻存于-80%。取正常成年SD大鼠,体重200g左右,置于体式显微镜下,并在大鼠眼球上放置凹透镜;用30gauge针头在角巩膜缘后2mm处刺一个针孔,然后用装有33gauge针头的微量注射器从针孔处进针至视网膜下腔,注入3μl(含5-10*10^7tu\/ml)病毒。对侧眼视网膜下腔等体积注射等量对照病毒。在注射病毒后的2w、5w和7w进行视网膜电生理(ERG)检测。ERG方法:APS全自动视觉电生理检查仪(APS-2000)购于重庆康华科技有限公司。做视觉电生理功能检查前一天,把DM大鼠转移到暗房,进行暗适应。第二天开始做。大鼠的准备:向大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(1mL\/500g体重)进行麻醉,1×速眠新(0.1ml\/200g)让眼球突出,然后给予一滴0.5%托吡卡胺散瞳(WuxiShanheGroup,Jiangsu,China),一滴0.4%盐酸奥布卡因表面麻醉(EisaiCoLtd,Tokyo,Japan),每只眼睛各涂一点导电膏。插电极:地线接大鼠尾巴上,负极接大鼠两耳朵之间,正极接两眼睛角膜上,注意不要触到眼睑和巩膜上。打开软件“视觉电生理图”,点“FERG”,再点1,2通道,一个为左眼通道,另一个为右眼通道,点“设置”,刺激次数为2次,刺激频率为0.05Hz;依次点击刺激强度(1)―0.0006325(cd*s\/m)、(5)―0.006325(cd*s\/m)、(9)―0.06325(cd*s\/m),每次强度至少间隔2min。点“示波”,待波的基线平稳时,点击“采集”,等听到“嘀”的一声后,采集完毕,点击“保存”。再点击“设置”,修改文档号和刺激强度,依次类推。等所有强度做完后,换下一只大鼠。所有大鼠做完后,打开“文件”,进行标定,双击曲线,曲线变为白色,点击“标定”。标定完a波后,按空格键,标定b波。所有标定完毕,点击“打印”,保存为.PDF格式。点击左下角按钮,退出软件,关闭电脑,关闭放大器。荧光定量PCR检测:提取RNA采用的是Trizol裂解的方法,主要步骤如下:1.将细胞用PBS缓冲液洗1-2次,按比例加入Trizol裂解液(例如六孔板的一个孔对应1mL裂解液)。2.细胞离壁后,转移到1.5mL的离心管,加入五分之一体积的氯仿,剧烈混匀后,以12000rpm的转速4℃离心15分钟。3.离心后,将上清转移到新的离心管中,注意不要取到中间的蛋白层,加入等体积的异丙醇,冰浴20分钟。4.12000rpm的转速4℃离心15分钟,弃去上清,将沉淀用75%的乙醇洗1-2次。5.将沉淀室温干燥后,用适量的DEPC水溶解。测浓度。RNA反转录,cDNA第一条链是通过Promega公司的M-MLV反转录酶获得的,主要步骤如下:1.首先取1-2μg的RNA与2μL的oligod(T)混合,72℃水浴放置5分钟,立即冰浴2分钟后,使oligod(T)与RNA的poly-A尾巴结合,轻微离心。2.加入1.25μL的dNTP(10μM)、1μLM-MLV反转录酶和0.5μLRNA酶抑制剂,用DEPC水将反应体积调节到25μL。42℃水浴放置1小时。3.70℃放置10分钟使反转录酶失活。将得到的cDNA单链保存于-20℃冰箱。引物见下表1。表1用于检测基因的引物NameforwardreverseqRo-GAPDHCCCCTTCATTGACCTCAACTACATCCCATTCTCAGCCTTGACTGTqRo-RevnCGGCAGGAGTTCGAAAGTATCTTGCTGGGCGTAGGCCTTAqRo-RHOCAGAGGGCCCCAATTTTTATGGGTAGTACTGCGGCTGCTCAAqRo-OPNGAAGGCTACATTGTCTCACTAGAAGACGATTCCCACAGqRo_bimATGAGACTTACACGAGGAGACCAGACGGAAGATGAATCqRo_bakAGAGTTCCAGACCATGCCGCGTAGCCGAAGCCCAGAAGqRo_baxGCAAACTGGTGCTCAAGGGGTCCCGAAGTAGGAAAGGqRo_caspase3CTGGACTGCGGTATTGAGGGGTGCGGTAGAGTAAGC反转录体系如表2:表2反转录体系反转录程序:16℃30分钟,42℃30分钟,85℃10分钟后立即置于冰上5分钟。然后可于-20℃冰箱保存备用。定量PCR将RNA反转录后得到的cDNA第一链作为模板,设计引物。利用天根公司的SYBRGreen实时荧光定量PCR检测试剂盒,检测目的基因的表达量。PCR扩增条件如下:94℃变性10分钟,进入循环(95℃5sec,60℃60sec),一共40个循环,并收集溶解曲线。结果参见图1,anti-mir-24在视网膜下腔注射第五周,发现b波波幅与对照比显著性下降,到第七周,b波下降更明显(p<0.05),提示视网膜功能下降;在注射后第七周,在mRNA水平,采用实时荧光定量PCR发现,光感受器细胞的标记物表达,opsin,rhodospin和recoverin显著下调,而促凋亡基因表达没有显著性差异,提示凋亡没有介导光感受器细胞的死亡。在ERG检测b波出现下降(有显著性差异)的时候认为视网膜发生了变性,此时可以用这个模型用于细胞移植、基因治疗等实验性干预。实施例2视网膜下腔注射后进行免疫荧光和核层厚度分析。在视网膜下腔注射好注射后,通过进行免疫荧光染色进行核层厚度分析和Muller细胞胶质化标记物的检测。免疫荧光:组织切片的制备:DM大鼠小心摘除眼球(尽量有视神经存在),于4%多聚甲醛中固定三个小时。在解剖显微镜下,沿着角巩膜缘上方2mm处剪口,把角膜剪掉,再小心移去晶状体和虹膜。剩余的眼球放入30%的蔗糖脱水3个小时。把眼球放入组织包埋剂包埋,视神经放在一侧,注意不要有气泡,4℃冰箱平衡过夜。第二天移至-80℃冰箱备用,视神经乳头的地方做个标记。把包埋的眼球从-80℃冰箱拿出后,用冰冻切片机经过所做的标记和视神经乳头进行连续切片,切片厚度为10μm。免疫荧光检测:视网膜切片用PBS湿润10分钟,0.25%tritonx-100透膜10分钟后,用PBS清洗3次,每次5分钟。室温下用1%BSA封闭30分钟之后,与一抗小鼠抗GS(1:200)、小鼠抗CRALBP(1:50)、兔抗Recoverin(1:500)、兔抗GMFB(1:200)、兔抗GFAP(1:200)在4℃过夜孵育(分别与小鼠抗mCherry抗体(1:1000-1:2000)共染),不加一抗组作为阴性对照。次日继续用PBS清洗3次,5分钟\/次,室温下避光分别与二抗anti-mouseFITC(1:100)或anti-rabbitFITC(1:100)孵育一小时。弃除二抗后,用0.5μg\/mL的DAPI孵育30秒,用PBS清洗3次,5分钟\/次。用DAKO封片,加上盖玻片后于倒置荧光显微镜下观察荧光结果。核层厚度测量:用4%多聚甲醛固定眼球,解剖并蔗糖梯度脱水,然后用OCT包埋眼杯。用冰冻切片机将眼杯通过视神经乳头切成8μm的切片。通过存活光感受器细胞的数目的统计分析视网膜的损伤,分别在鼻侧和颞侧眼球等距离设定10个点。各个点ONL和INL的厚度通过测量获得。由图2所见,视网膜下腔注射anti-mir-247周后,注射侧外核层厚度明显变薄,GFAP免疫荧光显示Muller明显活化。实施例3Anti-mir-24视网膜下腔注射引起RPE标志蛋白的变化和mir-24的靶蛋白的变化。视网膜下腔注射anti-mir-247周后,体式解剖镜下分离RPE-bruch膜-脉络膜复合体,进行wetsernblot,在蛋白水平检测RPE65和Chil3表达WesternBlot方法如下1.配制SDS-PAGE所用的凝胶,首先配制下层分离胶,配制好后,立即缓缓加入到装备好的两层玻璃板中,加入适量双蒸水封闭。2.待下层分离胶凝固后,开始配制上层浓缩胶。将第1步中的上层水倒掉,加入浓缩胶后,慢慢将梳子插上,静置等待凝固。3.将提取的蛋白煮沸变性后,根据蛋白浓度按照相同的样品量加入到凝胶孔内,100V的电压下,一定时间后停止电泳,采用湿转的方法,将蛋白转移到Millipore公司的PVDF膜上。4.转膜结束后,将PVDF膜取出,用3%的脱脂奶粉或BSA将膜在室温封闭1-2小时。5.封闭结束后,将PVDF膜从脱脂牛奶或BSA中取出,用PBST清洗2次,吸干后,加入适量配制好的一抗稀释液,室温摇匀2小时,使一抗与目的蛋白结合。所用的一抗包括:anti-RPE65(Abcam),anti-Chi3L1(Proteintech)和anti-actin(Proteintech)。检测Chi3L1的ELISA试剂盒购自CUSABIO公司的。按照试剂盒要求进行。如图3所示,anti-miR-24大鼠视网膜下腔注射引起的促炎因子CHI3L1表达上调,RPE65表达下调,提示RPE功能减弱。在视网膜下腔注射anti-mir-247周后,体式解剖镜下分离RPE-bruch膜-脉络膜复合体,抽提总蛋白,并进行ELISA,检测Chi3l1表达,如图4所示,发现Chi3l1在注射anti-mir-24组表达显著升高。实施例4视网膜下腔注射anti-mir-247周后,进行RBCC铺片,通过免疫荧光,检测RPE65的免疫反应性。视网膜铺片如下:将大鼠用麻醉后,四肢固定,剪开胸腔,进行左心室灌注,先用PBS灌注,然后再灌注4%PFA。灌注后,取下眼球,可以泡在PBS中4℃存放,也可以马上在体视显微镜下,去除眼前节,小心取出视网膜,在载玻片上剪成6瓣,然后用加抗猝灭的封片剂封片,拍照。一旦视网膜铺片完成,进行RPE65的免疫荧光。免疫荧光同实施例2。由图5可见:视网膜下腔注射anti-mir-247周后,RPE边界不清,变大,RPE65免疫荧光强度减弱,提示RPE功能减弱。实施例5采用上述相同方法进行anti-miR-24食蟹猴视网膜下腔注射,并考察结果。如图6所示,anti-miR-24食蟹猴视网膜下腔注射引起了渗漏(FFA和眼底照相),如图7所示,食蟹猴视网膜正常的OCT检测结果与anti-miR-24食蟹猴视网膜下腔注射7周OCT检测结果,发现视网膜结构紊乱,RPE曾与外核层粘连。上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。...
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