本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品及其制备方法。
背景技术：
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus, PRV）属于疱疹病毒（Herpesviridae）α疱疹病毒亚科（Alphaher-pesririnae）水痘病毒属（Varicello virus）的疱疹病毒亚科Ⅰ型（Porcine herpesvirus Typel），能引发猪的严重疾病。同时，猪既是伪狂犬病毒的贮存者，也是伪狂犬病毒的传染源，控制猪伪狂犬病不仅对养猪事业本身，而且对其它动物养殖的顺利发展也有着十分重要的意义。在欧美等达国家，得利于PRV基因缺失活苗和相应鉴别方法的应用，该病得到控制或根除；但在发展中国家，该病仍频繁发生，严重制约了这些国家和地区养猪业的健康发展。
脂质体(liposomes)是一种具有类似于生物膜结构的双分子小囊，因为它的组成结构和细胞生物膜相似，所以容易与细胞发生吸附、融合、脂交换、内吞，从而被细胞摄取和被细胞膜融合，最后将药物或生物颗粒送入细胞内部，是一种靶向给药系统中的新剂型。实验证据表明，脂质体作为药物的载体，既能包封脂溶性药物，又能包封水溶性药物，提高生物利用率，具有和脂质体细胞的亲和性和与组织相容性等特点。
天然产物活性成分是指从自然存在的再生资源中提取的具有独特功能和生物活性的化合物，其中许多有效成分是疾病防治、强身健体的物质基础。天然产物安全性高，已成为医药、食品及饲料的重要来源。天然产物活性成分包括有黄酮、多酚、萜类等几百种，其分子主要特点有：相对分子质量较低，从几百到几千；具有一定的极性，可溶于许多有机溶剂中。
兽用生物制品质量评定最重要的指标之一就是免疫保护期，然而在实际生产过程中猪伪狂犬活疫苗保护时间长短不一，本发明宗旨在于延长猪伪狂犬病毒抗原在体内的作用时间，诱导动物机体免疫，进而也大幅度提高猪伪狂犬病毒的抗体水平。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品及其制备方法的技术方案。
所述的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS中包含以下组分：乔松素1-6g、紫花前胡素2-8g、大豆甙元5-10g、芍药苷1-3g、脂质体5-10g和冻干保护剂5-15g。
所述的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每1000mlPBS中包含以下组分：乔松素2-5g、紫花前胡素3-7g、大豆甙元6-9g、芍药苷2-3g、脂质体6-9g和冻干保护剂8-12g。
所述的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的脂质体通过以下步骤得到：称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；取pH值为7.0～8.0的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
所述的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的冻干保护剂为蔗糖。
所述的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品，其特征在于称取大豆卵磷脂3-4g和甘氨胆酸2-3g用400-500ml氯仿进行溶解；将100-200ml的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中。
所述的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
取所述重量的各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品。
所述的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征在于所述的pH 7的磷酸盐缓冲液通过以下步骤得到：取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
本发明涉及的组分均为现有产品，其中大豆甙元购于成都瑞芬思生物科技有限公司，芍药苷购于南京春秋生物工程有限公司。
本发明具有以下有益效果：
1）本发明所制备的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品可以使猪只提前产生抗体，降低免疫空白期。
2）本发明所制备的一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品不仅可以增强猪只免疫力，还能延长疫苗保护期，提高猪伪狂犬活疫苗的免疫效果。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。
实施例1：脂质体的制备
称取大豆卵磷脂4g和甘氨胆酸3g，用500ml氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；取pH值为7.0～8.0的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液200ml，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
实施例2：脂质体的制备
称取大豆卵磷脂3g和甘氨胆酸2g，用400ml氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜；取pH值为7.0～8.0的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液100ml，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
实施例3：pH 7磷酸盐缓冲液的制备
取氯化钠8g、氯化钾0.3g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾0.3g、氯化钙0.3g、含6个结晶水的氯化镁0.1g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
实施例4：pH 7磷酸盐缓冲液的制备
取氯化钠10g、氯化钾0.5g、磷酸氢二钠1.2g、磷酸二氢钾0.5g、氯化钙0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.2g；将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116℃，高压灭菌30分钟即得。
实施例5：一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品
取乔松素5g、紫花前胡素6g、大豆甙元8g、芍药苷2g、脂质体6g（实施例1制得）、蔗糖8g；
上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例3制得）中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；
先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品。
实施例6：一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品
取乔松素4g、紫花前胡素4g、大豆甙元6g、芍药苷1g、脂质体5g（实施例1制得）、蔗糖5g；
上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例3制得）中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；
先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品。
实施例7：一种伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品
取乔松素6g、紫花前胡素8g、大豆甙元10g、芍药苷3g、脂质体10g（实施例2制得）、蔗糖15g；
上述各组分充分混合后，加入到1000ml pH 7 磷酸盐缓冲液（实施例4制得）中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中；
先放低温冰箱预冻，再放真空冻干机中干燥，即得到伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品。
试验例1 本发明的应用
1材料
1.1伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品：按本发明实施例5-7制得。
1.2 伪狂犬活疫苗：市购
1.3 试验用猪：28日龄健康断奶仔猪60头，检测伪狂犬抗体、抗原双阴性。70日龄健康育肥猪60头，检测伪狂犬抗体、抗原双阴性。
2 方法
2.1包封率的测定
分别取空白的冻干脂质体和处理过的脂质体冻干粉，用磷酸盐缓冲液进行复溶，超速离心，取上清，按一定比例稀释，测定其吸光度（参考兽药典），平均每个样品测3次，算其平均值。
2.2 形态观察和粒径
脂质体稀释液冻干粉复溶后，在透射电镜（×20000）下观察
2.3 28日龄断奶仔猪免疫效果
将本发明实施例5-7制备的伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品置于PH7的PBS磷酸盐缓冲液中完全溶解，备用。试验将60头28日龄健康断奶仔猪分为四组，每组15头， A组采用本发明实施例5制备的伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液进行疫苗稀释；B组采用本发明实施例6制备的伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液进行疫苗稀释；C组采用本发明实施例7制备的伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液进行疫苗稀释；D组采用疫苗自带稀释液进行疫苗稀释。免疫后于7d、14d、21d、42d、63d、84d分别前腔静脉采血，分离血清，采用IDEXX猪伪狂犬抗体检测试剂盒检测各组gB IgG抗体。
2.4 70日龄猪免疫效果
实施例3-5制备的伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品的处理方法同2.3,备用。试验将60头70日龄健康阴性猪分为四组，每组15头，E组采用本发明实施例5制备的伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液进行疫苗稀释；F组采用本发明实施例6制备伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品进行疫苗稀释；G组采用本发明实施例7制备伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液进行疫苗稀释；H组采用疫苗自带稀释液进行疫苗稀释。免疫后于7d、14d、21d、42d、63d、84d分别采血，分离血清，采用IDEXX伪狂犬抗体检测试剂盒检测各组gB IgG抗体。
3 结果
3.1包封率结果
按照公式：包封率（％）＝系统中包封的药量（A1）/ 系统中包封与未包封的总药量（A2）×100％，结果见表1。
表1包封率测定结果
3.2 形态观察和粒径
脂质体稀释液冻干制品为多室脂质体，粒度规则，为圆形，粒径基本一致，结果见表2。
表2 形态观察和粒径测定结果
3.3 28日龄断奶仔猪免疫效果
表3 28日龄健康断奶仔猪gB IgG抗体检测结果
3.4 70日龄育肥猪免疫效果
表4 70日龄育肥猪gB IgG抗体检测结果
4 结论
综上所述，本发明伪狂犬病活疫苗脂质体稀释液冻干制品可以提高机体免疫力，一方面诱导动物机体提前产生抗体降低免疫空白期；另一方面延长疫苗保护期。鉴于此，本发明可以大幅度提高伪狂犬病活疫苗的免疫效果。