一种用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白G制剂及其制备方法与流程

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一种用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白G制剂及其制备方法与制造工艺

本发明涉及一种用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白G制剂及其制备方法,属于生物医药领域。



背景技术:

肠道疾病大多由多种细菌和病毒感染引起,我国肠道疾病每年的发病率仅次于感冒,超过10亿人次,有5000余万人长期忍受着慢性、顽固性肠道疾病的折磨。腹泻,特别是秋季腹泻,大多是由轮状病毒感染引起,我国小儿腹泻病原构成比中,轮状病毒感染约占40%(欧美国家50%左右)。多发于秋冬季节,严重者可抽搐,并发脱水、水电解质紊乱,甚至危及生命。

据研究,牛初乳的抗病能力主要来源于免疫球蛋白,牛初乳免疫球蛋白有5种,分别是IgG、IgE、IgD、IgM以及IgA,其中免疫球蛋白G(IgG)含量最高,也是牛初乳中最引人注目的活性功能因子和人体所需的生理活性物质。IgG通过与相应抗原发生特异性结合而发挥免疫效应,是构成机体体液免疫的主要物质。近年来,人们研究发现牛初乳IgG可以有效地预防、治疗婴幼儿腹泻,特别是轮状病毒腹泻。

但是现在市面上用于治疗腹泻的牛初乳制品均为牛初乳简单脱脂浓缩而成的牛初乳粉末(或颗粒),或者是经过特殊免疫(如轮状病毒免疫)后具有比较强的抗(轮状)病毒效果的制品,没有文献提到可以将IgG作为单一活性组分直接制备用于治疗腹泻的制剂。

此外,牛初乳免疫球蛋白G存在下述缺陷,使得将其用于工业生产制备治疗腹泻的制剂,也存在一定的困难:

1、牛初乳IgG的稳定性不好。如牛初乳IgG仅在60℃及以下的范围内能保持较好的稳定性,而在80℃及以上的温度条件下,短时间内便可完全失活;又如在pH 5.0~10.0范围内比较稳定,但是在胃酸和消化酶的作用下很容易被降解。

2、工业上难以获得高纯度的牛初乳IgG。目前采用直接冻干生产技术得到的牛初乳IgG的纯度一般在20%左右;采用多步盐析法提纯得到的纯度一般也不超过40%。尽管实验室中可以采取亲和层析方法提取高纯度的牛初乳IgG,但是因为提取时间长、能耗高,使得提纯成本很高,因而不适用于工业大规模提纯生产。目前市面上牛初乳IgG制品中,IgG的纯度较低,通常应用于食品和保健品行业,无法用于生产药物制剂。



技术实现要素:

针对上述现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白G制剂及其制备方法,该制剂不受胃酸和消化酶分解,尤其适用于治疗轮状病毒引起的腹泻。该制备方法工艺简单,成本低,适于大规模生产。

为实现上述目的,本发明所采用的解决方案是:

一种用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白G制剂,其特征在于,按重量百分比,其组分主要为:

牛初乳IgG 5%-30%,

缓冲剂 1.0%-8%,

保护剂 65%-90%;

其中,所述牛初乳IgG的纯度为90%或以上。

按上述方案,优选地,所述组分中,牛初乳IgG的含量为20%。

按上述方案,优选地,所述缓冲剂为柠檬酸钠。

按上述方案,优选地,所述保护剂是由蔗糖、麦芽糖、甘氨酸、半乳糖、麦芽糊精和阿拉伯胶配制而成的组合物。

按上述方案,优选地,所述蔗糖、麦芽糖、甘氨酸、半乳糖、麦芽糊精和阿拉伯胶的重量比为2:1:1:0.5:0.5:0.6。

按上述方案,优选地,所述用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白G制剂的剂型为微胶囊粉末。

本发明还提供了上述用于治疗腹泻的牛初乳免疫球蛋白G制剂的制备方法,其特征在于,包括下述步骤:

1、提纯得到高纯度(90%或以上)IgG溶液后,加入缓冲剂,用碱液调节溶液pH值至中性后,在40℃下真空浓缩至溶液原体积的30%-50%,得到浓缩液;

2、向浓缩液中添加保护剂,干燥喷雾得到微胶囊粉末。

按上述方案,优选地,所述高纯度IgG溶液的制备方法如下:

1)将含有IgG的牛初乳粉末溶解于盐酸胍溶液中,水浴,离心,取中间液体调节ph到4.6,水浴,静置,离心,收集乳浊液中间的澄清液并调节ph至7.4,在冰上放置,用等体积的pbs稀释后,过滤,得到IgG溶液的粗提纯混合物;或者,

将含有IgG的牛初乳液体离心,取中间的液体部分水浴,再加入等体积的ph4.6的醋酸溶液,继续水浴;过滤,取过滤液离心,再收集中间的澄清液,调节ph至7.4,在冰上放置,用等体积的pbs稀释后,过滤,得到IgG溶液的粗提纯混合物;

2)采用亲和层析法对上述IgG溶液的粗提纯混合物提纯:分别用纯水、氢氧化钠和蒸馏水清洗预装柱,再用ph7.4的pbs溶液充分平衡柱子;以1ml/min的上样速度加入IgG溶液的粗提纯混合物,收集所有流穿;再用平衡液冲洗柱子,打开akta层析系统,前处理系统,保持整个流量是pbs溶液后,再用柠檬酸洗脱,收集洗脱峰,得高纯度IgG溶液。

相比于现有技术,本发明的有益效果在于:

1、本案申请人在研究牛初乳的抗病毒作用机理时,验证了抗病毒(尤其是轮状病毒)的主要活性成分在于牛初乳IgG,因而首次提出将纯度高达90%以上的牛初乳IgG作为单一活性成分配制用于治疗腹泻的制剂。

2、本发明提供的制剂配方中,选择的是低含量高纯度的IgG,大大降低了产品的生产成本。根据药效筛选实验结果,当所述配方中高纯度IgG的含量在20%(重量百分比)时,抗病毒效果以及成本情况最好。

3、本发明中高纯度的IgG采用亲和层析精提纯的方法获得,洗脱液收集后马上添加一定缓冲剂进行保护,并将上述缓冲剂保护的高纯度IgG洗脱液进行真空浓缩至原体积的40%-50%、经过保护剂的调配后,简单喷雾干燥后即可制成微胶囊粉末(即成品的牛初乳免疫球蛋白G制剂),克服了现有技术中,需对IgG溶液进行彻底浓缩和干燥、制得粉末的程序,节省了浓缩的能耗和时间,大大节省了生产成本,并解决了高纯度IgG粉末不易制备的问题。

4、本发明辅料同时选用缓冲剂和保护剂(其中保护剂将牛初乳IgG包裹),并将该牛初乳免疫球蛋白G制剂制备成微胶囊粉末状,既能最大化保证制得的牛初乳IgG制剂在运输和储藏中的稳定性,还能在口服给药后避免受到胃酸和消化酶分解的,克服了现有技术中高纯度IgG溶液不稳定的缺陷,可用于治疗腹泻。

附图说明

图1为效果实施例中正常MA104细胞(左图A)和被轮状病毒感染的MA104细胞(右图B)在显微镜下的放大图。

图2为效果实施例中A组乳鼠在2天后的小肠病理切片。

图3为效果实施例中B组乳鼠在2天后的小肠病理切片。

图4为效果实施例中C组乳鼠在2天后的小肠病理切片。

图5为效果实施例中E组乳鼠在2天后的小肠病理切片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明,但是此说明不构成对本发明的限制。

实施例1

(一)采用含有IgG的牛初乳粉末(市售获得)提纯得到高纯度的IgG溶液,具体步骤如下:

1、将含有IgG的20g牛初乳粉末,用浓度为2mol/L的盐酸胍溶液溶解,40℃水浴半小时后,于4000rmp离心30min,除去上层杂质和脂肪,取中间液体在室温下用盐酸调节ph到4.6,40℃水浴30min静置15min后于4000rmp离心30min,去掉沉淀,用吸管收集乳浊液中间的澄清液约150ml;将澄清液用tris碱调节ph至7.4,在冰上放置30min。用等体积约200ml的pbs稀释后,用0.45um过滤器过滤溶液,可得到IgG溶液的粗提纯混合物。

2、采用亲和层析法对上述IgG溶液的粗提纯混合物提纯:

先用纯水冲洗柱子5-10个体积,再用0.1mol/L氢氧化钠2-3个体积冲洗预装柱,再用10倍体积的蒸馏水清洗。配制20mmol/LPBS溶液,ph7.4,充分平衡柱子。用蠕动泵以1ml/min的上样速度加入IgG溶液的粗提纯混合物,收集所有流穿。再用平衡液冲洗柱子至少20min。打开akta层析系统,前处理系统,保持整个流量是pbs以后,再用1ml/min流速用柠檬酸洗脱,收集洗脱峰,得洗脱液。

对所收集到的洗脱液做sds-page电泳和NanoDrop 2000/2000c软件分析电泳图谱,确定洗脱液为150kd的免疫球蛋白lgG溶液,其中IgG的浓度为25mg/ml,纯度为100%。

(二)制备IgG复合微胶囊粉末,具体步骤如下:

1、收集上述洗脱液后,立刻取1000ml洗脱液(即浓度为25mg/ml的免疫球蛋白lgG溶液),添加5g柠檬酸钠,用少量0.1mol/L的NaOH调节溶液PH至中性,40℃真空浓缩至原体积的40%得到浓缩液。

2、将蔗糖40g、麦芽糖20g、甘氨酸20g、半乳糖10g、麦芽糊精10g和阿拉伯胶12g,简单混合,搅拌均匀即可,制备得到保护剂。

3、取100ml步骤1得到的浓缩液,加入18.5g的保护剂,用大豆油为油相,干燥喷雾处理,得到IgG复合微胶囊粉末。

实施例2

(一)采用含有IgG的牛初乳液体(市售获得)提纯得到高纯度的IgG溶液,具体步骤如下:

1、取含有IgG的50ml牛初乳液体,于4000rmp离心20min,去掉上面的胶体后,取中间的液体部分于40℃水浴半小时,再加入等体积的预先经过40℃水浴30min的ph4.6的醋酸溶液,继续40℃水浴15min。反应液用滤纸过滤,取过滤液在4000rmp离心20min,再用吸管收集乳浊液中间的澄清液约20ml,用tris碱调节ph至7.4,在冰上放置30min。再用等体积约30ml的磷酸盐缓冲液pbs稀释后,用0.45um过滤器过滤溶液,得到IgG溶液的粗提纯混合物。

2、采用亲和层析法对上述IgG溶液的粗提纯混合物提纯(方法同实施例1中所述),得到洗脱液。

对所收集到的洗脱液做sds-page电泳和NanoDrop 2000/2000c软件分析电泳图谱,确定洗脱液为150kd的免疫球蛋白lgG溶液,其IgG浓度约为15.99mg/ml,IgG纯度为93%。

(二)制备IgG复合微胶囊粉末,具体步骤如下:

1、收集上述洗脱液后,立刻取1000ml洗脱液(即浓度为15.99mg/ml的免疫球蛋白lgG溶液),添加约6g柠檬酸钠进行保护,少量0.1mol/L的NaOH调节溶液PH至中性,40℃真空浓缩至原体积的30%得到浓缩液。

2、制备保护剂,具体步骤同实施例1中所述。

3、取100ml步骤1得到的浓缩液,加入27g的保护剂,用大豆油为油相,干燥喷雾处理,得到IgG复合微胶囊粉末。

实施例3

(一)采用含有IgG的牛初乳液体(市售获得,与实施例2中牛初乳液体的供应商和批次不一致)提纯得到高纯度的IgG溶液,具体步骤同实施例2中所述。

对所收集到的洗脱液做sds-page电泳和NanoDrop 2000/2000c软件分析电泳图谱,确定洗脱液为150kd的免疫球蛋白lgG溶液,其IgG浓度约为30.25mg/ml,IgG纯度为96%。

(二)制备IgG复合微胶囊粉末,具体步骤如下:

1、收集上述洗脱液后,立刻取1000ml洗脱液(即浓度为30.25mg/ml的免疫球蛋白lgG溶液),添加8g柠檬酸钠进行保护,少量0.1mol/L的NaOH调节溶液PH至中性,40℃真空浓缩至原体积的50%得到浓缩液。

2、制备保护剂,具体步骤同实施例1中所述。

3、取100ml步骤1得到的浓缩液,加入13.9g的保护剂,用大豆油为油相,干燥喷雾处理,得到IgG复合微胶囊粉末。

效果实施例

进行IgG抗轮状病毒药效筛查试验,以人初乳和利巴韦林作为对比例,测定实施例1制得的IgG复合微胶囊粉末在抗轮状病毒上的效果。具体方法如下:

1.材料

1.1 轮状病毒和细胞株

1.1.1 轮状病毒(RV):非唾液酸(SA)依赖的人源轮状病毒WA株

1.1.2.细胞:MA-104猴肾细胞株

1.2 动物出生后7天的ICR乳鼠

1.3 实验试剂

2.方法

2.1 细胞培养:

MA104细胞在含10%胎牛血清,100μ/mL青霉素,100μg/mL链霉素的DMEM培养液中生长和传代。

2.2 病毒扩增:

细胞在培养瓶中生长至单层时接种RV。将原始病毒液从-80℃冰箱中取出,4℃溶解。将长成单层的MA104细胞用PBS冲洗2次。随后加入病毒液,放入37℃二氧化碳培养箱(含5%二氧化碳)中孵育2h后,弃去病毒液,加入无胎牛血清的DMEM培养液。然后放37℃二氧化碳培养箱(含5%二氧化碳)中培养并观察,至病毒感染MA104细胞病变(cytopathic effect,CPE)达到+++~++++时,将培养瓶放入-80℃冻存,再4℃融解,如此反复冻融3次,低温高速12000rpm,离心10min,取上清收获病毒液,再同上法重复1次病毒在细胞中传代实验,收获病毒。分装,-80℃保存。

2.3 病毒滴度测定:

用不含血清的DMEM培养液将其病毒按照1∶10稀释成10-1、10-2、10-3……10-10等系列浓度,将培养成单层MA104细胞的96孔板用PBS冲洗2次,再将不同稀释度的病毒加入到96孔细胞培养板中。设置正常对照细胞。37℃5%CO2孵育2h后吸出病毒液,加入不含血清的细胞培养液,200μL/孔。37℃5%CO2孵育,连续观察。当能够出现细胞病变CPE的最低稀释度的病毒孔中不再继续出现CPE时,计数每个稀释度出现CPE的细胞孔数,按照Reed-Munch方法计算病毒的TCID50(Tissue cultureinfective dose)。

2.4 模型制备

所有乳鼠在实验前行粪便轮状病毒抗原检测(胶体金法),均为阴性。

将乳鼠随机分为ABCDE共5组,每组各9只乳鼠。用1ml改良注射器(注射器针头用软管代替,市售可得),分别一次性经口腔给A组中每只乳鼠灌入0.2ml细胞培养液,给BCDE四组中每只乳鼠灌入0.2ml含轮状病毒(100TCID50)的培养液。所有乳鼠在灌胃前后均禁奶2小时,以保证病毒或细胞培养液充分吸收。24h后,给CDE组中的乳鼠分别灌服实施例1制得的IgG复合微胶囊、人初乳和利巴韦林灌服,连续灌服5天。此外,5组中所有小白鼠每天分别给予0.1ml生理盐水灌胃。详见表1。

各组动物隔离饲养观察。

表1

2.5 乳鼠观察

病毒攻击后,每天观察记录各组动物的临床表现:精神状况,脱水情况,肛门红肿等现象。给予乳鼠腹部按摩,观察其排出的粪便,记录腹泻只数。腹泻严重程度按大便形状评分而定,评分方法:没有收集到大便不计分,正常大便1分;淡黄色软便2分;淡黄色稀便3分;水样便4分。≥2分视为腹泻,分值越高则腹泻越重。每天每只乳鼠定时检查大便1次,记录实验组和A组每日乳鼠大便得分,每组总分数除以该组所收集到的大便份数,所得的值代表该组乳鼠当天平均腹泻严重程度。同时记录每日体重增长情况,并收集动物每天的大便作轮状病毒抗原检测。

2.5.1 用采便勺将收集于EP管中的粪便取出,放入装有样本稀释液的滴管中,旋紧滴管。

2.5.2 震荡混匀,折断滴管上的盖帽。

2.5.3 将测试卡平放在干燥平面上,垂直缓慢滴下2-3滴混匀后的样本,至测试卡加样端中心。

2.5.4 5-10分钟内判断结果:若出现两条红线即为阳性,一条红线即为阴性。

2.6 轮状病毒抗原检测

2.7 粪便中病毒滴度测定

将各实验组粪便加入PBS中,制成10%悬液,低温4000rpm离心10min,取上清,0.45um过滤后,再经0.22um过滤除菌备用。用2%DMEM将粪便悬液进行10倍递减稀释,浓度依次为10-1,10-2,10-3......10-10,按序接种于长满细胞的96孔培养板中,每孔100μL,每个稀释度6孔,同时设正常细胞A组和空白对照。置于37℃5%CO2细胞培养箱中孵育2h,吸弃病毒液,随即每孔加入2%DMEM细胞维持液200μL,置细胞培养箱中培养,连续观察,直至出现细胞病变最低稀释度的病毒孔不再继续出现CPE时,计算每个稀释度出现CPE的细胞孔数,按照Reed-Munch法计算病毒的TCID50

2.8 Real-time PCR检测小肠的病毒载量

2.8.1 用TRIZOL法提取小肠中病毒的RNA。

2.8.2 用TAKARA试剂盒进行逆转录及Real-time PCR,严格按照说明书进行操作。

3 结果

3.1 轮状病毒细胞增值培养

轮状病毒WA毒株在感染MA104细胞后可在细胞内增殖,接种24h后可观察到少量的细胞病变,此后,随着病毒的复制和扩增,病变的细胞量会不断增多,被感染的细胞贴壁能力会变弱,出现大量圆缩、悬浮、变形乃至破裂的情况(见图1)。

3.2 病毒接种后24h内乳鼠反应

BCDE实验组乳鼠均出现不同程度的腹泻,且活动减少,皮毛光泽差,哺乳情况尚可,有的乳鼠可见腹胀,肛周有大便污染痕迹;A组乳鼠较接种前无改变,肛门正常无大便污染痕迹。

3.3 乳鼠一般情况观察

A组:乳鼠精神反应佳,活力充沛,皮肤红润有弹性,肛门无红肿,粪便性状正常。

B组:乳鼠接种病毒后出现临床症状,表现为精神反应差,腹部膨胀。逐渐出现腹泻,在第3天乳鼠腹泻达到高峰,此后症状逐渐减轻。至第5天腹泻情况消失。出现稀便的乳鼠肛门红肿,尾部有粪便粘附,皮肤干燥褶皱增多。

C组:与B组相比,乳鼠精神反应好转,腹部膨胀稍有缓解。在给药后第1天腹泻程度较B组明显降低(P<0.05),给药后第2至5天均未出现腹泻。

D组:接种病毒后,出现腹泻,肛周红肿且有粪便粘附。给药后第1-3天较B组相比腹泻稍轻,至第4天与B组相比腹泻明显好转,于第5天腹泻消失。

E组:接种病毒后,出现腹泻,给药后第1-3天较B组相比腹泻轻,为黄色软便。于第5天腹泻消失。

3.4 乳鼠体重动态变化

RV感染后0-5天乳鼠体重变化如表1所示,B组在感染第3天,乳鼠体重较A组明显降低(P<0.05),在观察时间内乳鼠体重较正常A组一直处于低水平状态。C组在RV感染的5天内,体重较B组有明显升高(P<0.05)。在观察期内,BCDE各实验组乳鼠体重与正常A组相比,虽然体重增长有一定程度落后,但统计分析(SPSS17.0,t-test)表明,各时间点实验组和正常A组体重差别无统计学意义(P>0.05)。RV感染后各组乳鼠体重变化情况如表2所示。

表2RV感染后各组乳鼠体重变化情况

3.5 乳鼠腹泻情况

接种RV后乳鼠腹泻潜伏期为0-1天,持续时间为1-5天。按大便形状对腹泻严重程度进行评分,评分方法为:没有收集到大便不计分,正常大便1分;淡黄色软便2分;淡黄色稀便3分;水样便4分。≥2分视为腹泻,分值越高则腹泻越重。每天每只乳鼠定时检查大便1次,记录各组每日乳鼠大便得分,每组总分数除以该组所收集到的大便份数,所得的值代表该组乳鼠当天平均腹泻严重程度。各组乳鼠平均腹泻程度评分结果如表3所示,可知,在观察期内正常A组所有乳鼠均无腹泻表现,C组乳鼠与E组乳鼠情况相似,在给药后的第2-5天均未出现腹泻情况。

表3乳鼠平均腹泻程度评分

3.6 乳鼠粪便轮状病毒抗原检测

接种病毒前所有乳鼠粪便RV抗原检测均为阴性。治疗后第1天,取乳鼠粪便进行RV抗原检测。B组在第1天持续至第5天都可检测到RV抗原。D组在给药第2天到第4天内可以检测到RV抗原弱阳性,第5天开始RV抗原检测转为阴性。E组在给药第1天到第5天RV抗原检测一直为阴性。C组在灌服实施例1制得的IgG复合微胶囊粉末后第1天到第5天RV抗原检测均为阴性。

3.7 粪便中病毒滴度

各组粪便中病毒滴度结果如表4,C组、E组的病毒滴度降低,且均明显低于B组(P<0.05);而低剂量组病毒滴度均高于B组,且没有统计学差异(P>0.05)。

表4各组病毒滴度

注:*与B组比较P<0.05

3.8 Real-time PCR检测小肠的病毒载量

取各实验组感染病毒后3天和7天的小肠组织进行Real-time PCR,检测小肠组织中的病毒RNA载量,如表5。E组、C组在3DPI、7DPI可以不同程度的下调病毒RNA,且与B组相比均有统计学差异(P<0.05);D组在3DPI和7DPI不同程度降低病毒RAN载量,但在3DPI与B组有统计学差异(P<0.05)在7DPI与B组无明显差异(P>0.05)。

表5IgG对乳鼠小肠组织病毒载量的影响

注:P值为与B组比较

3.9 乳鼠小肠病理检测

2天后的病理切片显示,A组的小肠粘膜层较厚,绒毛密集。B组的小肠肌层变薄,粘膜肿胀、充血,大量淋巴细胞浸润,小肠绒毛脂肪变性稀疏,肠腔上皮细胞完整性破坏;C组的小肠粘膜无明显肿胀、充血,粘膜下少量淋巴细胞浸润,绒毛清楚,与A组相似。

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