miR‑29及其抑制剂在制备抗器官移植排斥药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是miR-29的新的医药用途，具体包括miR-29及其抑制剂在制备抗器官移植排斥药物中的应用。

背景技术：

器官移植是治疗终末期疾病的最为有效的临床手段。随着CsA、FK等新型免疫抑制剂的临床应用，有效地降低了急性排斥反应的发生，显著延长了器官移植物的存活期，挽救了众多器官终末期患者的生命。但是，器官移植后的排斥反应仍然是影响移植物长期存活的主要障碍，特别是以移植物纤维化和血管内膜增生病变为病理表现的慢性排斥，已成为移植物远期失功最重要的原因。现有的免疫抑制剂虽能有效控制急性排斥反应的发生率，显著延长移植物的存活时间，但仍然不能解决移植物长期存活的问题，提示移植排斥免疫应答和调控机制的复杂以及现有的抗排斥方法有待于进一步提高和完善；因此，进一步研究移植后免疫细胞活化与耐受调控的新机制、提高治疗排斥反应的效果一直是移植免疫学研究急待解决的热点问题。近年来，有关免疫细胞的活化调控新机制，包括基因选择性表达调控的DNA甲基化、组蛋白修饰以及基因转录后MicroRNA(miRNA)的调控研究，从转录、转录后表观调控等多种层面实现对免疫细胞活化以及基因表达的精细调控，不但揭示免疫细胞调控机制的复杂性及精确性，也为更精确、更有效地防治排斥反应提供了方向和切入点。

microRNA(miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码小片段RNA，其进化保守，通过与mRNA(messenger RNA)的3’非翻译区(3’untranslational region，3’UTR)相互作用从而调控mRNA的翻译，进而广泛作用于发育、肿瘤、炎症、移植排斥等各个生物学过程。miRNA-255等已经被证实在急性排斥中发挥了重要作用。microRNA与排斥反应的关系必将随着研究的深入而逐渐显现。miR-29的研究目前主要集中于肿瘤、炎症、自身免疫病等方面。尚未有其与实体器官移植排斥、抗病毒等方面的报导。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供miR-29的新的医药用途，具体包括miR-29及其抑制剂在制备抗器官移植排斥药物中的应用。

本发明的第一方面，提供miR-29在制备抗器官移植排斥药物中的应用。

所述的miR-29的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。由于mir-29b-1和mir-29b-2成熟体结构相似，所以一般认为miR-29家族具有三个主要成员：mir-29a、mir-29b、mir-29c，其序列分别如核苷酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

miR-29a：5’-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’，SEQ ID NO.1；

miR-29b：5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’，SEQ ID NO.2；

miR-29c：5’-UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA-3’，SEQ ID NO.3；

所述的抗器官移植排斥药物抑制特异性干扰miR-29基因表达或加工。

本发明的第二方面，提供miR-29抑制剂在制备抗器官移植排斥药物中的应用。

优选的，所述的miR-29抑制剂包括但不限于：特异性结合miR-29的蛋白，特异性干扰miR-29基因表达、加工的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等。

更优选的，所述的miR-29抑制剂选自特异性干扰miR-29基因表达的小干扰RNA分子或反义核苷酸。

在本发明的一个优选实施例中，所述的miR-29抑制剂为anatogmiR-29。Antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，能够竞争性地结合体内成熟miRNA，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，从而抑制miRNA发挥作用。Antagomir技术最早于2005年发表于《Nature》上(Krützfeldt J,Rajewsky N,Braich R,et al.Silencing of microRNAs in vivo with‘antagomirs’[J].Nature,2005,438(7068):685-689.)。其主要步骤包括：1)根据目的microRNA的序列合成寡核苷酸单链；2)3’端进行胆固醇标记；3)5’端两个硫代硫酸位点修饰，3’端四个硫代硫酸位点修饰；4)全链2’-甲基化修饰。本发明所用antagomiR-29基于上述已经公开报道的技术设计而成，所用序列为5’-u_sa_saccgauuucagauggug_sc_su_sa_s-Chol-3’，交由广州锐博生物科技有限公司合成。

所述的miR-29抑制剂antagomiR-29能够显著影响B细胞发育、诱导B细胞凋亡，减少外周B细胞数量和比例，最终抑制同种异基因器官移植后抗体介导的免疫排斥反应。

所述的miR-29抑制剂antagomiR-29能够显著抑制同种异基因器官移植后T细胞介导的急性排斥反应。

本发明的第三方面，提供一种抗器官移植排斥的药物组合物，所述的抗器官移植排斥的药物组合物是以miR-29抑制剂为唯一活性成份，或者是含有miR-29抑制剂的药物组合物。

所述的药物组合物含有有效量的所述的miR-29抑制剂，以及药学上可接受的载体。

所述的“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

所述的“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于：口服、静脉内注射、皮下注射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、心脏内给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

本发明优点在于：

本发明提供了miR-29的新的医药用途，包括两方面：1、miR-29的抑制剂能够显著抑制同种异基因器官移植后T细胞介导的急性排斥反应。2、miR-29的抑制剂能够显著影响B细胞发育、诱导B细胞凋亡，减少外周B细胞数量和比例，从而有效抑制同种异基因器官移植后抗体介导的免疫排斥反应。本发明为同种异体移植后的排斥反应特别是抗体介导的急慢性排斥反应的治疗提供了新的防治手段。

附图说明

图1.antagomiR-29对急性排斥反应、生存时间、肿胀程度的影响；其中A、B：与对照组相比，antagomiR-29干预后，能够明显减轻移植心脏、脾脏、胸腺以及淋巴结的肿胀程度；C：antagomiR-29亦能显著抑制急性排斥反应，延长移植物生存时间。

图2.antagomiR-29对移植物中免疫细胞浸润的影响；A：antagomiR-29干预后，移植物中免疫细胞浸润明显减少，C、D：与对照组相比，antagomiR-29干预后，移植心脏中CD4⁺以及CD8⁺T的浸润显著减少，B：tunel表达增多。

图3.antagomiR-29对淋巴结和脾脏中T、B细胞的影响；A、C：与对照组相比，antagomiR-29干预后，淋巴结和脾脏中B细胞比例明显减少；T细胞比例上升；CD4⁺T比例明显减少，CD8⁺T细胞比例明显上升；B、D：就细胞总量来说，与对照组相比，antagomiR-29干预后，淋巴结(图3B)以及脾脏(图3D)中，无论是T细胞还是B细胞；无论是CD4⁺T细胞还是CD8⁺T细胞均明显低于对照组。

图4.antagomiR-29显著抑制抗体介导的排斥反应；A：过继回输致敏B细胞给BALB/c--C57BL/6-Rag2^-/-小鼠心脏移植小鼠，观察移植物生存期，发现antagomiR-29治疗后，生存期明显延长；B：运用了LV-sponge 29感染脾脏来源的原代B细胞，同时在体外以10mg/ml羊抗小鼠IgM刺激培养72小时，流式检测B细胞分泌IgG能力，发现敲低miR-29后，IgG明显减少。

图5.sponge技术内源性抑制miR-29表达后能够显著影响B细胞发育，减少外周B细胞数量和比例；A、B、C：流式分析发现GS小鼠骨髓中B细胞的Immature B细胞(B220⁺AA4.1⁺IgM⁺)比例明显下降；Circulated B细胞(B220+AA4.1^-IgM⁺)比例下调；Pro-B细胞(B220⁺CD43⁺IgM^-)比例明显上升，Pre-B细胞(B220⁺CD43^-IgM^-)比例明显下调，表明B细胞发育成熟受到明显抑制；D：流式检测GS29小鼠腹腔中B1细胞亚群(B220^loCD5^lo)，发现GS29小鼠明显高于对照组)；E：检测GS29小鼠脾脏中B1细胞的比例，发现GS29小鼠中滤泡B细胞(B220⁺CD21^-CD23⁺)比例低于对照组；边沿区B细胞(B220⁺CD21⁺CD23^-)比例两组间无明显差异；F：无论是否刺激，GS29小鼠来源的成熟B细胞凋亡比例均高于对照组；G：western blot检测了脾脏CD43⁺B细胞中pten蛋白水平，发现，GS29组中pten水明显低于对照组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应强调的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：antagomiR-29明显抑制器官移植后的急性排斥反应

实验方法：

1、异基因小鼠颈部异位心脏移植模型的建立

采用改良的Cuff技术进行小鼠颈部异位心脏移植，即选用C57BL/6小鼠作为受体，BALB/c小鼠作为供体，将供心升主动脉与受体小鼠颈总动脉套管、环扎固定；供心肺动脉与受体小鼠颈外静脉套管、环扎固定。术后，目测以及触摸移植心脏，以均无跳动迹象视作移植心脏已经排斥。48小时内停跳或者受体小鼠死亡，视作模型失败。

2、实验分组

实验分为两组，每组10只。对照组：异位心脏移植模型建立后，第二日尾静脉注射antagomiR-NC 100nmol。实验组：异位心脏移植模型建立后第二日腹腔尾静脉注射antagomiR-29 100nmol。

3、小鼠生存期观察

各组选取5只小鼠进行观察，目测以及触摸移植心脏，以均无跳动迹象视作移植心脏已经排斥。

4、观察antagomiR-29治疗对移植物以及受体免疫器官的影响

于移植第5日，处死小鼠，取移植心脏、胸腺、淋巴结、脾脏，进行大体测量。

5、移植心脏炎性细胞浸润情况检测

于移植第5日，处死小鼠，取移植心脏，4％多聚甲醛固定6h，而后20％蔗糖溶液中4℃过夜。蜡块包埋，切片，贴片于防脱玻片上。0.01MPBS溶液清洗三次，每次5min。加0.3％的过氧化氢甲醇溶液(甲醇80ml+0.01MKPBS100ml+30％过氧化氢)30分钟，0.01MPBS溶液，清洗三次，每次5min。加0.3％Triton X100(30％Triton X100+0.01MKPBS 100ml)30min，0.01MPBS 溶液清洗三次，每次5min。加入用血清稀释液(牛血清白蛋白1.00g+0.01MPBS100ml+叠氮纳0.08g)稀释的一抗，4℃存放24小时；吸去抗体，0.01MPBS溶液清洗三次，每次5min。加入0.01MKPBS稀释的的二抗，室温孵育2h，0.01MPBS溶液清洗三次，每次5min。加显色液，孵育30min，吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次，加入0.01MKPBS终止反应。梯度酒精脱水，而后封片、拍照。

6、检测受体小鼠免疫器官中免疫细胞亚群变化

于移植第5日，处死小鼠，取胸腺、淋巴结、脾脏，匀浆后Tris-NH4CL破红10min；分管，加入流式抗体，避光、室温孵育30min，PBS溶液洗涤2次，流式缓冲液重悬，上样。

7、结果

antagomiR-29明显抑制器官移植后的急性排斥反应，与对照组生存期(5-7d)相比，antagomiR-29实验组生存期能够显著延长到14天以上(图1C)。移植第5天时，观察移植物移植心脏、胸腺、淋巴结、脾脏，发现antagomiR-29能够显著减轻制移植物水肿程度，减轻胸腺、淋巴结以及脾脏的肿大(图1A、B)。对于移植心脏HE染色分析显示，与对照组相比，antagomiR-29能够显著抑制炎性细胞浸润，减轻心肌损伤。进一步组化检测发现，对移植心脏进行HE染色，与对照组相比，antagomiR-29干预后，移植物中免疫细胞浸润明显减少(图2A)，移植心脏中CD4⁺以及CD8⁺T的浸润显著减少(图2C、D)，tunel表达增多(图2B)。进一步流式分析淋巴结和脾脏中T、B细胞比例，发现，与对照组相比，antagomiR-29干预后，淋巴结和脾脏中B细胞比例明显减少；T细胞比例上升；CD4⁺T比例明显减少，CD8⁺T细胞比例明显上升(图3A、C)。但是，就细胞总量来说，与对照组相比，antagomiR-29干预后，淋巴结(图3B)以及脾脏(图3D)中，无论是T细胞还是B细胞；无论是CD4⁺T细胞还是CD8⁺T细胞均明显低于对照组。

实施例2：antagomiR-29显著抑制抗体介导的排斥反应(AMR)

总结前期实验，我们发现antagomiR-29可以有效发挥抗移植排斥作用，延长移植物生存时间。其可能的机制有：1、antagomiR-29可能通过诱导免疫细胞凋亡，抑制免疫细胞增殖来有效抑制移植心脏中免疫细胞的浸润；2、antagomiR-29可能通过调控B细胞来参与了抗体介导的免疫排斥反应(AMR，antibody mediated rejection)。基于目前慢性排斥已经成为远期移植物失功能最重要的原因的缘故，我们先将目光关注于B细胞。首先我们过继回输致敏B细胞给BALB/c--C57BL/6-Rag2^-/-小鼠心脏移植小鼠，观察移植物生存期。

实验方法：

1、异基因小鼠颈部异位心脏移植模型的建立

采用改良的Cuff技术进行小鼠颈部异位心脏移植，即选用C57BL/6小鼠作为受体，BALB/c小鼠作为供体，将供心升主动脉与受体小鼠颈总动脉套管、环扎固定；供心肺动脉与受体小鼠颈外静脉套管、环扎固定。术后，目测以及触摸移植心脏，以均无跳动迹象视作移植心脏已经排斥。48小时内停跳或者受体小鼠死亡，视作模型失败。

2、过继回输模型的建立

将移植第七天的异基因小鼠颈部异位心脏移植小鼠处死，体外CD19磁珠分选脾脏B细胞。以BALB/c小鼠作为供体，以C57BL/6-Rag2^-/-小鼠作为受体，采用改良的Cuff技术进行小鼠颈部异位心脏移植。移植后第四天，将分选好的致敏B细胞(1x10⁷/只)经尾静脉回输受体小鼠。

3、实验分组

实验分为两组，每组5只。对照组：过继回输模型建立后同日尾静脉注射antagomiR-NC 100nmol。实验组：过继回输模型建立后同日尾静脉注射antagomiR-29 100nmol。

4、小鼠生存期观察

各组选取5只小鼠进行观察，目测以及触摸移植心脏，以均无跳动迹象视作移植心脏已经排斥。

5、antagomiR-29对B细胞分泌IgG抗体能力的影响

体外CD19磁珠分选C57BL/6小鼠脾脏B细胞。利用慢病毒包被miR-29sponge质粒，感染B细胞，培养24小时，流式检测B细胞IgG表达量。

6、结果

Rag2^-/-小鼠体内T、B细胞功能缺陷，故而以此小鼠为受体建立异基因移植后，并不能诱导急慢性排斥反应。但是尾静脉回输致敏的B细胞后，能够重新诱导出体液排斥反应。我们的结果显示，第7-9天，B细胞回输后的受体小鼠移植心脏停跳。而以antagomiR-29治疗后，生存期明显提升至15天左右(图4A)。LV-sponge 29感染体外培养的脾脏B细胞后，与对照组相比，B细胞产生IgG的量明显减少(图4B)。

实施例3：sponge技术内源性抑制miR-29表达能够显著影响B细胞发育，减少外周B细胞数量和比例

实验方法：

1、miR-29Sponge(GS29)转基因小鼠的获得

交由南方模式生物公司构建miR-29Sponge(GS29)转基因小鼠。所获得杂合子小鼠与C57BL/6小鼠杂交10代以上。提取鼠尾总RNA，逆转，定量检测miR-29水平，CT值低于20视作转基因小鼠。

上游引物：5’-GAGCAAAGACCCCAACGAGAAG-3’，SEQ ID NO.4

下游引物：5’-TCTACA A ATGTGGTATGGCTGAT-3’，SEQ ID NO.5。

2、流式检测B细胞亚群

取GS29小鼠，以同窝野生鼠作为对照。处死小鼠后，剖开腹部皮肤，20ml注射器吸取10ml PBS溶液，腹膜内反复冲洗数次，所获得腹腔冲洗液3000转离心5min，弃上清，备用。取脾，200目钢网研磨，3000转离心5min，弃上清，备用。取双侧胫骨，1ml注射器吸取1ml PBS反复冲洗骨髓腔，直至胫骨泛白，反复吹打所获得骨髓溶液直至形成单细胞悬液，3000转离心5min，弃上清，备用。将上述所获得细胞悬液，Tris-NH₄CL室温破红10min，3000转离心5min；PBSE洗一遍后重悬，分管；标流式抗体；室温孵育30min，PBS洗二遍后重悬，上机检测。

3、实验结果

流式分析发现GS小鼠骨髓中B细胞的Immature B细胞(B220⁺AA4.1⁺IgM⁺)比例明显下降；Circulated B细胞(B220⁺AA4.1^-IgM⁺)比例下调；Pro-B细胞(B220⁺CD43⁺IgM^-)比例明显上升，Pre-B细胞(B220⁺CD43^-IgM^-)比例明显下调，表明B细胞发育成熟受到明显抑制(图5A，图5B，图5C)。流式检测GS29小鼠腹腔中B1细胞亚群(B220^locd5^lo)，发现GS29小鼠明显高于对照组(图5D)。与此相似地检测GS29小鼠脾脏中B1细胞的比例，发现GS29小鼠中滤泡B细胞(B220⁺CD21^-CD23⁺)比例低于对照组；边沿区B细胞(B220⁺CD21⁺CD23^-)比例两组间无明显差异(图5E)。

实施例4：miR-29靶向PTEN 3’UTR区域，抑制PTEN蛋白表达，诱导B细胞凋亡，最终发挥抗AMR作用

实验方法：

1、体外免疫磁珠分选脾脏CD43+B细胞

CD43是外周B细胞成熟的一个marker。取GS29小鼠，以同窝野生鼠作为对照。处死小鼠后，剖开腹腔，无菌取脾，200目钢网研磨，3000转离心5min，弃上清，Tris-NH₄CL室温破红10min，1500转离心5min；PBSE(含1％FBS)洗一遍后重悬，加入CD43(10微升)免疫磁珠4℃孵育15分钟，中间震荡一次。10ml PBSE洗一次，1500转离心10min，2ml PBSE重悬。将LS柱置于MACS分选器上，PBSE洗三次，而后将重悬的细胞悬液加入分选柱，冲洗PBSE洗涤两次，收集洗脱液，1500转离心10min。完全1640培养基重悬，铺12孔板。

2、B细胞凋亡检测

上一步所铺B细胞中，加入羊抗鼠IgM抗体(10微克/毫升)，孵育10小时。收集培养基，3000转离心5min，PBSE洗涤一遍，重悬，加入PI染料，孵育20min，PBSE洗涤一遍，重悬，上机。

3、Western blot检测PTEN蛋白表达

将第一步分选所得B细胞中加入细胞裂解液(含1％蛋白酶抑制剂)，4℃裂解10min，13000转离心10min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，调平各组溶液浓度；加入1/5体积蛋白Lording Buffer，沸水中煮样5min，迅速冷却。制备12％SDS聚丙烯酰胺凝胶，按每泳道10微升加入蛋白样本和蛋白marker，电泳分离蛋白。转膜系统将蛋白转移至硝酸纤维素薄膜上，置于含5％BSA的TBST溶液中封闭2h以上，TBST洗脱，两次，每次15分钟；加入1:1000稀释的一抗，4℃孵育过夜；TBST洗脱，三次，每次15分钟；加入辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时；TBST洗脱三次，每次15分钟；将Western Blotting发光检测试剂中的A液和B液按1:1混匀，室温置于硝酸纤维素薄膜上孵育5分钟，于凝胶成像分析仪上进行检测。

4、结果

磁珠分选脾脏CD43⁺B细胞，体外培养，羊抗小鼠IgM刺激10小时后检测凋亡情况，结果显示，无论是否刺激，GS29小鼠来源的成熟B细胞凋亡比例均高于对照组(图5F)。

在我们对miR-29靶点预测中，miR-29a能够靶向凋亡调控基因PTEN，故而，进一步，我们western blot检测了脾脏CD43⁺B细胞中PTEN蛋白水平，发现，GS29组中PTEN蛋白水明显低于对照组(图5G)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。