一种长循环的氧化石蒜碱有机酸复合物新制剂的制作方法

文档序号:11116063阅读:681来源:国知局
一种长循环的氧化石蒜碱有机酸复合物新制剂的制造方法与工艺
本发明涉及一种明显延长氧化石蒜碱体内循环时间和提高生物利用度的氧化石蒜碱有机酸复合物的脂质体制剂及其制备方法和应用,涉及医药
技术领域

背景技术
:氧化石蒜碱(Lycobetaine,缩写LBT),又名恩其明,是一种四级啡啶类生物碱,主要从石蒜科植物中提取得到。氧化石蒜碱醋酸盐(石蒜内铵)是一种抗肿瘤物质,化学名为2-羟基-9,1-次甲乙氧基-4,5-二氢-吡啶并[3,2,1-de]菲啶醋酸盐,其结构如下:式1:氧化石蒜碱醋酸盐的结构氧化石蒜碱作为选择性拓扑异构酶IIβ抑制剂(BarthelmesHU,NiederbergerE,RothT,etal.LycobetaineactsasaselectivetopoisomeraseIIbetapoisonandinhibitsthegrowthofhumantumourcells.BritJCancer.2001;85(10):1585-1591.),其抑瘤的活性基团是结构中亚甲二氧基和内铵盐的部分(翁尊尧,王肇瀛,严晓明.新抗肿瘤物质——恩其明(ungeremine,AT-1840)及其有关化合物的合成和构效关系.药学学报,1982,17(10):744-749)。研究表明在多种肿瘤模型中,氧化石蒜碱醋酸盐对肿瘤生长与生存表现出较好的抑制作用,对胃癌和卵巢癌有明显的抑制效果。此外,氧化石蒜碱在与其他抗肿瘤药物联用,以及放射疗法联用治疗过程中,并没有观察到化疗中常见的骨髓抑制、肠道反应等毒副作用(吴云林,吴裕圻,余春仙等.石蒜碱内铵盐和细小病毒H-1对胃癌细胞杀伤作用的实验研究.上海医学,1988,11(12):683-688.)。氧化石蒜碱也在临床上进行了抗肿瘤研究,并没有发现明显的毒性(胡庆和,林兆翔,何萍等.石蒜内铵(AT-1840)综合治疗妇科晚期恶性肿瘤——附43例总结.浙江中西医结合杂志,1997,7(3):134-136)。然而近几年氧化石蒜碱并没有在临床上推广使用,其主要原因是水溶液制剂生物利用度极低,体内半衰期极短,需要多次大剂量给药以维持药效,无疑给患者增加了负担。此外氧化石蒜碱属于水微溶性药物,不适宜现有的纳米粒、脂质体和纳米乳等大部分载体,极大地限制了氧化石蒜碱在临床中的使用。因此,开发一类新制剂以提高氧化石蒜碱生物利用度,达到更好的抗肿瘤效果,可以为临床治疗提供一个更好的选择。专利201210252981.X和文献(ZhaoH,LuH,GongT,ZhangZR.Nanoemulsionloadedwithlycobetaine-oleicacidioniccomplex:physicochemicalcharacteristics,invitro,invivoevaluation,andantitumoractivity.Int.J.Nanomed.2013;8:1959-1973.)提供了一种氧化石蒜碱油酸复合物纳米粒制剂,该制剂采用油酸和氧化石蒜碱形成离子对复合物,从而增加药物的脂溶性。再将复合物载入纳米粒中,延长了药物体内循环时间,提高了药物的生物利用度,并显著增加了氧化石蒜碱的抗癌活性。不过此制剂也只能延长氧化石蒜碱在体内循环时间到10小时左右,大鼠体内药动学实验表明,10小时左右血浆中氧化石蒜碱浓度下降到一个很低的水平。这一结果提示我们,延长氧化石蒜碱的体内循环时间应该是提高其疗效的可行方法。综上所述,一种能更好延长氧化石蒜碱体内循环时间,提高药物生物利用度的新制剂是需要的。此新制剂的研发将有助于减轻患者的负担,为社会创造更多的价值。技术实现要素:本发明的目的之一,提供一种新型的氧化石蒜碱有机酸离子对的脂质体制剂。本发明的目的之一,提供一种长循环的氧化石蒜碱有机酸离子对的脂质体制剂。相较于专利201210252981.X中氧化石蒜碱油酸离子对纳米粒,有着更明显的缓释效果。本发明的目的之一,提供一种长循环的,能明显提高氧化石蒜碱生物利用度,减少给药频率,延长给药间隔,利于临床使用的脂质体。发明人在实验研究中,意外地发现,将氧化石蒜碱有机酸离子对制备成脂质体,其在体内的循环时间显著长于已有的纳米制剂。实验结果表明,将氧化石蒜碱亲脂化处理后,才能制备较高包封率、粒径均匀、稳定性良好的氧化石蒜碱脂质体制剂。本发明将制备出较高脂溶性的氧化石蒜碱有机酸复合物,采用适当的有机溶剂将其与磷脂及其他表面活性剂等溶解作为油相,水作为水相,旋转蒸发除去有机溶剂后,用水水化薄膜得混悬液,高压均质制成脂质体,即得可以静脉注射的脂质体制剂。本发明人研究发现,载氧化石蒜碱的脂质体比载氧化石蒜碱纳米粒制剂有着更小的粒径、更高的包封率。此外,载药的脂质体还有着更慢的释药特性,更长的循环时间,以及更高的生物利用度的特点,表现出载药脂质体的明显优势。本发明提供的脂质体粒径在约10-500nm,优选在50-300nm。本发明的目的之一是提供了一种氧化石蒜碱有机酸复合物的脂质体,主要由氧化石蒜碱和有机酸形成的复合物、表面活性剂制成,其中氧化石蒜碱、有机酸、表面活性剂的重量份为氧化石蒜碱1份,有机酸1~10份,表面活性剂2~20份;优选地,氧化石蒜碱1份,有机酸1~5份,表面活性剂5~18份。本发明所述的有机酸是八个碳原子以上的有机酸类。本发明所述的有机酸选自中长链脂肪酸包括油酸、亚油酸、亚麻酸、硬脂酸、软脂酸、反式维甲酸、辛酸中的一种或多种的混合物,优选油酸;也可以选自胆酸类有机酸包括胆酸、脱氧胆酸、熊去氧胆酸、牛去氧胆酸、鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、熊去氧胆酸、奥贝胆酸、甘氨胆酸、牛黄胆酸、石胆酸中的一种或多种的混合物。若有机酸为不溶于水的固体,可以加入含有机酸的有机溶剂溶液,所述有机溶剂自乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-2-甲基甲酰胺中的一种或者多种混合物,优选乙醇;所述有机溶剂为适量添加。本发明优选油酸作为氧化石蒜碱有机酸复合物的成分。油酸(oleicacid)学名为顺-9-十八烯酸,是一种不饱和脂肪酸。本发明所述的氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体制剂制备过程中加入适量的表面活性剂,选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二棕榈酰基卵磷脂、二油酰基卵磷脂、棕榈酰溶血卵磷脂、肉豆蔻酰溶血卵磷脂、硬脂酰溶血卵磷脂、二肉豆蔻酰基卵磷脂、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂、二芥酰基卵磷脂、双鲸蜡磷脂酰、硬脂磷脂酰、磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰胆碱、二硬脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、二肉豆蔻磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、二芥酰基磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰基乙醇胺、二油酰磷脂酰基乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、胆固醇、胆固醇硫酸钠盐、磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰甘油、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油、1,2-棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、PEG化磷脂、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-叠氮聚乙二醇、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇等类似化合物的一种或者多种混合物;优选大豆卵磷脂和胆固醇混合物,两者含量配比优选为1:1~5:1,更优选为2:1;或优选大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000混合物,三者含量配比优选为2:1:1~2:1:0.1,更优选为2:1:0.27。当表面活性剂选自大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000混合物时,本发明得到PEG化的氧化石蒜碱有机酸复合物的脂质体。本发明的目的之一是提供了一种氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体的制备方法,其特性包括下述步骤:(1)取氧化石蒜碱的药学上可接受的盐溶于水中,先用碱性物质中和其对应的酸之后;再加入有机酸混合,形成氧化石蒜碱有机酸复合物;其中,若有机酸为不溶于水的固体,可以加入含有机酸的有机溶剂;(2)冷冻干燥步骤(1)得到氧化石蒜碱有机酸复合物,再加入适当的有机溶剂溶解上述复合物,得溶液;(3)根据表面活性剂的溶解特性,用水或者有机溶剂溶解,得溶液;(4)将溶液和溶液混合均匀,减压蒸发除去有机溶剂;(5)再将其与水相混合后,薄膜水化得混悬液;(6)将步骤(5)中所述的混悬液均化制得氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体。其中,步骤(1)中的碱性物质主要是用于中和氧化石蒜碱的药学上可接受盐中的酸根,获得药物分子形式游离碱。本发明所述的氧化石蒜碱主要是由氧化石蒜碱的药学上可接受的盐进行脱盐反应而得,例如,氧化石蒜碱醋酸盐与碱性物质反应而得。所述碱性物质选自氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、枸橼酸钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、枸橼酸钠、三乙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、氨水,或是两种或多种碱性物质的混合物。步骤(1)所述碱性物质优选碳酸氢钠,其加入量是本领域的常规选择。优选碱性物质中和对应的酸的时间为5分钟。优选的有机酸为油酸。优选油酸与氧化石蒜碱混合时间为30分钟。步骤(2)中的有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、四氢呋喃、乙腈、丙酮、乙醚、正己烷、正庚烷、脂肪烃、芳香烃、卤代烃及其混合物,以及2种或2种以上这些溶剂的混合物或类似溶剂,优选二氯甲烷。步骤(3)中若表面活性剂溶于水中,则在步骤(4)中不需要将溶液进行旋蒸,将溶液作为步骤(5)中的水相进行混合。步骤(3)所述的表面活性剂优选大豆卵磷脂S100和胆固醇的混合物,或大豆卵磷脂、胆固醇和DSPE-PEG2000混合物。此外,有机溶剂于减压下蒸发。蒸发方法包括使用旋转蒸发器、降膜蒸发器、喷雾干燥器、冷冻干燥器和类似设备。本发明优选旋转蒸发器。步骤(6)中所述的制备氧化石蒜碱有机酸复合脂质体方法是在高压和高剪切条件下经均化作用形成的。可接受的均化方法包括选自高压乳匀机、高压微射流均质机、高剪切混合器、超声处理器、高剪切搅拌器和类似设备。这种均化作用优选在高压乳匀机内进行,典型的操作压力是3000~30000psi的范围内,优选的压力在5000~15000psi的范围。其优选的方案如下:(1)取氧化石蒜碱的药学上可接受的盐溶于水中,先用碳酸氢钠中和其对应的酸之后;再加入油酸混合,形成氧化石蒜碱油酸复合物;(2)冷冻干燥步骤(1)得到氧化石蒜碱油酸复合物,再加入适当的二氯甲烷溶解上述复合物,得溶液;(3)根据卵磷脂、胆固醇(以及DSPE-PEG2000)的溶解特性,用二氯甲烷溶解,得溶液;(4)将溶液和溶液混合均匀,减压蒸发除去有机溶剂;(5)再将其与水相混合后,薄膜水化得混悬液;(6)将步骤(5)中所述的混悬液经高压均质在5000~15000psi的压力下制得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。本发明的目的之一,提供了氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。本发明的目的之一,提供了氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的目的之一,提供了氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体在制备抑制胃癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和淋巴癌生长的药物中的应用。本发明的目的之一,提供了氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体在制备治疗胃癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和淋巴癌的药物中的应用。本发明通过制备氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体制剂,并与之前的氧化石蒜碱油酸复合物纳米粒制剂进行了对比,用相应的体内实验证明所制备的氧化石蒜碱有机酸复合物脂质体较氧化石蒜碱油酸复合物纳米粒,提高了药物的生物利用度,延长体内循环时间。下面再以实施实例对本发明加以进一步说明,同时也结合实施例中附图加以说明,但绝不是对本发明的范围限制。有益效果(1)本发明的脂质体,有较高的包封率,有较好的水溶性、生物相容性和生物可降解性;(2)本发明的脂质体,粒径可以通过处方筛选得到10-500nm的脂质体;(3)本发明的脂质体具有更明显的缓释效果和体内血液循环时间;(4)本发明的制备工艺简单,可控,有机溶剂残留少。附图说明以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:图1为氧化石蒜碱油酸复合物脂质体和PEG化氧化石蒜碱油酸复合物脂质体的透射电镜图以及粒径分布情况。标尺:200nm图2为实施例1和2中制剂以及载LBT的纳米粒制剂的体外释放实验结果。图3为实施例1和2中制剂以及载LBT的纳米粒制剂的血清稳定性试验结果。图4为实施例1和2中制剂以及载LBT的纳米粒制剂的药动学实验结果。图5为PEG化氧化石蒜碱油酸复合物纳米粒和PEG化氧化石蒜碱油酸复合物脂质体结构示意图。具体实施方式以下实施例是对本发明的进一步说明,但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明,但是本领域技术人员应当理解,本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且,本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰,但这些都将包括在本发明的范围内。实施例1取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径200nm,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例2取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,DSPE-PEG20008mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径140nm,即得PEG化氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例3取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,DSPE-PEG50008mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径158nm,即得PEG化氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例4取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,DPPE-PEG20008mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径155nm,即得PEG化氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例5取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸10mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约10mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径210nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例6取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸100mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约100mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径220nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例7取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入硬脂酸10mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱硬脂酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,硬脂酸约10mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径170nm左右,即得氧化石蒜碱硬脂酸复合物脂质体。实施例8取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入硬脂酸100mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱硬脂酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,硬脂酸约100mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径270nm左右,即得氧化石蒜碱硬脂酸复合物脂质体。实施例9取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入脱氧胆酸10mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,脱氧胆酸约10mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径307nm左右,即得氧化石蒜碱脱氧胆酸复合物脂质体。实施例10取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入脱氧胆酸100mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,脱氧胆酸约100mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径400nm左右,即得氧化石蒜碱脱氧胆酸复合物脂质体。实施例11取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入辛酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,辛酸约30mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径280nm左右,即得氧化石蒜碱辛酸复合物脂质体。实施例12取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用蛋黄卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径204nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例13取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用蛋黄卵磷脂30mg,大豆卵磷脂30mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径200nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例14取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的Na2CO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径210nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例15取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的KHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径212nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例16取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的K2CO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用二氯甲烷将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径200nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例17取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用甲醇将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径205nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例18取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用氯仿将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径210nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实施例19取10mg氧化石蒜碱醋酸盐,超声溶解在水中,得到浓度为1~2mg/ml的氧化石蒜碱醋酸水溶液。加入适量50mg/ml的NaHCO3溶液,强力涡旋5分钟,加入油酸30mg,涡旋30分钟,10000rpm离心5分钟,取复合物沉淀冻干。冻干后取适量的氧化石蒜碱油酸复合物,其中氧化石蒜碱约10mg,油酸约30mg,再加入注射用大豆卵磷脂60mg,胆固醇30mg,用乙酸乙酯将其溶解,混合均匀后,旋蒸除去有机溶剂。加入适量注射用水,37℃摇床水化脱膜后,将水化液在高压乳匀机内乳匀7个循环,粒径215nm左右,即得氧化石蒜碱油酸复合物脂质体。实验例1测定普通氧化石蒜碱油酸复合物脂质体(LBT-OA-Liposome)和PEG化氧化石蒜碱油酸复合物脂质体(LBT-OA-PEG-Liposome)的形态和粒径。将实施例1和2中的脂质体稀释成脂质浓度为3mg/ml,于透射电镜下观察两种脂质体的形态。采用激光粒度分析仪测定制剂的粒径和电位。图1为LBT-OA-Liposome和LBT-OA-PEG-Liposome的透射电镜图以及粒径分布情况。标尺:200nm。表示结果表明,LBT-OA-Liposome和LBT-OA-PEG-Liposome有明显的磷脂双分子层结构,外观圆整,粒径均一。LBT-OA-Liposome粒径在200nm左右,LBT-OA-PEG-Liposome粒径在140nm左右,如表1。表1:脂质体的性质(n=3)Size(nm)PDIZetapotential(mV)LBT-OA-Lipo200.97±7.940.278±0.012-31.3±1.5LBT-OA-PEG-Lipo139.03±5.390.231±0.012-26.4±0.5实验例2LBT-OA-Lipo和LBT-OA-PEG-Lipo的包封率测定。专利文献201210252981.X中制备出了一种新型的氧化石蒜碱油酸复合物纳米粒(LBT-OA-NE)和PEG化的氧化石蒜碱油酸复合物纳米粒(LBT-OA-PEG-NE)。本文后续实验例中将载氧化石蒜碱的纳米粒同本发明研究中的载氧化石蒜碱脂质体进行对比。用超滤法和葡聚糖凝胶柱层析法测定四个制剂的药物包封率。超滤法:取四个制剂各0.4ml于截留分子量为3000的超滤管中,4000rpm离心15分钟后,各取一定量的滤液稀释,采用荧光分光光度计测定药物的含量,计算包封率。柱层析法:将葡聚糖凝胶G-50用水饱和后,填满装柱,各取1ml制剂,利用紫外检测器进行检测,收集制剂部分的分离液,取一定量稀释,测定药物浓度,计算包封率。结果如表2。可见,超滤法测定四个制剂的包封率都在98%左右,而柱层析得到的结果却表明脂质体有着比纳米粒更高的包封率。可能的原因是,纳米粒内部的油相是作为储藏LBT的唯一储库,氧化石蒜碱油酸复合物可能在制备的过程中,不能充分地包裹在纳米粒内部,部分被吸附在纳米粒表面,在过柱分离过程中容易释放出来。而脂质体的磷脂双分子层可以用来储存脂溶性药物,脂质体的内水相也可以来储存水溶性药物,这样,能更多地包裹氧化石蒜碱油酸复合物,吸附在脂质体外表面的复合物相对减少,达到更好的包封率。表2:不同方法测定不同制剂的包封率(n=3)方法LBT-OA-NELBT-OA-PEG-NELBT-OA-LipoLBT-OA-PEG-Lipo超滤法93.12±2.5695.33±1.2494.55±1.4797.44±1.98柱层析35.75±2.3340.53±0.7679.77±1.5785.46±1.23实验例3制剂的体外释放。将1ml的LBT溶液(1mg/ml)和各1ml的LBT-OA-NE,LBT-OA-PEG-NE,LBT-OA-Lipo,LBT-OA-PEG-Lipo(1mg/ml,按LBT的浓度计算)制剂置于透析袋中(分子截留量800~14000Da)。将透析袋置于300mlPBS(pH7.4)的锥形瓶中,于37℃摇床(70rmp)中振荡。于不同的时间点各取1ml释放介质,并补加相应体积的空白释放介质。采用液质联用方法测定药物的释放量。图2为实施例1和2中制剂以及载LBT的纳米粒制剂的体外释放实验结果。结果表明,LBT-OA-PEG-Lipo有着更好的缓释效果。实验例4制剂的血清稳定性。将制备好的LBT-OA-Lipo,LBT-OA-PEG-Lipo以及LBT-OA-NE,LBT-OA-PEG-NE制剂各取1ml,与等体积的50%胎牛血清混合后,于不同时间点下取少量混合物,测定制剂的粒径变化。图3为实施例1和2中制剂以及载LBT的纳米粒制剂的血清稳定性试验结果。结果表明,不论是LBT的纳米粒制剂还是本发明中脂质体制剂,在血清24小时内都有良好的稳定性。实验例5制剂的X射线光电子能谱分析(XPS)。将制备好的LBT-OA-Lipo,空白脂质体以及LBT-OA-NE,空白纳米粒制剂各取数滴滴于载玻片上,待水分挥发干净后用X射线光电子能谱分析仪分析表面3nm的碳、氮、氧和磷元素的含量。分析结果如表3所示。油酸跟氧化石蒜碱都含有氧元素,载药的脂质体表面氧元素较空白脂质体有轻微地增加,而载药纳米粒相较于空白纳米粒,氧元素有更多的增加,表明脂质体将更多的氧化石蒜碱包入在内部,而纳米粒则有更多的药物存在制剂的表面。表3:不同制剂的表面元素分析实验例6制剂的药动学实验。25只SD大鼠随机分为5组,每组5只,禁食12h后分布给予LBT溶液,LBT-OA-NE,LBT-OA-PEG-NE以及LBT-OA-Lipo,LBT-OA-PEG-Lipo,其中LBT的给药剂量为10mg/kg。于尾静脉注射后0.083、0.15、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48h取血0.3ml至肝素钠处理过的离心管中,5000rmp离心5分钟,取出上层血浆100μl,于-40℃下冻存。血浆样品处理:将血浆样品于室温下放置后,加入300μl乙腈沉淀蛋白,涡旋5分钟后10000rpm离心5分钟,取上层清液过0.22μm膜后,采用LC-MS/MS测定血浆内LBT的浓度。利用DAS软件计算药动学参数。药动学参数如表4所示。如表中所示,LBT-OA-Lipo能显著提高LBT的生物利用度,其AUC值是LBT原药组的11.5倍,LBT-OA-NE组的3.0倍,是LBT-OA-PEG-NE组的1.8倍。另外PEG化的脂质体有着最高的生物利用度,其AUC值是LBT原药组的42.6倍,LBT-OA-NE组的11.2倍,是LBT-OA-PEG-NE组的6.7倍,是LBT-OA-Lipo组的3.7倍。图4为实施例1和2中制剂以及载LBT的纳米粒制剂的药动学实验结果。结果表明,载LBT的脂质体,尤其是PEG化脂质体,能显著延长药物的循环时间(24h后仍有较高血药浓度),提高药物的生物利用度。表4:静脉注射后LBT在不同制剂中的药动学参数(n=5)P<0.05;a,vs.LBT-OA-liposome;b,vs.LBT-OA-PEG-liposome.缩写:t1/2α分布半衰期;t1/2β清除半衰期;AUC0-24h表示0到24小时内药物曲线下面积;MRT滞留时间;CL总清除率。当前第1页1 2 3 
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