一种用于治疗耳聋的药物组合物的制备方法与流程

本发明涉及一种用于治疗耳聋的药物组合物的制备方法。技术背景：聋哑病人是指听觉和语言障碍兼有的病人。全世界聋哑人约2亿人。我国有聋哑人2700多万，每年新增2-3万人。一旦一个家庭有一位聋哑患儿，就会给这个家庭在经济上、思想上造成严重的困难和压力。感音神经性聋是由于外源性或自身衰老导致的耳蜗毛细胞的变性和逐渐消失，血管纹、螺旋神经节、听神经或听觉中枢的退行性病变引起的听力减退和听力丧失。目前这被认为是一种不可逆的病变且尚无特效药物或保守疗法能使感音神经性聋病人完全恢复听力。药物治疗对于改善听功能有一定疗效，但十分有限，有些药物还有较大的毒副作用。电子耳蜗植入和助听器的应用均依赖于螺旋神经节神经元的存活，螺旋神经节神经元的缺失会影响其效果。因此，寻找一种有效且低毒或无毒的治聋药物仍是一条重要途径。近年来，中药治聋的研究也取得了很大发展。中国专利CN1775254A公开了一种治疗耳聋的药物制剂及其制备方法(龙胆、黄芩、地黄、泽泻、川木通、栀子、当归、九节菖蒲、甘草、羚羊角等中药原料制成)。但该专利中未公开临床疗效资料及动物实验资料。中国专利CN101439131A的专利中报道了一种治疗感音神经性耳聋的中药组合物及其应用，该中药组合物的配方和重量比为：熟地黄22-48份，泽泻8-18份。该专利中的药物组合物具有滋阴补肾，利水泄热的功效，对于感音神经性耳聋有一定的防治功效。众所周知，中药的炮制对于药材的治疗效果有着关键的影响。然而在前人研究中，对于治疗耳聋的药物，并没有一种很成熟的制备方法。技术实现要素：：有鉴于此，提出本发明。本发明提供了一种用于治疗耳聋的药物组合物的制备方法。本发明的技术方案为：本发明提供了三种药物组合物，其中，药物组合物1由红花5-40重量份、黄芪10-60重量份、穿山甲5-40重量份、桃仁10-60重量份、川芎4-40重量份、莱菔子5-40重量份、木香5-40重量份、乌药6-40重量份、熟地15-70重量份，山萸肉15-70重量份、丹皮6-40重量份、云苓6-40重量份、泽泻5-50重量份、磁石15-80、皂刺5-50重量份、水蛭5-40重量份、知母5-40重量份、黄柏5-40重量份制成；组合物2由黄芪30-90重量份、当归5-50重量份、川芎3-20重量份、赤芍7-40重量份、桃仁3-30重量份、红花3-30重量份、肉桂1-10重量份、苏木5-50重量份、水蛭3-30重量份、王不留10-60重量份、磁石10-60重量份制成。组合物3由银花15-60重量份、瓜蒌15-60重量份、当归5-30重量份、元胡15-60重量份、川芎20-90重量份、人参3-30重量份、五灵脂5-40重量份、冰片10-60重量份，麝香(或人工麝香)1-10重量份、磁石15-60重量份、杞果7-60重量份、公英15-60重量份、山萸肉15-60重量份制成。本发明还提供了一种用于制备治疗耳聋药物的药物组合物，其中，该药物组合物由组合物2和组合物3组成，使用时将组合物2和组合物3联用。优选的，组合物2的组方为黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份；组合物3的组方为银花30重量份、瓜蒌30重量份、当归10重量份、元胡30重量份、川芎45重量份、人参6重量份、五灵脂10重量份、冰片20重量份，麝香(或人工麝香)5重量份、磁石30重量份、杞果15重量份、公英30重量份、山萸肉30重量份。一种用于制备上述药物组合物的制备方法，其特征在于：组合物2、3的制备步骤包括(1)原料的清洗(2)原料的预处理-炒制(本发明中提到的炒制意为将药材炒焦，具体操作方法为，将药材置于锅内，用中火炒制外呈焦黄，内呈黄色的状态)(3)水煎(4)加入乙醇(5)过滤(6)浓缩包装。优选的，所述药材从原产地采购，并按照《中国药典》的标准对药材进行筛选，粉碎和切片。优选的，采用低氘水对药材进行清洗，浸泡10-30min。优选的，清洗前将低氘水中加入0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理。低氘水的氘丰度为20-130×104atm％。优选的，增氧至水中氧含量为15-60ul/L时，停止增氧。优选的，浸泡时经过超声处理，功率为280w。优选的，炒制过程为中火炒制20min。优选的，水煎的步骤为，将浸泡过的药材取出，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入100-130℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流10-30min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液。优选的，浓缩包装的步骤为，将加入乙醇的煎液浓缩，经脱色、调节pH值或除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药。优选的，所述组合物1的制备方法为：制备方法：(1)将上述药材从原产地采购；(2)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为20×104atm％的低氘水，加入少量的微量元素硒，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；在所得含微量元素的低氘增氧水中加入步骤(1)中的产地药材进行清洗，浸泡15min；(3)药材的挑选，将水洗浸泡后的药材照2010年版《中国药典》中药一部的标准，对药材进行筛选、粉碎和切片；(4)药材的浸泡，将已经粉碎或切片的红花、黄芪、穿山甲、桃仁、川芎、莱菔子、木香、乌药、熟地，山萸肉、丹皮、云苓、泽泻、皂刺、知母、黄柏于40℃的低氘水中浸泡20min；将已经粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分钟；(5)水煎，将步骤(4)中浸泡过的药材取出，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得煎液浓缩，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为50-150ml。优选的，所述组合物2的制备方法为：(1)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为20×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；将已经粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分钟；(2)炒制：(3)水煎，将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为30-60％；(5)过滤：静置12h，过滤沉淀获得药液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.1-1.3g/ml，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为50-150ml。优选的，所述组合物3的制备方法为：(1)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为20×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的银花、瓜蒌、当归、元胡、川芎、人参、五灵脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉量份于40℃的低氘水中浸泡20min；将已经粉碎的磁石于60℃的低氘水中浸泡20分钟；(2)炒制：(3)水煎，将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为30-60％；(5)过滤：静置12h，过滤沉淀获得药液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.1-1.3g/ml，调节pH值至6，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为50-150ml。优选的，所述组合物2的制备方法为：炒制的步骤为，中火对黄芪，当归，桃仁，苏木这几味药材进行炒制。优选的，所述组合物3的制备方法为：炒制的步骤为，中火对银花，当归，元胡，公英，山萸肉这几味药材进行炒制。优选的，所述组合物2的清洗的步骤为：将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为20×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w。优选的，所述组合物3的清洗的步骤为：将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为20×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的银花、瓜蒌、当归、元胡、川芎、人参、五灵脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w。本发明的有益效果为：1.采用经过特殊处理的水对药材进行清洗，能够活化药材中的有效成分，易于药物发挥药性。2.将不同的药材分开浸泡超声，便于药材中的有效成分更好的逸出。3.将不同的药材分开浸泡，炒制，便于药材中的有效成分更好的逸出。4.经动物实验证明，本发明方法所得的药物组合物，在治疗因感音毛细胞损伤或缺失导致的耳聋有良好的治疗效果，治愈率高。附图说明图1是本发明中对照组致聋90天后毛细胞的电镜观察图(20KV×1500)；图2是本发明中对照组致聋90天后毛细胞的电镜观察图(20KV×3000)；图3是本发明实验组5致聋实验后治疗90天毛细胞再生的电镜观察图(20KV×1500)；图4是本发明实验组5致聋实验后治疗90天毛细胞再生的电镜观察(20KV×3000)。具体实施方式实验例1本实验例目的在于验证炒制对于制备复聪汤的有益效果。以组合物2的制备方法为例：实验中，以药材提取后，药液的溶质质量作为检测指标，溶质质量越高，有效成分提取的量越大，推测该制备方法的治疗效果越好。1.不用炒制方法制备：按重量份数称取如下药材：黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，总计100g。量取1000ml氘丰度为20×104atm％的低氘水，加入0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；将已经粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分钟。将清洗过的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液。将煎液静置12h，过滤，滤液减压干燥获得粉末，称重。2.采用炒制方法制备：按重量份数称取如下药材：黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，总计100g。量取1000ml氘丰度为20×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；将已经粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分钟。将清洗过的药材晾干，放入锅中，中火炒制20min。随后按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液。将煎液静置12h，过滤，滤液减压干燥获得粉末，称重。实验结果如表1所示，可以发现，经过炒制步骤的煎液，其溶质质量更大，可以推测煎液中的有效成分更多。表1经炒制步骤与不经炒制步骤获得的煎液的溶质质量粉末质量(g)未经炒制5.7经过炒制6.8随后的实验中，申请人意外的发现，并非所有药材都适合炒制，经过大量实验发现，组合物2中炒制黄芪，当归，桃仁，苏木这几味药材，获得的煎液溶质质量最大。组合物3中炒制银花，当归，元胡，公英，山萸肉这几味药材，获得的煎液溶质质量最大。实验数据如表2-3所示。表2组合物2中不同炒制方案中表3组合物3中不同炒制方案中实验例2本实验例目的在于验证超声对于制备复聪汤的有益效果。以组合物2的制备方法为例：实验中，以药材提取后，药液的溶质质量作为检测指标，溶质质量越高，有效成分提取的量越大，推测该制备方法的治疗效果越好。1.不用超声方法制备：按重量份数称取如下药材：黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，总计100g。量取1000ml氘丰度为20×104atm％的低氘水，加入0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；将已经粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分钟。将清洗过的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液。将煎液静置12h，过滤，滤液减压干燥获得粉末，称重。2.采用超声方法制备：按重量份数称取如下药材：黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，总计100g。量取1000ml氘丰度为20×104atm％的低氘水，加入0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w。随后按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液。将煎液静置12h，过滤，滤液减压干燥获得粉末，称重。实验结果如表4所示，可以发现，经过超声步骤的煎液，其溶质质量更大，可以推测煎液中的有效成分更多。表4经超声步骤与不经超声步骤获得的煎液的溶质质量粉末质量(g)未经超声6.7经过超声12.3对比例1按照CN1775254A中的制备方法，制备治疗耳聋药剂。称取龙胆125g，黄芩125g，地黄125g，泽泻125g，川木通125g，栀子125g，当归125g，九节菖蒲125g，甘草125g，羚羊角6.25g。当归、羚羊角分别粉碎成细粉；其余龙胆等八味加乙醇回流提取二次，第一次2小时，第二次1.5小时，合并乙醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇并浓缩至稠膏状；药渣加水煎煮二次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.30～1.35(50℃)的清膏，与上述稠膏合并，搅匀，真空干燥，粉碎成细粉，加入当归、羚羊角细粉，混匀，加入适量淀粉及2％微粉硅胶，混匀，装入胶囊，制成1000粒，即得。对比例2按照CN101439131A中的制备方法，制备治疗耳聋药剂。称取熟地黄24g、泽泻9g，加入10倍量双蒸水浸泡2h，武火煮沸后，文火煎煮0.5h，取药液。再次加入8倍量的双蒸水，浸泡1h，武火煮沸后，文火煎煮0.5h，取药液。将两次药液合并，90℃水浴浓缩。按体积比2∶3加入无水乙醇，充分混匀，4℃静置24h，1500rpm离心15min，取上清，弃沉淀。90℃水浴挥发乙醇，三蒸水定容至270ml液体。0.22μm小滤器过滤除菌，制得药剂。对比例3按照组合物2的组方，称取黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，共计100g。将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为55×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为30ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留于40℃的低氘水中浸泡20min；将已经粉碎的磁石、水蛭于60℃的低氘水中浸泡20分钟；将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为50％；静置12h，过滤沉淀获得药液；将上一步所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.2g/ml，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。对比例4按照组合物2的组方，称取黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，共计100g。将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为55×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为30ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为50％；静置12h，过滤沉淀获得药液；将上一步所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.2g/ml，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。对比例5按照组合物2的组方，称取黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，共计100g。将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为55×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为30ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留浸泡于40℃的低氘水中；将已经粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中；中火对黄芪、当归、桃仁、苏木这几味药材进行炒制；将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为50％；静置12h，过滤沉淀获得药液；将上一步所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.2g/ml，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。制备例1组合物2的组方：黄芪30重量份、当归5重量份、川芎3重量份、赤芍7重量份、桃仁3重量份、红花3重量份、肉桂1重量份、苏木5重量份、水蛭3重量份、王不留10重量份、磁石10重量份，共称取药材100g。制备方法：(1)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为20×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为15ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、赤芍、川芎、红花、肉桂、苏木、王不留于40℃的低氘水中浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；(2)炒制：中火对黄芪，当归，桃仁，苏木这几味药材进行炒制；(3)水煎，将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为30％；(5)过滤：静置12h，过滤沉淀获得药液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.1g/ml，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。制备例2组合物2的组方：黄芪90重量份、当归50重量份、川芎20重量份、赤芍40重量份、桃仁30重量份、红花30重量份、肉桂10重量份、苏木50重量份、水蛭30重量份、王不留60重量份、磁石60重量份，共称取药材100g。制备方法：(1)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为130×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为60ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留于40℃的低氘水中浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；(2)炒制：中火对黄芪，当归，桃仁，苏木这几味药材进行炒制；(3)水煎，将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为60％；(5)过滤：静置12h，过滤沉淀获得药液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.3g/ml，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。制备例3组合物2的组方：黄芪60重量份、当归10重量份、川芎6重量份、赤芍15重量份、桃仁6重量份、红花6重量份、肉桂5重量份、苏木10重量份、水蛭6重量份、王不留20重量份、磁石20重量份，共称取药材100g。制备方法：(1)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为55×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为30ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的黄芪、当归、桃仁、川芎、赤芍、红花、肉桂、苏木、王不留于40℃的低氘水中浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石、水蛭浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；(2)炒制：中火对黄芪，当归，桃仁，苏木这几味药材进行炒制；(3)水煎，将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为50％；(5)过滤：静置12h，过滤沉淀获得药液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.2g/ml，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。制备例4组合物3的组方：银花15重量份、瓜蒌15重量份、当归5重量份、元胡15重量份、川芎20重量份、人参3重量份、五灵脂5重量份、冰片10重量份，麝香(或人工麝香)1重量份、磁石15重量份、杞果7重量份、公英15重量份、山萸肉15重量份，共称取药材100g。制备方法：(1)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为20×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为25ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的银花、瓜蒌、当归、元胡、川芎、人参、五灵脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；(2)炒制：中火对银花，当归，元胡，公英，山萸肉这几味药材进行炒制；(3)水煎，将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为30％；(5)过滤：静置12h，过滤沉淀获得药液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.1g/ml，调节pH值至6，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。制备例5组合物3的组方：银花60重量份、瓜蒌60重量份、当归30重量份、元胡60重量份、川芎90重量份、人参30重量份、五灵脂40重量份、冰片60重量份，麝香(或人工麝香)10重量份、磁石60重量份、杞果60重量份、公英60重量份、山萸肉60重量份，共称取药材100g。制备方法：(1)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为130×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为60ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的银花、瓜蒌、当归、元胡、川芎、人参、五灵脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；(2)炒制：中火对银花，当归，元胡，公英，山萸肉这几味药材进行炒制；(3)水煎，将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为60％；(5)过滤：静置12h，过滤沉淀获得药液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.3g/ml，调节pH值至6，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。制备例6组合物3的组方：银花30重量份、瓜蒌30重量份、当归10重量份、元胡30重量份、川芎45重量份、人参6重量份、五灵脂10重量份、冰片20重量份，麝香(或人工麝香)5重量份、磁石30重量份、杞果15重量份、公英30重量份、山萸肉30重量份，共称取药材100g。制备方法：(1)清洗，将1000ml去离水照常规方法制备氘丰度为55×104atm％的低氘水，0.0001％亚硒酸钠，搅拌均匀后，进行增氧处理，至水中氧含量为30ul/L时，停止增氧；将已经粉碎或切片的银花、瓜蒌、当归、元胡、川芎、人参、五灵脂、冰片，麝香(或人工麝香)、杞果、公英、山萸肉浸泡于40℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；将已经粉碎的磁石浸泡于60℃的低氘水中，超声处理20min，超声功率280w；(2)炒制：中火对银花，当归，元胡，公英，山萸肉这几味药材进行炒制；(3)水煎，将上述步骤获得的药材，按照先加入根茎类药物，后加入叶片类药物的顺序加入120℃的低氘水中，恒温恒压下封闭回流20min；回流完毕后，收集煎液，并于相同温度下低氘水煎2次，合并煎液；(4)加入乙醇：将煎液中加入乙醇，使得乙醇浓度为50％；(5)过滤：静置12h，过滤沉淀获得药液；(6)浓缩包装，将步骤(5)中所得药液蒸馏浓缩，直到药液密度达到1.2g/ml，调节pH值至6，除菌后用无菌软包、玻璃瓶或塑料瓶包装成药，装量为100ml。效果例1动物实验1.造模选用健康青年杂色豚鼠，耳廓反射正常，体重250-300g，雌雄各半。随机分为庆大霉素致聋组(Gentamyci,GM组)，正常对照组。动物用戊巴比妥钠80mg/Kg剂量麻醉，进行脑干诱发电位(ABR)和畸变耳声发射(DPOAE)测定。测定后的GM组每天肌注庆大霉素(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批准文号：国药准字H37021973)按80mg/kg。连续肌肉注射14-20天，测定庆大霉素注射动物的ABR阈值在50dBSPL以上，DPOAE幅值明显下降后，再分为致聋后对照组、致聋后中药治疗组和对比例治疗组。正常对照组肌肉注射生理盐水同样时间。注射后的所有动物进行ABR和DPOAE测定。2.听功能测定方法美国InteligentHearingSmart听觉诱发电位-耳声发射仪(脑干诱发电位、耳蜗电图、多频稳态)。动物麻醉后，用针电极插入颅顶为记录电极，同侧为参考电极，对侧接地。刺激率19.1/ms,高通300，低通3000，平均叠加256-512次。DPOAE记录是将大小合适的探头塞入外耳道，使外耳道密封，当刺激信号平稳后进行测试，重复两次。每个受试者均接受两个初始音强度分别为为L1＝70dBSPL，L2＝70dBSPL的纯音信号刺激，初始音的频率比为f1/f2＝1.22，f1、f2的几何均数的范围位于0.5～8.0kHz。分别选择f2为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16，32kHz各点进行测试，测量不同刺激强度时DPOAE的幅值，以引出反应幅值高出本底噪声3dB时的最小刺激强度作为DPOAE有无的指标，确定检出率。上述测试均叠加100次。3.治疗方法及药物用量3.1将GM致聋豚鼠随机分组，每组各20只。按陈奇主编的《中药药理研究方法学》方法，按成人量(mg/kg)换算成动物剂量的倍数简表，换算豚鼠为4.5倍的剂量(mg/kg)，计算出豚鼠的口服用药剂量为10ml。如本发明表1所述，致聋后对照组、致聋后中药治疗组和对比例治疗组的小鼠每天服用中药组合物2，组合物3，二者的组合物，对比例中的中药组合物，连续治疗3个月。庆大霉素致聋后对照组同样为20只，给予口服同剂量的生理盐水，时间同治疗组。3.2统计学方法：采用MicrosoftOfficeExcel录入数据，计算平均值，制作数据表格。分析数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示。所有数据用SPSS10.0forWindow软件进行显著性检验。3.3DPOAE实验结果：根据实验数据可知(见表6-8)，在高频区(2844Hz-8040Hz)，组合物2、3单独使用均有一定的复聪作用，但是当联用组合物2、3时，如实验组5的治疗方案，药效最佳(见表6、7)(P＜0.01)。此外，如表5所示，与对比例的五种处方相比，组合物2、3联用的复聪效果要更好。其中，采用制备例3方法制得的复聪汤，其效果要优于采用对比例3-5方法制备的复聪汤，这说明在药物炮制过程中，超声及炒制都是必要步骤。此外，组合物2、3的联用效果最佳，可使实验动物听力的高频区基本恢复到正常水平。3.4ABR实验结果：根据表9、表10可知，正常豚鼠的ABR平均阈值应当在20-30dBSPL，GM致聋后ABR阈值上升到43-57dBSPL，与正常豚鼠相比，数据有显著性差异(P＜0.01)。组合物治疗90天后，ABR的平均阈值均有不同程度的下降，其中，采用组合物2、3联用的治疗方案，ABR阈值基本恢复到正常程度，与正常组相比没有显著性差异(P＞0.05)。表5：对大庆素致聋豚鼠给药分组和给药情况表6：致聋实验0日时正常组与庆大霉素致聋组致聋后DPOAE各频率幅值(dBSPL,x±s)表7：致聋实验90日后正常组与庆大霉素致聋普通组DPOAE各频率幅值(dBSPL,x±s)表8：致聋实验90日后对比例组DPOAE各频率幅值(dBSPL,x±s)表9：致聋实验0日时各组ABR反应域(dBSPL,x±s)组别耳数ABR反应域14024.64±4.8324052.53±6.12表10：致聋实验90日后各组ABR反应域(dBSPL,x±s)效果例2扫描电镜观察方法：对实验中，对照组和实验组5进行扫描电镜的观察。步骤如下。将取材的左侧耳蜗样品用缓冲液把组织表面洗净，在解剖显微镜下(OLYMPUS，TOKYO，297261)，用纤细钢针在耳蜗顶部打一小孔，一定要挑破前庭膜，再挑破圆窗膜和卵圆窗膜，并去除镫骨及足板，用细滴管将2.5％戊二醛固定液从蜗尖小孔和圆窗卵圆窗反复滴灌3-5次，明显看到液体从两窗流出。将样品浸泡在固定液中，置于4℃冰箱中4小时。置于0.1MPB缓冲液中，在解剖显微镜下在耳蜗各回骨壁钻孔，使耳蜗各回与固定液相通，再浸泡于固定液中4小时。用0.1MPB漂洗三次后，用1％OsO4后固定2小时。用0.1MPB漂洗20-30分钟。用乙醇梯度脱水，乙醇的浓度依次为30％-50％-70％-90％-100％(3次)，乙醇与乙酸异戊酯1:1的混合液10-20分钟；纯乙酸异戊酯10-20分钟。临界点干燥：装样：将样品从乙酸异戊酯中放入滤纸6中，移入临界点干燥仪的样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。注入液态二氧化碳，依次打开二氧化碳钢瓶的排气阀和仪器的进气阀在0-10℃下，向样品杯注入液态二氧化碳。当液态二氧化碳充至样品杯容积的50％时，关闭仪器进气阀，静置15-20分钟，让乙酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后打开仪器打开仪器排气阀门和进气阀门，让其边排气边充气10分钟，再关闭排气阀，继续冲入液态二氧化碳至样品杯的80％左右关闭进气阀。加温置换：将温度调节设定在20℃处经15-20分钟后，由于温度升高，样品杯内液态二氧化碳逐渐气化，因此，压力也随之上升至7000Pa左右，样品中的乙酸异戊酯将二氧化碳充分置换。气化：将温度旋钮调至临界温度以上(35-40℃)，此时随着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加达到二氧化碳的临界点，界面也随之消失。当压力达到7134Pa时经5分钟后，即可排气。排气：在保持温度不变的情况下(即不关电源)打开流量计的排气阀门，以1.0L/分钟的速度排气，经2小时左右排气完毕，样品杯的压力下降到零将温度调节至室温约5分钟后，即可取出样品。离子溅射镀膜：将样品用双面胶带样品台上(注意样品观察的方向性)。将样品放入离子溅射仪的真空罩内，当真空罩内的真空度抽到10-1Pa时在阴极与阳极中间加上1000-3000V的直流电压，两极之间产生弧光放电的电场。在电场的作用下罩内残余的气体分子被电离为正离子和电子，正离子被阴极吸引轰击金属靶，激发出金属离子和电子，并被阳极吸引附着在样品表面而形成金属导电膜。扫描电镜观察在S-2700ScanningElectionMicroscopeHITACHI下进行。实验结果如图1-4所示。图1，图2为庆大霉素致聋90天后的毛细胞形态，可见毛细胞表面的纤毛破损严重且不规则。图3，图4为致聋后，采用实验组5制备的复聪汤进行治疗90天后的情况，由图可见，纤毛数量有了显著的提升，排列也较为均匀，规则。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3