一种茶叶多肽在制备抗II型糖尿病药物或保健品中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种茶叶多肽在制备抗II型糖尿病药物或保健品中的应用。

背景技术：

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)已经是世界上最常见的非传染性疾病之一。其中全球已被诊断的糖尿病成人患者中，90％是II型糖尿病(Type 2Diabetes mellitus,T2D)。在中国T2D同样占了总病人的95％。

目前常见的治疗II型糖尿病的药物有以下几种：1、磺脲类药物：是II型糖尿病的主要口服降糖药物，是通过与β-细胞表面特异受体的相互作用刺激胰岛素分泌而起作用的。2、双胍类：作用机制为抑制肝糖元异生，减少葡萄糖的来源，增强组织对葡萄糖的摄取和利用，增强胰岛素敏感性，抑制胰高血糖素的释放。降糖作用肯定，不诱发低血糖，具有降糖作用以外的心血管保护作用，如调脂、抗小血板凝集等。3、糖苷酶抑制剂：通过抑制小肠粘膜上皮细胞表面的糖苷酶，延缓碳水化合物的吸收，从而降低餐后血糖。4、噻唑烷二酮：为胰岛素增敏剂，通过增加外周组织对胰岛素的敏感性、改善胰岛素抵抗而降低血糖，并能改善与胰岛素低抗有关的多种心血管危险因素。5、甲基甲胺苯甲酸衍生物：非磺脲类胰岛素促分泌剂，起效快、作用时间短。

其中一种治疗II型糖尿病的方法是通过抑制二肽基肽酶-IV(Dipeptidyl peptidase-IV,DPP-IV)来增强胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)。GLP-1是一种具有30个氨基酸的肠降血糖素，具有促进胰岛素分泌和生物合成，抑制胰高血糖素的分泌，促进胰岛细胞增殖，抑制胰岛细胞凋亡，保存细胞对血糖的敏感性等多种生理功能。DPP-IV是DPP家族的一员(Dipeptidyl peptidases,DPPs)，广泛分布于小肠、肝脏和肾脏等上皮组织的细胞膜中。最初它被定义为丝氨酸水解酶，但是后来的研究发现，DPP-IV可以水解许多不同的功能性多肽，其中最主要的就是GLP-1。由小肠L-细胞分泌的GLP-1有75％在运输到肝脏的过程当中被DPP-IV所降解。故在血糖控制当中，对DPP-IV的抑制可以减少GLP-1的降解，从而达到治疗T2D的作用。由于治疗T2D常见药物(西格列汀)具有一定的副作用，如低血糖，体重增加和胃肠道功能紊乱等，因此，没有副作用，但相对低疗效的膳食疗法已成为治疗糖尿病的替代疗法之一。

茶树，原名：茶，拉丁文名：Camellia sinensis(L.)O.Ktze.，山茶科、山茶属灌木或小乔木，嫩枝无毛。叶革质，长圆形或椭圆形。分布主要集中在南纬16度至北纬30度之间，茶树喜欢温暖湿润气候，平均气温10℃以上时芽开始萌动，生长最适温度为20～25℃；年降水量要在1000毫米以上；喜光耐阴，适于在漫射光下生育；一生分为幼苗期、幼年期、成年期和衰老期。其叶子可以制茶，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、消炎、解毒、抗过敏、降血脂、降血糖等保健功效。国内外大量研究表明，各种茶叶茶多糖都有显著或极显著的降血糖效果。还有一种认为主要是茶多酚起作用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种如SEQ ID NO.1所示的茶叶多肽的新用途，即在制备抗II型糖尿病药物或保健品中的应用。

茶叶多肽或其前体肽在制备治疗和/或预防II型糖尿病的药物中的应用，所述茶叶多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明从茶叶中分离出的多肽序列在申请号为201310508621.6的专利文献已有公开，该文献公开了一种源于油菜花粉的具有抑制血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)活性的多肽化合物AGFAGDDAPR，其氨基酸序列分别为Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg。多肽AGFAGDDAPR具有ACE抑制活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。虽然该多肽与本发明从茶叶中分离出的多肽的氨基酸序列相同，但本发明涉及的AGFAGDDAPR在治疗糖尿病中的用途是首次公开。

本发明涉及的茶叶多肽的氨基酸序列为Ala-Gly-Phe-Ala-Gly-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg，单链线性结构，分子量为976.01Da。研究发现，该茶叶多肽对DPP-IV活性具有强的抑制作用，采用底物发色法对DPP-IV抑制效果进行测定，选用Gly-Pro p-nitroanilide作为底物，其中底物浓度为0.29mmol/L，DPP-IV浓度为1.9U/L，茶叶多肽AGFAGDDAPR的IC₅₀为326.25±1.08umol/L。在单次口服糖耐量实验中，茶叶多肽能够降低小鼠的血糖水平和AUC120min值，达到了显著差异，显示出其在控制血糖方面的潜力。

多肽本身是人体内源性物质，通过参与、介入、促进或抑制人体内生理生化过程而发挥作用，副作用低，药效高，针对性强，不会蓄积于体内而引起中毒。

多肽药物往往半衰期短，体内易破坏而作用时间短。为了提高多肽的水溶性、稳定性、生物膜渗透性，对茶叶多肽进行功能修饰制得前体多肽。

由于多肽类药物在胃肠道极易被蛋白质酶水解，口服的生物利用度很低，因此优选的给药途径为注射给药或经皮给药。

茶叶多肽或其前体肽在制备治疗和/或预防II型糖尿病的保健品中的应用，所述茶叶多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种治疗II型糖尿病的药物组合物，包括有效量的SEQ ID NO.1所示的茶叶多肽或其前体肽和药学上可接受的载体。主要活性成分为此茶叶多肽。

为了提高多肽类药物的生物利用度，需要根据具体的给药方式，选择相应的药物载体。药物载体能够有效地控制药物在体内的释放。

优选的方案，所述药物载体为脂质体，脂质体是一种类似微型胶囊的剂型，可被生物降解且免疫原性小。将活性成分茶叶多肽或其前体肽包埋于磷脂双分子层的脂质体中，对药物起到保护作用。

优选的方案，所述药物载体为传递体，传递体具有高变形能力，能够高效穿透皮肤进入体循环。

所述药物组合物的制剂形式为微球，将上述的茶叶多肽或其前体肽包裹在高分子材料中，制成微球。作为优选，高分子材料为PLGA共聚高分子。

本发明还提供了一种茶叶多肽作为DPP-IV抑制剂的用途，所述茶叶多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明具备的有益效果：本发明提供的如SEQ ID NO.1所示的茶叶多肽被证明具有明显抑制DPP-IV活性的效果，其在制备抗II型糖尿病药物或保健品和制备DPP-IV抑制剂的应用中具有良好的潜力。

附图说明

图1为实施例1中小鼠口服糖耐量实验各实验组血糖水平的对比图，图中*表示与空白对照组显著不同(P<0.05)，**表示与空白对照组极显著不同(P<0.01)。

图2为实施例1中小鼠口服糖耐量实验不同处理下药时曲线下面积比较图，图中*表示与空白对照组显著不同(P<0.05)，**表示与空白对照组极显著不同(P<0.01)，。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

1、不同茶类水提取物的效果测定：

将收集起来的龙井茶，汤记高山茶，云南红茶，正山小种，大红袍，铁观音，莫干黄芽，霍山黄芽以及普洱茶充分研磨成粉状。准确称取1g(±0.01g)茶粉溶解于75mL沸腾的超纯水，沸水浴提取45min后抽滤，然后用超纯水定容到100mL，使用前，冻存于-20℃。

对DPP-IV抑制效果的测定采用底物发色法，选取Gly-Pro p-nitroanilide作为底物，100mmol/L的HCl-Tris溶液作为缓冲液，定义一分钟内催化1umol底物所需要的DPP-IV量为一个酶的活力单位。反应在96孔板内进行，反应体系为100uL，其中底物浓度为0.29mmol/L，DPP-IV浓度为1.9U/L，茶叶提取物浓度为10mg/mL。同时设置无茶叶提取的空白对照和500ug/mL西格列汀的阴性对照。加样顺序为缓冲液、DPP-IV、茶叶提取物、底物。加完底物后立即用酶标仪在405nm波长下读出A₀，37℃放置1h后，再用相同波长读出A₁。计算抑制率。

实验结果如表1所示：

表1不同茶叶水浸出物对DPP-IV的抑制效果

除龙井茶稍低以外，其余茶类之间的抑制效果无显著差异，且红茶，黑茶等发酵茶具有较好的抑制效果。

此外，有报道称一些来自天然食品的肽链对DPP-IV有显著的抑制作用，故对发酵程度最高且抑制效果最好的红茶正山小种进行了肽链的分离。

2、肽链分离

首先，用50kDa、10kDa、5kDa、1kDa的超滤膜对肽链进行粗分离并测定抑制率，测定体系如上所述，结果如表2所示。根据结果进行SDS-PAGE电泳细分，切胶回收后用液相色谱质谱联用仪分析其氨基酸序列。

表2不同孔径超滤膜分离后正山小种的肽链浓度及其抑制效果

从表中可看出经过4种孔径的膜分离后，其肽链浓度显著减少，但是抑制率并无明显下降，故对1kDa分离后的肽链进行细分，并对其肽链顺序进行了测序分析。结果如表3所示：

表3从1kDa中分离出的肽链序列及其基本信息

3、茶叶中具体成分的抑制效果测定

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，是茶叶的主要功能性成分之一，其中又以儿茶素为主，儿茶素中又以EGCG的效果最佳，故对儿茶素EGCG以及95％茶多酚进行了抑制率的测定IC₅₀的筛选，反应体系为100uL，其中底物浓度为0.29mmol/L，DPP-IV浓度为1.9U/L，儿茶素EGCG和茶多酚的浓度从0-500ug/mL。同时设置西格列汀作为阴性对照。

从茶叶提取物中获得4条肽链后，人工合成四条多肽，其纯度为92％。对人工合成多肽与95％茶多酚等一起进行IC₅₀筛选，结果如表4所示：

表4不同物质纯化后的IC₅₀筛选

从表中可以看出肽链AGFAGDDAPR具有较低的IC₅₀值，其余三条多肽效果相对低一些。因此可以认为此目标多肽在抵抗II型糖尿病中会起到有效的治疗作用。

4、正常小鼠口服糖耐量实验

选取健康雄性ICR小鼠，体重20g左右，在12小时光暗交替的环境中饲养，保证足够的食物和水供给，自由进食。将小鼠分成三组，保证每组体重相近，每组10只。在口服糖耐量实验前30分钟，对三组小鼠分别灌胃超纯水、多肽AGFAGDDAPR(500mg/kg)，西格列汀(5mg/kg)，超纯水组为空白对照组，西格列汀组为阳性对照组。糖耐量实验开始时每只小鼠灌胃5g/kg体重比的葡萄糖，在0,30,60,90,120min用OneTouch Ultra(LifeScan,Inc.Milpitas,USA)测定血糖值，计算曲线下面积。

结果如图1和图2所示：对照组小鼠的初始血糖水平为7.41mmol/L，在30min快速增加，随后快速下降，在最后60min缓慢下降，120min时趋于稳定。西他列汀组在前30min的血糖水平极显著低于空白对照组(P<0.01)，60min时显著低于空白对照组(P<0.05)。多肽组在30min时的血糖水平为13.53mmol/L低于空白对照组，达到显著水平。口服多肽降低了AUC120min的值，从1238mmol/L·min降低到1146mmol/L·min。在单次口服糖耐量实验中多肽能够降低小鼠的血糖水平和AUC120min值，达到了显著差异，显示出其在控制血糖方面的潜力，在长期实验中可能有更优秀的表现。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种茶叶多肽在制备抗II型糖尿病药物或保健品中的应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

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<212> PRT

<213> 茶叶

<400> 1

Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg

1 5 10