炎症抑制因子Numbl在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种炎症抑制因子Numbl作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。
背景技术：
：糖尿病是一组由多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，其是由胰岛素分泌不足和（或）作用缺陷所引起。糖尿病主要分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病等。其中，Ⅱ型糖尿病最多见，约占总糖尿病患者的90%-95%。当前，全世界的糖尿病患病率、发病率以及糖尿病患者数量急剧上升。且随着我国经济的高速发展、生活方式西方化和人口老龄化，肥胖率上升，我国糖尿病患病率也呈快速增长趋势：现成年人糖尿病患病率达9.7%，而糖尿病前期的比例更高达15.5%。更为严重的是我国约有60%的糖尿病患者未被诊断，且已接受治疗的患者，糖尿病控制的状况也不理想。因此，对糖尿病的防治是非常迫切的。非酒精性脂肪肝病是指除外酒精和其他明确肝损伤因素，以肝脏细胞发生脂肪变性和脂质积聚为主要病理特征的慢性肝脏疾病，其也是代谢综合征的肝脏表现。非酒精性脂肪肝病是肝酶异常和慢性肝病最常见的原因。在我国，随着生活水平得到改善，饮食结构发生改变，非酒精性脂肪肝病的发病率日益上升，且呈低龄化趋势，其已成为仅次于病毒性肝炎的第二大慢性肝病。虽然有许多治疗方法对非酒精性脂肪肝病患者有益，但是仍无确切的治疗药物。研究结果显示，在糖尿病人群中，非酒精性脂肪肝患病率可高达80%[1]。在有些患者中，肝脏脂肪沉积可能是影响其Ⅱ型糖尿病发展的主要因素[2]。另一方面，如果Ⅱ型糖尿病控制不佳或充分发展，不仅促进脂肪肝生成，而且使肝损伤加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维变性、肝硬化及肝细胞癌[3]。这些均启示着在临床上不能将这两个疾病孤立看待，Ⅱ型糖尿病与非酒精性脂肪肝是互为发生、相互作用的，可能存在潜在的共同机制。Numbl基因与Numb基因有高度的同源性，因此称为Numb-like基因。Numbl基因和Numb基因在结构上都含有磷酸络氨酸结合结构域（PTB），因此其都可通过减弱下游信号通路和减少Notch细胞内结构域的数量来拮抗Notch信号通路；他们都在神经发生和形成中发挥重要作用，如在胚胎神经发生中维持神经祖细胞的数量[4-6]；通过调节脑室区神经母细胞的存活和室管膜的完整性来影响脑室区的神经形成；在血管生成、心脏形成和心脏祖细胞分化中发挥重要作用[7、8]；在肿瘤形成和转移中发挥重要作用[9、10]。Numb有富含脯氨酸结构域，而Numbl没有；Numbl有多聚谷氨酰胺结构域，而Numb没有。Numb分布在细胞膜上，而Numb分布在细胞浆中。因Numbl和Numb在结构上的差异和定位上的不同，也导致其发挥的作用也不尽相同[11、12]。目前发现Numbl还可与TAB2和Traf6直接结合，并通过促进Traf6以K48方式连接的多聚泛素化，而不影响Traf6总的泛素化水平及以K63方式连接的多聚泛素化[13、14]等。参考文献（1）FanJG,FarrellGC.Epidemiologyofnon-alcoholicfattyliverdiseaseinchina.JHepatol.2009;50:204-210.（2）LoriaP,LonardoA,AnaniaF.Liveranddiabetes.Aviciouscircle.HepatolRes.2013;43:51-64.（3）CusiK.Treatmentofpatientswithtype2diabetesandnon-alcoholicfattyliverdisease:Currentapproachesandfuturedirections.Diabetologia.2016;59:1112-1120.（4）PetersenPH,ZouK,HwangJK,JanYN,ZhongW.Progenitorcellmaintenancerequiresnumbandnumblikeduringmouseneurogenesis.Nature.2002Oct31;419(6910):929-34.（5）PetersenPH,ZouK,KraussS,ZhongW.ContinuingroleformouseNumbandNumblinmaintainingprogenitorcellsduringcorticalneurogenesis.Natureneuroscience.2004Aug;7(8):803-11.（6）KuoCT,MirzadehZ,Soriano-NavarroM,RasinM,WangD,ShenJ,SestanN,Garcia-VerdugoJ,Alvarez-BuyllaA,JanLY,JanYN.PostnataldeletionofNumb/Numblikerevealsrepairandremodelingcapacityinthesubventricularneurogenicniche.Cell.2006Dec15;127(6):1253-64.（7）vanLessenM,NakayamaM,KatoK,KimJM,KaibuchiK,AdamsRH.Regulationofvascularendothelialgrowthfactorreceptorfunctioninangiogenesisbynumbandnumb-like.Arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology.2015Aug;35(8):1815-25.（8）ZhaoC,GuoH,LiJ,MyintT,PittmanW,YangL,ZhongW,SchwartzRJ,SchwarzJJ,SingerHA,TallquistMD,WuM.Numbfamilyproteinsareessentialforcardiacmorphogenesisandprogenitordifferentiation.Development.2014Jan;141(2):281-95.（9）TaoT,ChengC,JiY,XuG,ZhangJ,ZhangL,ShenA.NumblinhibitsgliomacellmigrationandinvasionbysuppressingTRAF5-mediatedNF-kappaBactivation.Molecularbiologyofthecell.2012Jul;23(14):2635-44.（10）YingjieL,JianT,ChanghaiY,JingboL.Numblikeregulatesproliferation,apoptosis,andinvasionoflungcancercell.Tumourbiology:thejournaloftheInternationalSocietyforOncodevelopmentalBiologyandMedicine.2013Oct;34(5):2773-80.（11）ZhongW,JiangMM,WeinmasterG,JanLY,JanYN.DifferentialexpressionofmammalianNumb,NumblikeandNotch1suggestsdistinctrolesduringmousecorticalneurogenesis.Development.1997May;124(10):1887-97.rogenitorcellmaintenancerequiresnumbandnumblikeduringmouseneurogenesis（12）LiuL,LannerF,LendahlU,DasD.NumblikeandNumbdifferentiallyaffectp53andSonicHedgehogsignaling.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2011Sep30;413(3):426-31.（13）MaQ,ZhouL,ShiH,HuoK.NUMBLinteractswithTAB2andinhibitsTNFalphaandIL-1beta-inducedNF-kappaBactivation.Cellularsignalling.2008Jun;20(6):1044-51.（14）ZhouL,MaQ,ShiH,HuoK.NUMBLinteractswithTRAF6andpromotesthedegradationofTRAF6.Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications.2010Feb12;392(3):409-14。技术实现要素：为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种炎症抑制因子Numbl基因的表达与脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因Numbl的新用途，进而把Numbl基因应用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治疗。本发明的目的通过以下技术方案实现：本发明以野生型C57小鼠与肝脏细胞特异性Numbl基因敲除小鼠（简称Numbl-LKO）为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型（dietinducedobesity，DIO）研究Numbl基因的功能，结果发现与野生型WT小鼠对比，肝脏细胞特异性Numbl基因敲除小鼠表现出肥胖，其体重、空腹血糖水平及胰岛素水平明显高于同种饲料饲养的WT小鼠。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现肝脏细胞特异性Numbl基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。小鼠肝脏重量和肝脏/体重比以及脂质成分含量测定的结果等均说明HFD组（Highfatdiet，高脂饮食）的Numbl-LKO小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加。这表明肝脏细胞特异性Numbl基因敲除会加剧脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生，肝脏细胞特异性Numbl基因能够抑制脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生。本发明人的研究证明了：在高脂诱导的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，Numbl具有抑制肥胖，降低血糖，减少肝脏脂质蓄积，特别是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。针对Numbl的上述功能，提供Numbl作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。针对Numbl的上述功能，提供Numbl作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。以上药物是指能够促进Numbl基因表达的药物。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：（1）本发明发现Numbl基因的新功能，即Numbl基因具有能够保护脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。（2）基于Numbl在保护脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。附图说明图1是肝脏特异性Numbl基因敲除小鼠构建策略图。图2是WT和Numbl-LKO小鼠的体重、空腹血糖和空腹胰岛素结果图；A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图，C为空腹胰岛素水平统计图（*：p＜0.05vsWTNC组，**：p＜0.01vsWTNC组，#：p＜0.05vsWTHFD组，##：p＜0.01vsWTHFD组）。图3是WT和Numbl-LKO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积（areaunderthecurve，AUC）比较图（**：p＜0.01vsWTNC组，##：p＜0.01vsWTHFD组）。图4是Numbl-LKO和WT小鼠的肝脏重量和肝脏脂质含量；A为肝脏重量、肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图，B为肝脏甘油三酯、肝脏胆固醇和肝脏游离脂肪酸统计柱状图（##：p＜0.01vsWTHFD组）。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。实验用动物及饲养：实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6小鼠（WT）和Numbl肝脏特异性基因敲除（Numbl-LKO）小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司，Numbl肝脏特异性基因敲除小鼠（Numbl-LKO）由Numbl-floxed小鼠与受蛋白启动子控制、肝细胞特异性表达的Cre转基因小鼠Albumin-Cre（购自TheJacksonLaboratory，货号003574）杂交得到，构建策略见图1。肝脏特异性Numbl基因敲除小鼠的构建：根据基因信息，利用CRISPRDesign（网址：http://crispr.mit.edu/）分别在内含子2和3中各设计一个CRISPR的打靶位点。靶序列分别为：Numbl-sgRNA1:TTTAGAGTTTTAGACGTCCAGGGNumbl-sgRNA2:AGCACATTGCCTGCACACGCTGG此外还设计了一个用于同源修复的供体质粒（DonorVector），它包括两侧同源臂、中间的外显子3以及两个同向的loxp序列。①打靶载体的构建：分别将sgRNA1和sgRNA2对应的两条引物融合成双链DNA，然后用T4DNA连接酶连入经过限制性内切酶BsaI处理过的pUC57-sgRNA载体中。该载体上游有一个T7启动子，可以用于后续的体外转录实验。②条件性敲除骨架载体pBluescriptSK(+)-2loxp的构建：分别合成4条寡聚单链核苷酸序列：loxp1-F：AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT，loxp1-R：ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；loxp2-F：GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA，loxp2-R：CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2两条双链。将pBluescriptIISK(+)载体用HindIII（NEB，R0104L）和EcoRV（NEB，R0195L）双酶切后连接入loxp1退火双链，再将测序正确的载体用BamHI（NEB，R0136L）和SpeI（NEB，R0133L）双酶切，连接入loxp2退火双链，得到条件性敲除骨架载体，命名为pBluescriptSK(+)-2loxp。供体载体（DonorVector）的构建：根据引物设计原则，设计如下引物（表1）用于扩增供体载体的左右同源臂（LA和RA）以及中间的外显子部分（M）。扩增得到的产物经表1中所示限制性内切酶酶切后得到3个片段，将其分别连入条件性敲除骨架载体pBluescriptSK(+)-2loxp中，得到DonorVector。引物名称引物序列酶切位点NumblLA-FCCGCTCGAGCCAAAGAATGACCTGGGAAAXhoINumblLA-RCCCAAGCTTCCAGGGTTTGAATGGGAAGAHindIIINumblM-FTCTACCGGTACGTCTAAAACTCTAAAGCCCATGAgeINumblM-RACGCTTAAGCGCTGGGCCTCACACTCAflIINumblRA-FCGACGCGTTGTGCAGGCAATGTGCTTACMluINumblRA-RATAAGAATGCGGCCGCGAGGAAACGGGAGACACAGANotI表1构建供体载体所需引物序列及对应酶切位点打靶载体的转录：对CRIPR/Cas9系统包含的两个部分（负责切割作用的Cas9蛋白和引导Cas9蛋白定位到靶位点的gRNA）分别进行转录。对于Cas9蛋白，将其表达载体（pST1374-Cas9）用PmeI进行酶切，以纯化后回收线性化质粒为转录模板，用T7mMESSAGEmMACHINE试剂盒（AM1345，Ambion）进行体外转录，获得加帽的mRNA产物。并用Poly(A)Tailing试剂盒（Ambion）对上述产物加尾，获得成熟的mRNA产物；对于sgRNA，使用MEGAshortscript™Kit（AM1354，Ambion公司）进行体外转录。将转录得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasyMicroKit（Qiagen，217084）进行纯化。Numbl-floxed条件性敲除小鼠的制作将上述成熟的mRNA产物与供体质粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠体内进行培育。得到的小鼠进行鉴定。取出生一周后的小鼠脚趾或尾部组织，提取基因组，并通过PCR方法筛选阳性首建鼠。从确定发生同源重组的小鼠中随机挑选一只作为F0代进行后续的繁殖，最终获得Numbl-floxed纯合小鼠。肝脏特异性Numbl基因敲除小鼠的制作将上述Numbl-floxed小鼠与肝脏特异性Albumin-Cre转基因小鼠交配，筛选得到Numblfloxed/floxed/ALB-Cre小鼠，待该小鼠长至6周龄左右后，腹腔注射Tamoxifen，诱导Cre酶的表达，Cre酶特异性的识别两个同向的loxp，并切除两者之间的序列及其中的一个loxp，最后得到肝脏细胞特异性Numbl基因敲除小鼠。实验动物饲料配方：高脂饲料（HFD）（购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942）：热量百分比：蛋白质:20%；碳水化合物:20%；脂肪:60%，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料（NC）（购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B）：热量百分比：蛋白质:20%；碳水化合物:70%；脂肪:10%，总的热量质量比:3.85kcal/g。饲养环境及条件：SPF级实验动物中心，室温在22-24℃之间，湿度在40-70%之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。【实施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型（dietinducedobesity，DIO）获得（1）实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和Numbl-LKO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂饲料（Normalchow，NC）饲养，即WTNC组，LKONC组，WTHFD组，LKOHFD组共4个组别。（2）模型通过高脂饲料诱导操作流程：采用WT和LKO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确Numbl基因对脂肪肝、Ⅱ型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和Numbl-LKO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料（Highfatdiet，HFD）和D12450B低脂饲料（Normalchow，NC）饲养，即WTNC组，LKONC组，WTHFD组，LKOHFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔1周检测1次。实验第10周，进行腹腔注射葡萄糖实验（IPGTT），以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力，第12周终末取材。【实施例2】小鼠体重、血糖水平测定（1）小鼠空腹体重检测1）体重检测。①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食（不禁水），下午2:00开始实验操作。②称重：分别在第0周、2周、4周、6周、8周、10周和12周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。（2）空腹血糖水平检测实验将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食（不禁水），即禁食6小时后开始实验操作。①血糖仪准备：检查血糖仪（美国强生公司，ONETOUCH）电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。（3）空腹血清胰岛素水平检测①试剂及耗材准备：样品（冰冻血清），去离子水一瓶（1000mL），小鼠胰岛素ELISA试剂盒（Millipore，货号EZRMI-13K）含胰岛素ELISA酶标板（1块，储存于2-8℃）、酶标板封口膜（1片）、10×HRP洗脱缓冲液（2瓶，每瓶50mL,使用前使用去离子水稀释10倍）、胰岛素标准品（浓度为：0.2，0.5，1，2，5，10ng/mL，每种量为0.25mL）、胰岛素质量对照buffer（0.25mL）、基质溶液（0.5mL）、分析缓冲液（20mL）、胰岛素检测抗体（10mL）、酶溶液（12mL）、底物（12mL）、终止溶液（12mL）。②实验步骤：A.确认温箱开启，熟悉酶标仪操作，将待检测的血清标本从-80℃冰箱中找出；B.将待检测的血清在室温下复融至液态，准备检测；C.稀释10×HRP洗脱缓冲液，每瓶用450mL去离子水稀释；D.将取下来的酶标板条安装到一个空的酶标板架上300μLTBS洗脱缓冲液洗涤3次。洗涤完毕将酶标板倒扣在吸水纸上，轻轻拍几次，将残液吸净（注意：在进行下一步之前避免酶标板干燥，将未使用的酶标板条密封在装酶标板的袋子里，2-8℃保存）；E.将10μL分析缓冲液加入非特异性孔(NSB)和所有的样品孔；F.在NSB孔，标准孔和对照孔加入10μL基质溶液；G.在预设的标准孔里加入10μL胰岛素标准品；H.在预设的质量对照孔里加入胰岛素质量对照buffer1和2各10μL；I.在每个样品孔里加入10μL样品；J.每孔中加入80μL胰岛素检测抗体（以上所有加样步骤在1个小时之内完成，室温孵育2小时，在此期间将酶标板至于酶标板振荡器上，调整转速为400-500rpm震荡）；K.取下封口膜，弃去液体，在吸水纸上轻轻拍打，吸净残液；L.使用洗脱缓冲液洗板3次，每次300μL，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液；M.每孔加入酶溶液100μL，封口膜封口后，室温下酶标板振荡器震荡30分钟，取下封口膜，弃去溶液，拍打吸干；N.使用洗脱缓冲液洗板6次，每次300μL，每次洗板完毕都用吸水纸吸去残液加入100μL底物溶液，酶标板震荡器上震荡15分钟左右。此时可以看到标准孔出现深浅渐变的蓝色。（注意：在这一步，蓝色的出现和进展可能明显快于15分钟，也可能明显慢于15分钟，取决于室温温度。请通过视觉来判断孵育的时间。或者使用酶标仪370nm波长检测，读数在1.2到1.8之间，则为合适的孵育时间）O.加入100μL终止溶液，震荡酶标板确保充分的混匀，此时蓝色变为黄色。5分钟内在450nm和590nm处分别读取吸光值。根据测定的标准曲线，通过吸光值换算出浓度。Ⅱ型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖和胰岛素等水平，体重、血糖、胰岛素水平变化结果如图2所示，WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第4周开始体重明显高于其NC饲料组，给与Numbl-LKO小鼠12周的HFD饲料和NC饲料饲养后，从第6周开始HFD组的Numbl-LKO小鼠体重明显高于HFD组的WT小鼠体重，一直持续到第12周（见图2A）；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第2周、4周、6周、8周、10周和12周的空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的Numbl-LKO小鼠空腹血糖水平也明显高于WT组（见图2B）；经空腹胰岛素检测发现在HFD组的小鼠在第12周的空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的Numbl-LKO小鼠空腹胰岛素水平也明显高于WT组小鼠（见图2C）。以上结果表明肝脏细胞特异性Numbl基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，即Numbl基因能显著提高小鼠的糖代谢能力。因此，Numbl基因在高脂诱导引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。【实施例3】葡萄糖耐量实验（intraperitonealglucosetolerancetest，IPGTT）实验第10周，进行腹腔注射葡萄糖实验（IPGTT），以评价小鼠机体对糖耐受能力。（1）在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。（2）先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。（3）腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。（4）分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验（intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT）来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第10周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和Numbl-LKO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平（0分钟时血糖），在2小时时恢复至空腹血糖水平；且在HFD组，Numbl-LKO小鼠血糖水平一直高于WT小鼠的血糖水平（图3A）。比较各组小鼠血糖曲线下面积（areaunderthecurve，AUC），发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，Numbl-LKOHFD组的AUC显著大于WTHFD组的AUC（图3B），表明Numbl对维持糖代谢稳态具有强大的调控能力。【实施例4】肝脏质量及肝脏组织脂质成分测定（1）终末肝脏组织取材1）小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。2）用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。3）迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速称重。（2）肝脏脂质成分测定①从-80℃冰箱取出肝脏组织样品，称量50mg组织，使用研磨器将肝脏组织研磨成粉末状，溶于1mLPBS中，混匀后再与1mL氯仿/甲醇（2:1）共孵育过夜。②以12000g高速离心15min后，收集管底脂质层物质，风干，以去除水分。③将分离出的脂质层物质溶于200μL含1%TritonX-100的PBS溶液中，仔细吹吸混匀。④开启电脑labman软件，打印机，再开启生化分析仪；⑤选择并清洗检测探针、比色杯等，保证探针通畅、比色杯无杂质附着，吸光值在设定的参考范围；⑥在labman软件上检查所需检测指标试剂是否足够，设定检测指标和检测顺序等。⑦将制得的混匀液上机检测，分析。在HFD组的Numbl-LKO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠高（如图4A）。对肝脏中的甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸进行检测，发现在HFD组的Numbl-LKO小鼠肝脏中的甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸均较HFD组的WT小鼠高（如图4B）。这些结果说明肝脏细胞特异性Numbl基因敲除小鼠的脂肪肝明显恶化。上述结果显示Numbl-LKO小鼠在HFD的诱导下发生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病变显著加重。这些结果表明Numbl基因对改善Ⅱ型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明Numbl基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。SEQUENCELISTING<110>武汉大学<120>炎症抑制因子Numbl在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>23<212>DNA<213>Numbl-sgRNA1<400>1tttagagttttagacgtccaggg23<210>2<211>23<212>DNA<213>Numbl-sgRNA2<400>2agcacattgcctgcacacgctgg23<210>3<211>54<212>DNA<213>loxp1-F<400>3agcttgacgtcataacttcgtatagcatacattatagcaatttataccggtgat54<210>4<211>50<212>DNA<213>loxp2-<400>4atcaccggtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatgacgtca50<210>5<211>52<212>DNA<213>loxp2-F<400>5gatcccttaagataacttcgtatagcatacattatagcaatttatacgcgta52<210>6<211>52<212>DNA<213>loxp2-R<400>6ctagtacgcgtataaattgctataatgtatgctatacgaagttatcttaagg52<210>7<211>29<212>DNA<213>NumblLA-F<400>7ccgctcgagccaaagaatgacctgggaaa29<210>8<211>29<212>DNA<213>NumblLA-R<400>8cccaagcttccagggtttgaatgggaaga29<210>9<211>33<212>DNA<213>NumblM-F<400>9tctaccggtacgtctaaaactctaaagcccatg33<210>10<211>26<212>DNA<213>NumblM-R<400>10acgcttaagcgctgggcctcacactc26<210>11<211>28<212>DNA<213>NumblRA-F<400>11cgacgcgttgtgcaggcaatgtgcttac28<210>12<211>36<212>DNA<213>NumblRA-R<400>12ataagaatgcggccgcgaggaaacgggagacacaga36当前第1页1 2 3