一种金钗石斛生物总碱的应用的制作方法

本发明涉及一种金钗石斛生物总碱的应用，具体属于医药技术领域。

背景技术：

肝脏疾病是一类严重危害人类健康的疾病，发病率高，包括病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝、酒精肝、药物性肝病、遗传性肝病等，这些肝病在急性起病、慢性急性发作病程中易出现肝损伤，尤其是急性肝损伤。目前尚无急性肝损伤的统一定义，广义而言，任何原因导致肝功能指标异常，均提示肝损伤(美国国家临床学会推荐，ALT、AST高于正常限值，可考虑急性肝损伤)。引起急性肝损伤的常见原因有：1、感染：以各型肝炎病毒常见，其次非肝炎病毒；2、药物中毒：对乙酰氨基酚、四氯化碳、酒精等；3、缺血或充血性循环障碍：心包积液、心衰、休克等；4、免疫功能失调：多见自身免疫性肝炎；5、代谢性疾病：妊娠急性脂肪肝、肝豆状核变核、遗传性高酪氨酸血症等；其它如肝脏肿瘤、肝硬化等。我国是一个肝病大国，肝病的发病率居世界第3位。

急性肝损伤是临床常见的肝病，病情进一步进展可出现肝功能障碍、肝性脑病，严重者可出现死亡。因此，急性肝损伤早期诊断、早期治疗是成功的关键。目前针对肝病损伤的治疗主要是药物治疗，临床上保肝药物有门冬氨酸钾镁、还原性谷胱甘肽、硫普罗宁、甘草酸二胺等，保肝作用机制与抗炎、保护肝细胞膜及代谢有关，上述药物使用中，存在个体差异大，使用后部分病人会出现血压改变、腹胀、皮疹、发热、恶心、呕吐等胃肠不良反应。随着一些新型抗病毒、免疫调控剂、细胞因子的使用，肝病的治疗近年得到一定的发展，但仍存在着价格昂贵、个体差异大等问题，限制了其在临床肝病治疗中的应用。我国传统中医药在治疗肝脏疾病方面有着丰富的经验积累。大量的研究证明中草药在抗肝细胞损伤治疗中具有良好的效果和独特的优势。

我国中草药资源丰富，不良反应少等优点，而且有多环节、多层次、多靶点综合作用的特点，在治疗肝病方面具备独特的优势。因此从传统的中草药中寻找高效、低毒治疗肝脏疾病的新型药物已成为研究的热点。

金钗石斛(Deudrobium nobile Lindl)为兰科石斛属植物，是一味我国多部医书上均有记载的名贵中药材，享有“仙草”的美誉。其化学成分主要有生物碱类、酚类、多糖、菲类等，生物碱和多糖是主要的药理活性成分。现代药理研究表明，石斛具有降脂，降低血压，调节免疫等作用。现有技术中，未见金钗石斛生物总碱用于制备治疗预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物的相关报道。

技术实现要素：

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种金钗石斛生物总碱的应用，即将金钗石斛生物总碱应用于制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

金钗石斛生物总碱在制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中的应用。

前述金钗石斛生物总碱的应用中，金钗石斛生物总碱制备方法之一，是通过以下步骤制备：取金钗石斛药材粉碎至粗粉，用乙醇常温浸提，得浸提液后过滤，减压回收乙醇，挥干至浸膏无醇味，随后加入盐酸充分溶解，用石油醚萃取后，调节pH，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，即得。

具体地，前述金钗石斛生物总碱的应用中，金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛药材粉碎至粗粉，用质量为粗粉质量10～12倍量的95％乙醇常温浸提3～4次，每次15～20天，合并浸提液后过滤，减压回收乙醇，挥干至浸膏无醇味，随后加入体积为浸膏体积3～5倍量的质量浓度为5％的盐酸充分溶解，用石油醚萃取后，调节pH至9～11，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，即得。

优选地，前述金钗石斛生物总碱的应用中，金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛药材粉碎至粗粉，用用质量为粗粉质量10倍量的95％乙醇常温浸提四次，每次20天，合并浸提液后过滤，减压回收乙醇，挥干至浸膏无醇味，随后加入体积为浸膏体积3倍量的质量浓度为5％的盐酸充分溶解，用石油醚萃取后，调节pH至10，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，即得。

前述金钗石斛生物总碱的应用中，金钗石斛生物总碱制备方法之二，是通过以下步骤制备：取金钗石斛茎粗粉，加乙醇浸泡后，煮沸提取，过滤，将滤液浓缩成浸膏，用盐酸水溶液溶解，过滤，滤液过阳离子交换树脂(732，氢型，径高比1:8)，用去离子水洗脱杂质，再用酸性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，加碱中和，经脱盐处理，冷冻干燥，即得纯度较高的金钗石斛生物总碱提取物。

具体地，前述金钗石斛生物总碱的应用中，金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛茎粗粉，加质量为粗粉质量10～12倍量的90％乙醇浸泡12～16小时，煮沸提取2～4次，每次2～3小时，过滤，将滤液合并浓缩成浸膏，合并的滤液体积是浸膏体积的120倍；随后用pH为3.5盐酸水溶液溶解，过滤，滤液过阳离子交换树脂，用去离子水洗脱杂质，再用酸性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，加碱中和，经脱盐处理，冷冻干燥，即得纯度较高的金钗石斛生物总碱提取物。

优选地，前述金钗石斛生物总碱的应用中，金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛茎粗粉，加质量为粗粉质量10倍量的90％乙醇浸泡12小时，煮沸提取3次，每次2小时，过滤，将滤液浓缩成浸膏，用pH为3.5盐酸水溶液溶解，过滤，滤液过阳离子交换树脂，用去离子水洗脱杂质，再用酸性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，加碱中和，经脱盐处理，冷冻干燥，即得纯度较高的金钗石斛生物总碱提取物。

采用本发明的两种金钗石斛生物总碱制备方法，与ZL200910301762.4中方法相比，所得金钗石斛生物总碱量提升15-20％。

前述金钗石斛生物总碱的应用中，药物是以金钗石斛生物总碱作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的片剂、胶囊剂、颗粒剂、软胶囊、滴丸剂、糖浆剂、舌下含片或注射剂。

前述金钗石斛生物总碱的应用中，片剂通过以下步骤制备：采用湿法制粒压片，按照重量份数计，将金钗石斛生物总碱干燥粉1份与淀粉3份混匀，加入质量分数为10％的淀粉浆制软材，淀粉浆中含有质量分数为1％的枸橼酸，使之轻握成团、轻压即散，过16目筛制粒，将湿粒于40℃～60℃干燥，用16目筛整粒，并加入质量为制得颗粒质量5％的滑石粉混匀后，直接压片即得。

前述金钗石斛生物总碱的应用中，胶囊剂通过以下步骤制备：将金钗石斛生物总碱干燥粉末和质量为干粉质量5倍的可溶性淀粉混匀，过100目筛后，手工填充至5号胶囊内即得。

前述金钗石斛生物总碱的应用中，颗粒剂通过以下步骤制备：按照重量份数计，取金钗石斛生物总碱干燥粉1份、蔗糖粉3份和糊精1.25份混匀，加入60％乙醇制软材，使之轻握成团、轻压即散，过16目筛制粒，60℃-80℃干燥，用16目筛整粒，密封即得。

为了确保本发明技术方案的科学、有效，发明人进行了一系列的实验。

一、金钗石斛生物总碱的制备方法

1、实验材料和仪器

1.1、药材与试剂

药材购自赤水金钗石斛，经鉴定为金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.的干燥茎。冰醋酸(分析纯，上海申博化工有限公司，批号1202101)，甲基红(C₁₅H₁₅N₃O₂:上海三爱思试剂有限公司)，溴甲酚绿(C₂₁H₁₄Br₄O₅S：上海三爱思试剂有限公司)，二氯甲烷(重庆川江化学试剂厂，批号:20030106)，其他生物碱通用显色剂(碘化铋钾、稀碘化铋钾、改良碘化铋钾)均为分析纯，石油醚(30-60℃)等。

1.2、主要仪器

Q-Exactive高性能台式四级杆-轨道阱UPLC-MS/MS(HESI离子源)系统(美国Thermo公司)；Genius 1022液氮发生器(英国PEAK公司)；MILLI-Q超纯水纯化系统(美国Millipore公司)；循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；天平(万分之一，上海良平仪表有限公司)等。

2方法与结果

2.1金钗石斛生物总碱的提取

称取干燥金钗石斛药材粉碎至粗粉，用质量为粗粉质量10倍量的95％乙醇溶剂常温浸提四次，每次20d，合并浸提液，过滤，旋转蒸发仪减压回收乙醇，挥干至浸膏无乙醇味。所得浸膏加入体积为浸膏体积3倍量体积的5％盐酸充分溶解，用石油醚萃取后，酸液加碳酸钠碱化至pH 10，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，得总生物碱供试品。同时称重，并计算得率。第一批药材10Kg，得总生物碱提取物干膏50g；第二批药材10Kg，得金钗石斛生物总碱提取物干膏49.4g。

取金钗石斛茎粗粉，加质量为粗粉质量10倍量的90％乙醇浸泡12小时，煮沸提取3次，每次2小时，过滤，将滤液合并浓缩成浸膏，合并的滤液体积是浸膏体积的120倍；随后用pH为3.5盐酸水溶液溶解，过滤。滤液过阳离子交换树脂(732，氢型，径高比1:8)，用去离子水洗脱杂质，再用酸性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味。加碱中和，经脱盐处理，冷冻干燥，得纯度较高的金钗石斛生物总碱提取物。

二、DNLA对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠模型的影响

1、实验材料

1.1、主要仪器

721型紫外-可见分光光度计(上海申化仪表自控公司)，-80℃低温冰柜(日本三洋公司)，Milli QA纯水处理器(Millipore公司)，3K30型高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，BSS－110电子分析天平(北京赛多利斯电子天平有限公司)，SHHW电热恒温三用水浴锅(北京永光明医疗仪器厂)，Leica细胞图像仪(德国Leica Microsystems Ltd)等。

1.2药品与试剂

金钗石斛总生物碱(DNLA)由遵义医学院药理重点省部共建教育部实验室提供(含量为89.5％)，临用前用1％吐温-80助溶后配成所需浓度。CCL₄分析醇(重庆市九龙化学试剂厂)，花生油，考马斯亮兰、牛血清白蛋白(Solarbio公司)，TNF-a(ELISA)试剂盒(Biotechnology systems)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3、实验动物

C57小鼠，6～8周龄，SPF级，雄性，体重18±4g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供(许可证：2012-0011)。饲养环境安静，室温22-23℃，光照/暗时间为12/12h循环，各组实验小鼠自由进食、饮水。

2、实验方法

2.1、动物分组、给药和制模

C57小鼠40只，随机分为4组，每组10只，即空白组(双蒸水+1％吐温-80)，模型组(双蒸水+1％吐温-80)，DNLA低剂量(10mg/kg)、DNLA高剂量组(20mg/kg)。采用灌胃给药(0.1mL/10g，每10g小鼠体重给药0.1mL)，每天1次，连续给药7天后，除空白组外，均腹腔注射CCl₄制小鼠急性肝损伤模型。实验前小鼠禁食12小时，自由饮水。除空白组以溶媒(玉米油)注射，其余各组0.1mL/10g剂量腹腔注射0.2％CCl₄溶液建立急性肝损伤模型。于制模24小时后称小鼠体重，取血，切取肝组织用于相关指标检测。

2.2、小鼠肝脏湿重指数的测定

小鼠处死前称重，处死后取出肝脏，称重，肝脏指数＝肝脏重(g)/小鼠体重(g)×100％2.3、小鼠血清中ALT及AST活性检测

小鼠眼眶取血，分离血清，采用全自动生化仪测定血清中ALT(丙氨酸氨基转移酶)、AST(天门冬氨酸氨基转移酶)活性。

2.4、小鼠肝脏组织形态学观察

取各小鼠相同部位肝组织固定于4％甲醛溶液中，常规石蜡包埋切片、苏木精-伊红染色(Hemaltoxylin and eosin，HE)，光镜下观察并拍照。

2.5、肝脏组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

称取肝组织块0.3～0.5g放入10mL的小烧杯里加入预冷的生理盐水，研磨制成10％的肝组织匀浆。低温高速离心机3000r/min离心10min，吸取上清液，待检。

2.6、肝组织蛋白含量的测定

10％肝组织匀浆液用生理盐水稀释成1％，用移液枪吸取此稀释液200μL于5mL具塞试管中，加入0.1mg/mLBrandford显色剂4.0mL，用漩涡混匀器混匀，以蒸馏水同法为空白，在室温放置5min后在595nm处测定吸收度值，代入回归方程计算蛋白含量。

2.7、肝组织中丙二醛含量的测定

原理：MDA可与硫代巴比妥酸结合，形成红色产物。此红色产物在532nm处有最大吸收峰。实验取10％的肝组织匀浆，按下列表1中步骤加样：

表1肝组织蛋白含量的测定

旋涡混匀器充分混匀，95℃水浴40min，取出后流水冷却，然后3500r/min，离心10min，取上清液，532nm处，1cm光径比色杯，蒸馏水调零，测各管OD值。根据下列公式(1)计算MDA值。

MDA(nmol/mgprot)＝(测定管OD值－标准空白管OD值)/(标准管OD值－标准空白管OD值)×标准管溶度(nmol/mL)/样品蛋白含量(mg/mL)式(1)

2.8、肝组织总超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定

原理：超氧化物歧化酶对超氧阴离子自由基具有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，而亚硝酸盐在显色剂作用下呈现紫红色，可测定吸光度求出其活力。按试说剂盒操作方法进行。并根据下列公式(2)计算SOD值。

SOD(U/mgprot)＝(对照管OD值－测定管OD值)/对照管OD值/50％×反应液总体积/取液量(mL)/样品蛋白含量(mg/mL)式(2)

2.9、Real-time PCR检测肝组织中Nrf2，Nqo1，Ho-1基因表达

取相同部位肝脏组织50-100mg置于1mL Trizol中，提取总RNA，测定其浓度，按照试剂盒说明书提取并纯化RNA，并分别在260-280nm处测其吸光度，A260/A280比值在1.8-2.0范围内表示纯度较理想。逆转录为cDNA后采用荧光定量PCR法检测Nrf2，Nqo1，Ho-1基因的表达，引物序列见表2。

表2实时荧光定量PCR引物序列

3、结果

3.1、DNLA对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠模型肝指数影响

实验结果表明：与空白组比较，CCl₄模型组小鼠的肝脏湿重指数明显增高(P<0.05)。与模型组比较，DNLA低、高剂量组肝脏系数明显减少(P<0.05)；DNLA低剂量组肝脏系数与模型组相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。结果见表3。

表3对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠肝脏指数的影响(Mean±SE)

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05，

3.2、DNLA对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响

结果显示，模型组与空白组比较，小鼠血清中ALT、AST活性均明显升高(P<0.05)；与模型组比较，DNLA各给药组均明显降低CCl₄所致肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性(P<0.05)，结果见表4。

表4 DNLA对CCl₄所致肝损伤小鼠血清中ALT、AST活性的影响(n＝10)

注：与空白组比较，^#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05

3.3、DNLA对急性肝脏损伤小鼠肝组织病理学的影响

肝脏组织切片，HE染色，光镜下观察，空白组可见小鼠的肝脏结构正常，细胞膜完整，肝索排列规则。模型组见中央静脉向四周呈片状病灶性坏死，中央静脉和汇管区出现弥漫性炎细胞浸润，肝小叶结构被破坏。DNLA给药组的肝组织病灶性坏死消失，肝小叶结构基本完整，炎症细胞浸润明显减轻，仅见中央静脉周围细胞轻微水肿(见图1)。

3.4、DNLA对CCL4诱导的急性肝损伤小鼠肝组织中MDA含量、SOD活性的影响

与空白对照组比较，肝损伤模型组MDA含量明显升高(P<0.01)，SOD活性明显降低(P<0.01)；与模型组比较，DNLA高、低剂量组均能显著降低肝匀浆MDA含量(P<0.01)；SOD活性均明显升高(P<0.01)，结果见表5。

表5 DNLA对CCl₄诱导的急性肝损伤小鼠肝组织中MDA含量和SOD活性的影响(Mean±SE)

注：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05，**P<0.01

3.5、DNLA对急性肝损伤小鼠肝组织中Nrf2，Nqo1，Ho-1mRNA表达的影响

结果显示，模型组Nrf2，Nqo1，Ho-1mRNA的表达明显低于空白组(P<0.05)，DNLA给药组Nrf2，Nqo1，Ho-1mRNA表达显著高于模型组(P<0.05)，结果见图2-4。

三、DNLA对D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤小鼠模型影响

1、材料和方法

实验材料、分组及给药方法同第二项。造模的方法为腹腔注射6.5％D-半乳糖胺溶液10mL/kg，造模24h后眼眶取血，分离血清，测定ALT、AST测定，计算肝脏系数。

2、实验结果

结果显示，与空白组比较，模型组血清中ALT、AST显著高于空白组(P<0.01)；与模型组比较，DNLA低、高剂量组ALT、AST值明显低于肝损伤模型组(P<0.05，(P<0.01)。提示DNLA对D-半乳糖胺肝损伤引起的小鼠血清ALT、AST升高具有明显的抑制作用。肝脏系数各组间无明显差异(P>0.05)。结果见表6。

表6 DNLA对D-半乳糖胺肝损伤小鼠血清ALT、AST和肝脏系数的影响(n＝10，χ±s)

注：与空白组比较:**P<0.01；与模型组比较:^#P<0.01。

四、对酒精诱导的急性肝损伤小鼠模型的影响

1、材料和方法

分组与给药方法同第二项，造模的方法是每天下午灌胃给予56度的北京二锅头0.1mL/10g，连续7d。造模24h后眼眶取血，分离血清，测定ALT、AST和计算肝脏系数。

2、实验结果

结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT、AST显著高于空白组(P<0.05)；与模型组比较，DNLA给药组小鼠血清ALT、AST值均明显低于肝损伤模型组(P<0.05)。提示DNLA对酒精所致肝损伤小鼠血清转氨酶升高具有明显的抑制作用，但肝脏系数各组间无明显差异(P>0.05)，结果见表7。

表7 DNLA对酒精肝损伤小鼠血清ALT、AST活性和肝脏系数的影响(n＝10，χ±s)

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较#P<0.05

五、DNLA对CCl₄所致的慢性肝损伤大鼠模型的影响

1、实验材料

1.1、实验动物：雄性SD(Spragye-Dawley)大鼠，清洁级，月龄3-4月，体重约160-180g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供(许可证：SCXK-军2007-017)。

1.2、药品和试剂及设备同第二项。

2、实验方法

2.1、实验分组和给药：

健康SD大鼠80只，雌雄兼用，体重180±10g，饲养温度18～25℃，在实验环境下喂养一周后，将大鼠随机分为6组，每组10只，即空白对照组，模型组，金钗石斛生物总碱低、中、高剂量组，阳性对照组。每天上午分别灌胃浓度为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg，空白对照组及模型组每天均灌胃蒸馏水，阳性对照组每天灌胃联苯双酯100mg/kg。

2.2、模型制作：

实验第1天，除空白对照组外其余各组均皮下注射40％CCl₄植物油溶液5ml/kg，以后每隔3－4天皮下注射3mL/kg。各组均在造模同时开始，连续45天。于第45天用2％戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉后处死动物，检测指标。

2.3、生化指标测定

在全自动生化分析仪上测定血清AST，ALT活性；用黄嘌呤氧化酶法测定组织SOD活性，用硫代巴比妥酸法测定肝组织中MDA含量，肝组织中蛋白含量以考马斯亮蓝法测定，所有的测定方法按试剂盒操作说明进行。

2.4、病理组织切片观察

取大鼠相同部位肝组织，用10％的福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，常规HE染色，光镜下观察肝组织病理学变化。

2.5、数据的统计分析

实验数据用SPSS13.0统计软件统计，所有数据以(Mean±SE)表示，多组间比较采用ONE-WAY ANOVA处理，方差齐使用LSD法，方差不齐Games-Howell法，P<0.05有统计学意义。

3、实验结果

3.1、DNLA对CCl4致慢性肝损伤大鼠血清ALT、AST活性的影响

结果表明，与模型组大鼠血清中ALT、AST活性明显高于正常组(P<0.05)，与模型组比较，DNLA各剂量组(10、20、40mg/kg)均能明显降低大鼠血清ALT、AST活性(P<0.05)，结果见表8。

表8 DNLA对CCl₄所致慢性肝损伤大鼠血清AST和ALT活性的影响(n＝8，x±s)

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较#P<0.05。

3.2、DNLA对CCl₄致大鼠慢性肝损伤肝组织病理学的影响

HE染色，光镜下观察可见，正常对照组小鼠肝组织结构正常，无变性、坏死等病理改变，而CCl₄组大鼠肝组织结构在光镜下可见不同程度的变性与坏死，纤维组织明显增生，其中肝细胞脂肪变性，部分肝细胞有气泡样变，部分肝细胞核大，深染，核分裂像易见等炎性细胞浸润，而DNLA各剂量组的肝细胞坏死，变性及炎性细胞浸润程度均明显减轻。

本发明的有益之处在于：本发明提供的一种金钗石斛生物总碱的应用，即金钗石斛生物总碱在制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中的应用。金钗石斛生物总碱对CCL₄，酒精或D-半乳糖所诱导的急性肝损伤，CCL₄所致的慢性肝损伤均具有防治作用。

(1)对于CCl₄诱导的急性肝损伤，金钗石斛生物总碱使用后能够使得肝脏系数明显减少，明显降低了血清中ALT、AST活性，显著降低肝组织中MDA含量，SOD活性均明显升高，并能明显提高肝组织中Nrf2，Nqo1，Ho-1mRNA表达。通过肝脏组织切片观察，使用金钗石斛生物总碱后，肝组织病灶性坏死消失，肝小叶结构基本完整，炎症细胞浸润明显减轻。

(2)对于酒精诱导的急性肝损伤，金钗石斛生物总碱使用后，降低了血清中ALT、AST值，对酒精所致急性肝损伤血清转氨酶升高具有明显的抑制作用。

(3)对于D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤，金钗石斛生物总碱使用后，降低了血清中ALT、AST值，对D-半乳糖胺肝损伤引起的血清ALT、AST升高具有明显的抑制作用。

(4)对于CCl₄所致的慢性肝损伤，金钗石斛生物总碱施用后，降低了血清中ALT、AST活性，对肝细胞坏死，变性及炎性细胞浸润程度均有明显的减轻作用。

附图说明

图1是本发明的DNLA对小鼠肝组织形态学变化的影响图(HE 200×)；

图2是DNLA对小鼠肝组织中Nrf2表达的影响图()；

图3是DNLA对小鼠肝组织中Nqo1表达的影响图()；

图4是DNLA对小鼠肝组织中Ho-1mRNA表达的影响图()；

图中附图标记的含义：图1：A-空白组，B-模型组，C-DNLA低剂量组(DNLA-L)，D-DNLA高剂量组(DNLA-H)；图2～图4：与空白组比较，#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。

实施例1

金钗石斛生物总碱在制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中的应用。药物是以金钗石斛生物总碱作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的片剂。片剂通过以下步骤制备：采用湿法制粒压片，按照重量份数计，将金钗石斛生物总碱干燥粉1份与淀粉3份混匀，加入质量分数为10％的淀粉浆制软材，淀粉浆中含有质量分数为1％的枸橼酸，使之轻握成团、轻压即散，过16目筛制粒，将湿粒于40℃～60℃干燥，用16目筛整粒，并加入质量为制得颗粒质量5％的滑石粉混匀后，直接压片即得。金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛药材粉碎至粗粉，用质量为粗粉质量11倍量的95％乙醇常温浸提3次，每次18天，合并浸提液后过滤，减压回收乙醇，挥干至浸膏无醇味，随后加入体积为浸膏体积4倍量的质量浓度为5％的盐酸充分溶解，用石油醚萃取后，调节pH至10，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，即得。片剂的用法和用量为：灌胃给药，以金钗石斛生物总碱计，低剂量10mg/kg，高剂量20mg/kg。

实施例2

金钗石斛生物总碱在制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中的应用。药物是以金钗石斛生物总碱作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的胶囊剂。胶囊剂通过以下步骤制备：将金钗石斛生物总碱干燥粉末和质量为干粉质量5倍的可溶性淀粉混匀，过100目筛后，手工填充至5号胶囊内即得。金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛药材粉碎至粗粉，用质量为粗粉质量12倍量的95％乙醇常温浸提3次，每次15天，合并浸提液后过滤，减压回收乙醇，挥干至浸膏无醇味，随后加入体积为浸膏体积5倍量的质量浓度为5％的盐酸充分溶解，用石油醚萃取后，调节pH至9，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，即得。胶囊剂的用法和用量为：灌胃给药，以金钗石斛生物总碱计，低剂量10mg/kg，高剂量20mg/kg。

实施例3

金钗石斛生物总碱在制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中的应用。药物是以金钗石斛生物总碱作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的颗粒剂。颗粒剂通过以下步骤制备：按照重量份数计，取金钗石斛生物总碱干燥粉1份、蔗糖粉3份和糊精1.25份混匀，加入60％乙醇制软材，使之轻握成团、轻压即散，过16目筛制粒，60℃-80℃干燥，用16目筛整粒，密封即得。其中，金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛药材粉碎至粗粉，用用质量为粗粉质量10倍量的95％乙醇常温浸提四次，每次20天，合并浸提液后过滤，减压回收乙醇，挥干至浸膏无醇味，随后加入体积为浸膏体积3倍量的质量浓度为5％的盐酸充分溶解，用石油醚萃取后，调节pH至10，再用二氯甲烷萃取，合并萃取液，减压回收溶剂，即得。颗粒剂的用法和用量为：灌胃给药，以金钗石斛生物总碱计，低剂量10mg/kg，高剂量20mg/kg。

实施例4

金钗石斛生物总碱在制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中的应用。药物是以金钗石斛生物总碱作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的软胶囊。其中，金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛茎粗粉，加质量为粗粉质量11倍量的90％乙醇浸泡16小时，煮沸提取2次，每次2.5小时，过滤，将滤液合并浓缩成浸膏，合并的滤液体积是浸膏体积的120倍；随后用pH为3.5盐酸水溶液溶解，过滤，滤液过阳离子交换树脂，用去离子水洗脱杂质，再用酸性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，加碱中和，经脱盐处理，冷冻干燥，即得纯度较高的金钗石斛生物总碱提取物。软胶囊的用法和用量为：灌胃给药，以金钗石斛生物总碱计，低剂量10mg/kg，高剂量20mg/kg。

实施例5

金钗石斛生物总碱在制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中的应用。药物是以金钗石斛生物总碱作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的滴丸剂。其中金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛茎粗粉，加质量为粗粉质量12倍量的90％乙醇浸泡13小时，煮沸提取4次，每次3小时，过滤，将滤液合并浓缩成浸膏，合并的滤液体积是浸膏体积的120倍；随后用pH为3.5盐酸水溶液溶解，过滤，滤液过阳离子交换树脂，用去离子水洗脱杂质，再用酸性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，加碱中和，经脱盐处理，冷冻干燥，即得纯度较高的金钗石斛生物总碱提取物。滴丸剂的用法和用量为：灌胃给药，以金钗石斛生物总碱计，用量为10mg/kg～20mg/kg。

实施例6

金钗石斛生物总碱在制备预防或治疗急、慢性肝损伤疾病药物中的应用。药物是以金钗石斛生物总碱作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的糖浆剂。其中，金钗石斛生物总碱是通过以下步骤制备：取金钗石斛茎粗粉，加质量为粗粉质量10倍量的90％乙醇浸泡12小时，煮沸提取3次，每次2小时，过滤，将滤液合并浓缩成浸膏，合并的滤液体积是浸膏体积的120倍；随后用pH为3.5盐酸水溶液溶解，过滤，滤液过阳离子交换树脂，用去离子水洗脱杂质，再用酸性乙醇洗脱，洗脱液浓缩至无醇味，加碱中和，经脱盐处理，冷冻干燥，即得纯度较高的金钗石斛生物总碱提取物。糖浆剂的用法和用量为：灌胃给药，以金钗石斛生物总碱计，用量为10mg/kg～20mg/kg。

实施例1～6中药物还可以为以金钗石斛生物总碱作为活性成分，加入药用载体或赋形剂制成的舌下含片或注射剂。