LINC01094在诊治缺血性脑卒中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及缺血性脑卒中的分子生物标志物，更具体的涉及linc01094及其相关基因在诊治缺血性脑卒中的应用。

背景技术：

长链非编码rna(longnon-codingrna，lncrna)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码rna，根据其基因位置可分为五种类型：正义lncrna(senselncrna)、反义lncrna(antisenselncrna)、双向lncrna(bidirectionallncrna)、基因内lncrna(introniclncrna)及基因间lncrna(intergeniclncrna)。未来，lncrna有望成为肿瘤诊断、治疗和预后新的标志物，同时也为肿瘤的治疗提供了新的靶点。但是脑卒中后1ncrnas的表达变化如何，1ncrnas是否参与脑卒中的病程调控，目前尚不清楚。

脑卒中是一种严重危害人类健康和生命安全的脑血管疾病，具有发病率高、致残率高和死亡率高等特点，数据显示，我国每年新发脑卒中患者约200万人，其中70％-80％的脑卒中患者因为残疾不能独立生活，给家庭带来巨大的生活压力和精神压力，全国每年用于该病的治疗费用高达100亿元之多，给国家造成了沉重的经济负担。探求脑卒中的发病机制及有效提前预防和治疗方法的研究愈显重要。由血栓形成或栓子脱落导致的大脑主干血管或其分支血管阻塞而引起的缺血性脑卒中约占全部脑卒中的80％左右。寻找到有效的分子调控靶点，通过血液检测早期诊断缺血性脑卒中会使患者获益良多，用血液标志早期诊断缺血性脑卒中将有望成为一个具有实际应用价值的辅助诊断方法。

本发明通过高通量测序检测脑卒中和正常对照人群中mrna和1ncrnas的表达谱变化，运用生物信息学工具分析在脑卒中组差异表达的mrna和1ncrnas，筛选出候选基因linc01094，继而采用rt-pcr实验进行大样本验证和相关性分析以及初步的干扰实验，结果表明本发明挑选的linc01094与缺血性脑卒中密切相关，为临床早期缺血性脑卒中分子检测奠定基础。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种防治脑卒中的试剂，所述试剂包含：

(a)抑制剂和/或抑制剂组合物，所述抑制剂和/或抑制剂组合物下调linc01094的转录和/或阻断linc01094的活性；

(b)药剂学上能接受的载体。

进一步的，所述脑卒中为缺血性脑卒中。

优选的，通过sirna、shrna、反义核酸等方法下调linc01094的转录和/或阻断linc01094的活性。

优选的，所用sirna靶序列为seqidno.8和seqidno.11。

优选的，所用sirna序列为seqidno.9和seqidno.10；或seqidno.12和seqidno.13。

本发明的目的在于提供调控linc01094表达的制剂在制备防治脑卒中试剂中的应用。

进一步，防治脑卒中试剂包括下调linc01094的转录，或抑制linc01094活性的试剂。

本发明的目的在于提供一种脑卒中诊断制剂，该试剂检测linc01094表达。

进一步，脑卒中诊断制剂能够检测脑卒中样本中linc01094的转录或免疫检测方法检测脑卒中样本中linc01094调控的基因的表达情况。

进一步的，所述脑卒中为缺血性脑卒中。

优选的，缺血性脑卒中样本为外周血。

进一步，诊断缺血性脑卒中试剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测缺血性脑卒中样本中linc01094转录或基于免疫检测方法检测缺血性脑卒中样本中linc01094调控的基因的表达情况。

优选的，基于定量pcr方法包括特异性扩增linc01094的引物，进一步优选，特异性扩增linc01094的引物序列为seqidno.1和seqidno.2；基于探针杂交方法包括与linc01094的核酸序列杂交的探针；免疫检测方法包括与linc01094调控基因表达蛋白特异性结合的抗体。

本发明的目的在于提供上述脑卒中诊断制剂在制备脑卒中检测工具中的应用。

本领域人员熟知，本发明提供的lncrna序列既可通过生物学方法获得，又可通过化学合成方法获得，若通过化学合成方法制备，只要将其核苷酸序列提供给有关专业公司，委托其合成即可。lncrna还可含有另外的或可替换的碱基修饰体或取代体，如硫代修饰或/和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。与其90％以上同源的核苷酸序列也在本发明保护范围之内。

本发明的目的在于提供一种诊断脑卒中生物制剂，该生物制剂检测与linc01094表达相关的基因。

所述与linc01094表达相关的基因包括正相关基因和负相关基因。所述正相关基因为表达趋势与loc105372881表达一致的基因，所述负相关基因为表达趋势与loc105372881表达相反的基因。

进一步，正相关的基因为tesc、jazf1、nedd4l、eif3b、anp32b、rad23a、stradb、bckdk、ccny、ascc2、uts2或/和mmp17。

进一步，负相关的基因为kiaa1324l、mis18a、c1qtnf6、mterf2、map6d1、znf530、dnah1、cracr2a、ttc22和/或mib2。

优选的，与linc01094表达相关的基因为jazf1。

进一步，脑卒中为缺血性脑卒中。

进一步，诊断缺血性脑卒中生物制剂包括基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测缺血性脑卒中样本中与linc01094表达相关的基因转录或基于免疫检测方法检测缺血性脑卒中样本中与linc01094表达相关的基因的表达情况。

优选的，缺血性脑卒中样本为外周血。

优选的，基于定量pcr方法包括特异性扩增与linc01094表达相关的基因的引物，进一步优选，特异性扩增jazf1基因的引物序列为seqidno.3和seqidno.4；基于探针杂交方法包括与jazf1核酸序列杂交的探针；免疫检测方法包括与jazf1基因表达蛋白特异性结合的抗体。

本发明的目的在于提供上述生物制剂在制备诊断脑卒中工具中的应用。

本发明的目的在于提供一种防治脑卒中的试剂，该试剂调控与linc01094表达相关的基因的表达。

进一步，脑卒中为缺血性脑卒中。

进一步，防治脑卒中试剂包括下调与linc01094表达正相关的基因的转录，或上调与linc01094表达负相关的基因的转录。

优选的，通过sirna、shrna、反义核酸等方法下调与linc01094表达正相关的基因的转录或通过构建过表达载体等方法上调与linc01094表达负相关的基因的转录。

本发明的目的在于提供上述防治脑卒中的试剂在制备脑卒中治疗药物中的应用。

定义：

在此所用的“同源的”是指两个聚合分子之间(例如，两个核酸分子如两个dna分子之间)的亚单元序列相似性。当两个分子中的亚单元位置都被相同的单体亚单元所占据(例如，如果两个dna分子的一个位置都被腺嘌呤所占据)，则它们在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性是相配的或同源的位置的数量的直接函数。例如，两个化合物序列的10个位置中的5个是相配的或同源的，则两个序列是50％同源的，如果10个位置中的9个是相配的或同源的，则两个序列是90％同源的。

“诊断”表示对病理状况的存在或特性进行检测。诊断方法在敏感度和特异性上是有区别的。诊断方法的“灵敏度”是指被检测为阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。方法未检测到的患病个体是“假阴性”。在所述方法中，未患病的且被检测为阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断方法中的“特异性”为1减去假阳性率的差值，其中“假阳性”率被定义为：无病却并检测为阳性的个体比例。虽然某一特定诊断方法不能够为一种病状提供权威性的诊断，但它足以提供作为辅助诊断的阳性指示方法。

现阶段检测lncrna的表达水平的方法主要包括基于高通量测序技术、基于核苷酸杂交和基于pcr的lncrna检测方法。基于探针杂交技术的lncrna检测方法是一种直接检测法，不需要对样本rna进行预扩增。

实时荧光定量pcr技术(real-timepcr，rt-pcr)

荧光检测pcr仪可对整个pcr过程中扩增序列的累积速率绘制动态变化曲线。在反应混合体系中靶序列的起始浓度越大，要求获得扩增产物某特定产量的pcr循环数(一般用特定阈值循环数ct来表达)越少。qrt-pcr具有特异性高、灵敏度好、快速简单等多种优点。

高通量测序(high-throughputsequencing)又称下一代测序技术(nextgenerationsequencing)是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条dna分子进行序列测定，极大提高了测序效率。这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗传信息的解读速度，为获取所有lncrna的序列信息，解密lncrna图谱提供了保证。同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。高通量测序平台的代表是罗氏公司(roche)的454测序仪(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因组分析仪(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid测序仪(abisolidsequencer)。

包含在本发明的药剂学组合物的药剂学上许可的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methylcellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearicacidmagnesium)及矿物油(mineraloil)等，但并非局限于此。

本发明的药剂学组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。

本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。

本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

本发明的药剂学组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。

附图说明

图1是linc01094在脑卒中组和健康对照组相对表达情况图

图2是jazf1在脑卒中组和健康对照组相对表达情况图

图3是转染后各组linc01094相对表达情况图

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1高通量测序及分析

lncrna是一类长度大于200nt的非编码rna，测序实验采用illuminatruseq^tmrnasampleprepkit方法进行链特异文库构建，包括：

提取总rna。从组织样品中提取totalrna，利用nanodrop2000对所提rna的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性，agilent2100测定rin值。单次建库要求rna总量5ug,浓度≥200ng/μl,od260/280介于1.8～2.2之间。

去除rrna。细胞内一部分(>24％)的长链非编码rna都是缺少传统polya尾的，因此采用去除rrna的方式建库可以获得更加全面的lncrna信息

片段化mrna。利用金属离子，可以将mrna随机断裂成200bp左右的小片段。

反转合成cdna。在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mrna为模板反转合成一链cdna，进行二链合成时，dntps试剂中用dutp代替dttp，使cdna第二链中碱基包含a/u/c/g。

连接adaptor。链的cdna结构为粘性末端，加入endrepairmix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个a碱基，用于连接y字形的接头。

ung酶消化cdna二链。在pcr扩增前，用ung酶将cdna第二链消化，从而使文库中仅包含cdna第一链。

illuminahiseq4000上机测序。

由于原始测序数据中会包含测序接头序列、低质量读段、n率较高序列及长度过短序列，这将严重影响后续组装的质量。为保证后续的生物信息分析的准确性，首先对原始测序数据进行过滤，从而得到高质量的测序数据(cleandata)以保证后续分析的顺利进行。

进一步，将质控后得到的高质量测序序列与指定的参考基因组比对，参考基因组版本是grch38。首先，tophat使用其内置软件bowtie将高质量clean序列map到基因组上，这时所有参加mapping的序列将被分为两组：一组为已map到基因组上，另一组为没有map到基因组上。之后，tophat将这些map到基因组上的序列进行组装，这时就可以认为这些连续的序列即为一组外显子。同时，tophat会检测到没有map到基因组上的序列map至剪切位点的两端。通常tophat所检测的一对外显子之间的距离为70bp～20kb之间的距离。如果小于70bp的话，tophat会认为这两个外显子可能属于同一个外显子，由于基因的表达量比较低，中间的部分没有测到，因而形成了一个gap。通常采用默认参数运行软件，同时根据实际情况，如测序数据量，基因组情况对参数做适当的调整。

最后，使用软件cuffquant和cuffnorm用来进行表达量评估和标准化。cuffdiff利用tophat比对的结果，调用cufflinks计算每个基因/转录本的表达量。通常采用默认参数运行软件，同时根据实际情况，如测序数据量，基因组情况对参数做适当的调整。显著差异lncrna&mrna筛选条件：q-value<0.0。lncrna的功能和其共表达的蛋白编码基因相关，可以通过样本间lncrna与蛋白编码基因的表达量相关性分析或共表达分析方法来研究。当样本数>＝6时，使用pearson相关系数法分析样本间lncrna与蛋白编码基因的相关性；采用pearson相关系数法分析样本间lncrna与蛋白编码基因的相关性，阈值使用0.9。

结果：linc01094在缺血性脑卒中组中上调表达显著，tesc、jazf1、nedd4l、eif3b、anp32b、rad23a、stradb、bckdk、ccny、ascc2、uts2和mmp17基因在缺血性脑卒中组中也明显表达上调，kiaa1324l、mis18a、c1qtnf6、mterf2、map6d1、znf530、dnah1、cracr2a、ttc22和mib2基因在缺血性脑卒中组中明显表达下调，他们和linc01094具有很好的相关性。挑选jazf1基因进行相关性验证。

实施例2大样本验证linc01094和jazf1基因

一、样本采集

46例脑卒中患者及31例健康人群对照均来自医院(2014年1月-2015年9月)，抽取他们的外周血，4000rpm离心分离血浆加trizoi试剂(l:3)并保持在-80℃直至进行rna提取。所有受试者均签署了知情同意书。

二、实验方法

2.1引物设计

linc01094扩增引物：

上游引物：catacctgagccaacatacaat(seqidno.1)

下游引物：taactgcctaactaacgatgaag(seqidno.2)

扩增长度：150bp。

jazf1基因扩增引物：

上游引物：attgtattgcggtggtat(seqidno.3)

下游引物：tgtgagttgatgtgttga(seqidno.4)

扩增长度：102bp。

2.2rna提取及反转录

1)解冻含trizoi试剂的血浆，震荡后静止5分钟。

2)加氯仿(三氯甲烷0.2m1)，剧烈震荡30秒，静止15分钟。

3)离心15分钟(12000g，15分钟、4℃)。

4)取上清，加异丙醇(0.5m1)剧烈震荡，静止10分钟。

5)离心10分钟(12000g，10分钟，4℃)，然后弃上清。

6)加75％去污乙醇1ml(无水乙醇用depc处理的去离子水配，无水乙醇：depc水＝3:1)。用震荡器震荡0.5分钟。

7)离心5分钟(7500g，4℃)弃上清，倒扣于卫生纸上片刻后正置5分钟。

8)加5uldepc-h2o手掌离心机瞬时离心，60℃水浴10分钟。

9)测浓度，用rna浓度测量仪器。

接着采用采用takara试剂盒primescript^tmrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)(货号rr047a)对提取的总rna反转录合成第一链cdna。

2.3标准dna模板的制备

将逆转录反应得到的cdna进行常规pcr，反应体系和条件如下：10×extaqbuffer10μl，dntpmixture(各2.5mmol/l)4μl，sequenceno.3(10pmol)4μl，sequenceno.4(10pmol)4μl，cdna(0.1-2μg)5μl，extaqdna聚合酶0.5μl，双蒸水补齐至100ul。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50s，50℃退火50s，72℃延伸50s，35cycles；最后72℃延伸10min。

取样5μl，对pcr扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，进行切胶回收并纯化(回收使用试剂盒：ez-10spincolumndnagelextractionkit)，将纯化产物连接到pgm-t克隆载体，随后转化到dh5α感受态细胞中。通过序列为seqidno.3和seqidno.4的特异性引物筛选阳性克隆。阳性克隆扩增后提取质粒dna，质粒dna采用nanodropnd-1000核酸定量仪定量(nanodroptechnologies，wilmington，delaware)并做10倍系列稀释作为标准品用于标准曲线的制备(标准dna模板浓度范围在10⁸-10²copies/μl)。

2.4敏感性实验

取重组质粒按比例稀释为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²个拷贝/μl，进行荧光定量pcr，以检测为阳性的最低浓度为该方法的检测灵敏度。本研究所建立的方法检测范围为10⁸-10²copies/μl，最小检出浓度为100copies/μl。

2.2rt-pcr实验

采用takarasybrpremixextaqtmⅱ(tiirnasehplus)荧光定量试剂盒(货号rr820a)。50μlqrt-pcr反应体系包括：上游引物(10μmol/l)2μl；下游引物(10μmol/l)2μl；样品cdna4μl；50×roxreferencedye1μl；2×sybrpremexextaqⅱ(tiirnasehplus)25μl，加离子水至50μl。仪器采用appliedbiosystems7300。荧光定量pcr程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s，60℃35s。

对qrt-pcr反应结果使用spssforwindows11.5软件，相关数据采用χ2检验和fisher确切概率法进行处理，p＜0.05有统计学意义；qrt-pcr反应利用medcalc统计分析软件来计算。

根据qrt-pcr的相对定量公式：2-δct×100％，比较linc01094和jazf1在缺血性脑卒中患者和健康人群中的表达水平。结果显示qrt-pcr扩增结果稳定，其中linc01094在缺血性脑卒中患者组中较健康人群整体高表达，表达量约为健康人群的4倍(见图1)，jazf1在缺血性脑卒中患者组中较健康人群整体高表达，表达量约为健康人群的1.8倍(见图2)，以上结果说明在肿瘤组织中高表达。进一步分析发现，二者的相关系数r高达0.98。

实施例4rnai抑制linc01094表达

一、材料

sirna构建与合成

根据linc01094在genbank(ncbireferencesequence:nr_038303.1)中序列设计相应的sirna。设计后送往合成公司合成。

sirna的设计与合成：

设计3条rna干扰靶序列(表1)，阴性对照由公司提供。

表1linc01094-sirna转录模板序列

二、实验方法

(一)rna干扰技术抑制hek293细胞中linc01094的表达

1、细胞分组及瞬时转染

(1)细胞分组

c组：空白对照组；c1组：转染非特异性的sirna组；s1，s2，s3组：转染特异性的sirna组。

(2)转染

按照lipofectamine^tm2000transfectionreagent提供的步骤进行。

①转染前24h，取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数，用dmem培养基调整细胞浓度为1×10⁵/ml，取2m1接种于六孔板，放置于37℃，5％co2培养箱中培养，在细胞达80％融合时用于转染。在转染前用不含血清的dmem培养基培养3-4h。

②配制转染液体：

a液：250u1无血清培养基稀释4.0ugdna，温和混匀；

b液：250u1无血清培养基稀释10u1lipofectamine，温和混匀，室温放置5min；

③转染：a液与b液混合在一起，室温保温20min，直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在co2培养箱中37℃保温24-48h，6h后换液，加入含血清的培养基。

2、应用real-timepcr方法检测转染前后linc01094表达的变化

①标准曲线的构建：选取在50mi培养瓶中正常培养的hek293细胞1瓶，提取rna，测定rna浓度和纯度，进行逆转录反应，将反应生成的dna模板十倍稀释，得到相当于10⁴-10⁰copies/ul的dna模板，分别加入linc01094引物和内参引物，配制25u1反应体系，使用real-timepcr扩增仪，进行pcr扩增反应。得到linc01094和内参的标准曲线。

②real-timepcr方法检测转染前后linc01094表达的变化：提取各组细胞的rna，测定rna浓度和纯度，进行逆转录反应，每组dna模板同时进行linc01094和内参的real-timepcr反应，实验重复三次。

③对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳。

三、实验结果

应用real-timepcr方法构建linc01094和内参的标准曲线，相关系数分别为0.9937,0.9952，线性关系良好，符合要求。用双标准曲线的方法比较各组linc01094的表达。空白对照组、非特异性转染组基因的表达基本相似，差异无统计学意义。linc01094-sirna1、linc01094-sirna2、linc01094-sirna3三组转染后均有抑制linc01094表达的作用，linc01094-sirna1和linc01094-sirna2的作用更明显，抑制效率达65％和67％，而linc01094-sirna1的抑制作用为23％，与空白对照组、非特异性转染组相比，差异有统计学意义，p<0.05(图3)。

发明采用高通量测序筛选出脑卒中相关基因linc01094，结合分子细胞生物学实验验证，证实了linc01094与脑卒中具有很好的相关性。本发明为脑卒中临床诊疗提供了新的靶标，具有很好的临床应用前景。

sequencelisting

<110>汕头大学医学院第一附属医院

<120>linc01094在诊治缺血性脑卒中的应用

<160>13

<170>patentinversion3.3

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gcaauagcuuuuaaaauuaua21