一种靶向光热黑磷纳米制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医用纳米材料技术领域，特别是涉及一种靶向光热黑磷纳米制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

作为威胁人类健康的重大恶性疾病之一，癌症的治疗无论是化学治疗、手术治疗或放射治疗都是对身体有极大副作用的，并且在发生恶性转移以后，无论采用上述何种方式都难以彻底治愈。虽然已有大量的人力、物力、财力已经投入到癌症的研究，但进展十分有限、并且其有效治疗仍然是人类面对的极大考验。

有研究表明，将纳米技术应用到癌症诊断治疗领域，具有广阔的前景及临床价值。光热治疗作为一种新型的癌症治疗方式，利用光热转换产生的热效应以杀死癌细胞、对肿瘤部位进行热消融治疗，其照射用的激发光一般采用近红外光，是一种非侵入性的癌症治疗方式，能够有效穿透人体正常组织到达癌症部位，极大程度地减少对正常组织的损害。

近期研究发现，黑磷二维材料由于具有低毒性、高消光系数和高光热转换效率，在生物医用领域，尤其是癌症的光热治疗方面具有极大的应用潜力。然而，现有方式制备的单纯黑磷纳米材料在直接应用于癌症的光热治疗时，其在生理状态下稳定性较差，并且血液循环时间不长，且在癌症部位的富集效果有待改善。

技术实现要素：

鉴于此，本发明第一方面提供了一种靶向光热黑磷纳米制剂，该靶向光热黑磷纳米制剂稳定性高、靶向识别能力好、光热性能优异、能够有效杀死癌细胞，可在细胞层面进行癌症的靶向光热治疗。

第一方面，本发明提供了一种靶向光热黑磷纳米制剂，包括黑磷纳米薄片、通过静电引力吸附在所述黑磷纳米薄片表面的聚乙二醇、以及通过酰胺键连接在所述聚乙二醇上的叶酸，所述聚乙二醇的一端为氨基，另一端为亚氨基，所述亚氨基的氮原子与所述叶酸中的羰基碳原子相连构成所述酰胺键，所述叶酸暴露在所述纳米制剂的最外层。

本发明通过采用聚乙二醇对黑磷纳米薄片进行修饰，并同时采用叶酸进行靶向修饰，其中，聚乙二醇可以有效避免黑磷纳米薄片发生聚集，且聚乙二醇兼具亲水特性和极性，可以显著抑制免疫系统的识别，减少单核-吞噬细胞系统的吞噬，并有效延长纳米薄片的血液长循环时间，从而增强纳米制剂的生物利用度和癌症部位的富集。而叶酸暴露在所述纳米制剂最外层提供靶向配体，所述靶向配体可以和癌细胞特异性结合，提高纳米制剂对癌细胞的靶向特异性，进一步增强纳米制剂在癌症部位的聚集，显著提高光热治疗效果。

可选地，所述靶向光热黑磷纳米制剂通过将黑磷纳米薄片、双氨端聚乙二醇、叶酸按质量比(1～3)∶(5～12)∶(2～6)配比制得。

本发明中，所述黑磷纳米薄片的尺寸为50nm-200nm。

本发明中，所述黑磷纳米薄片的厚度为2nm-3nm。

本发明中，所述双氨端聚乙二醇的重均分子量为550-30000。

本发明第一方面提供的所述靶向光热黑磷纳米制剂，稳定性高、靶向识别能力好、光热性能优异、能够有效杀死癌细胞，可在细胞层面进行癌症的靶向光热治疗，从而可显著减少黑磷纳米薄片的体内清除；且该靶向光热黑磷纳米制剂具有良好的生物相容性，可通过生物降解或者正常的生理途径排出体外，对生物体无毒副作用、生物安全性高。

第二方面，本发明提供了一种靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

提供黑磷纳米薄片；

将羟基琥珀酰亚胺活化叶酸加入到双氨端聚乙二醇的二甲基亚砜溶液中，并加入适量催化剂，得到混合溶液，所述混合溶液在室温、避光条件下进行搅拌反应16-32小时，反应完成后过滤，得到叶酸修饰的聚乙二醇，所述叶酸通过酰胺键连接在聚乙二醇上，所述聚乙二醇的一端为氨基，另一端为亚氨基，所述亚氨基的氮原子与所述叶酸中的羰基碳原子相连构成所述酰胺键；

依次采用探针超声、磁力搅拌的方式，在所述黑磷纳米薄片的表面包覆叶酸修饰的聚乙二醇，得到靶向光热黑磷纳米制剂，所述叶酸修饰的聚乙二醇通过静电引力吸附在所述黑磷纳米薄片表面，所述叶酸暴露在所述靶向光热黑磷纳米制剂的最外层。

本发明中，可选地，所述黑磷纳米薄片、双氨端聚乙二醇、叶酸按质量比(1～3)∶(5～12)∶(2～6)投料。

本发明中，所述催化剂可以是三乙胺。所述催化剂与反应体系的体积比为1:75-85。

本发明中，可选地，所述探针超声的时间为20-40分钟，所述探针超声过程中，持续超声45秒-1小时，及等待15秒-1小时为一个周期，功放为12％-20％。

本发明中，可选地，所述磁力搅拌的转速可以为800rpm-1200rpm，持续时间为3-4小时。

本发明中，所述黑磷纳米薄片采用溶液剥离结合探针超声法制备，并采用离心管离心方式收集、纯化，所述探针超声的超声时间为12-18小时，所述探针超声过程中，持续超声45秒-1小时，及等待15秒-1小时为一个周期，功放为20％-30％，所述离心的速率为1000rpm-2000rpm，时间为6-15分钟，温度为4℃。

本发明中，所述羟基琥珀酰亚胺活化叶酸采用如下方式制备：将叶酸溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)中，再加入羟基琥珀酰亚胺和N,N'-二环己基碳酰亚胺得到混合液，所述混合液在室温、避光和三乙胺催化条件下进行搅拌反应16-32小时，反应完成后过滤，得到所述羟基琥珀酰亚胺活化叶酸。

本发明中，所述靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法进一步包括采用超滤膜离心的方式对所得靶向光热黑磷纳米制剂进行至少一次纯化、筛选，得到优化粒径大小的纯净靶向光热黑磷纳米制剂，所述超滤膜离心的速率为2000-4000rpm，时间为30-60分钟，温度为4-8℃。

本发明第二方面提供的靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法，通过将黑磷纳米薄片与叶酸修饰的聚乙二醇通过静电吸附的方式包覆结合，制得靶向光热黑磷纳米制剂，制备过程简单易操作。

第三方面，本发明提供了一种上述的靶向光热黑磷纳米制剂在制备癌症光热消融治疗药物中的应用。所述靶向光热黑磷纳米制剂应用于癌症的靶向光热消融治疗。所述光热消融治疗通过808nm近红外波段激光激发。所述808nm近红外波段激光具有很强的皮肤穿透能力，能够有效到达深层组织及癌症部位。同时，所述靶向光热黑磷纳米制剂具有很好的生物相容性、无毒副作用。

综上所述，本发明有益效果包括以下几个方面：

(1)本发明所述的靶向光热黑磷纳米制剂可以有效防止黑磷纳米薄片的聚集，提高黑磷纳米薄片的稳定性，延长血液循环时间，增强黑磷纳米薄片的靶向效果；

(2)本发明方法制备过程简单易操作，制备的靶向光热黑磷纳米制剂具备优异生物相容性、无毒副作用；

(3)本发明制备的所述靶向光热黑磷纳米制剂可以应用于癌症的靶向光热治疗。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂(BP-PEG-FA)的结构示意图；

图2为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的扫描透射电子显微镜(STEM)和X射线能量色散谱(EDS mapping)；

图3为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的粒径分布图；

图4为本发明实施例1靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在制备过程中Zeta电位的变化图；

图5为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的傅里叶红外光谱图(FT-IR)；

图6为不同浓度的本发明实施例2制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在808nm近红外激光照射下随时间变化的光热曲线图谱；

图7为本发明实施例2制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在多次808nm近红外激光照射下的光热稳定性，其中黑磷浓度为100μg/mL；

图8为本发明实施例2制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在不同制备时间下的光热曲线图谱，其中黑磷浓度为100μg/mL；

图9为激光共聚焦扫描电子显微镜(CLSM)观察本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的Hela细胞摄取图片；

图10为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在不同癌症细胞中的毒性结果；

图11为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在Hela细胞中的体外靶向光热治疗效果。

具体实施方式

以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

本发明实施例提供了一种靶向光热黑磷纳米制剂，包括黑磷纳米薄片、通过静电引力吸附在所述黑磷纳米薄片表面的聚乙二醇、以及通过酰胺键连接在所述聚乙二醇上的叶酸，所述聚乙二醇的一端为氨基，另一端为亚氨基，所述亚氨基的氮原子与所述叶酸中的羰基碳原子相连构成所述酰胺键，所述叶酸暴露在所述纳米制剂的最外层。

可选地，所述靶向光热黑磷纳米制剂通过将黑磷纳米薄片、双氨端聚乙二醇、叶酸按质量比(1～3)∶(5～12)∶(2～6)配比制得。进一步可选地，所述靶向光热黑磷纳米制剂通过将黑磷纳米薄片、双氨端聚乙二醇、叶酸按质量比1∶4.2∶2.1配比制得。适合的黑磷纳米薄片、双氨端聚乙二醇、叶酸质量比，有利于形成结构稳定的靶向光热黑磷纳米制剂，可有效避免黑磷纳米薄片的聚集，提高纳米光热制剂的稳定性和靶向效果。

本发明中，所述黑磷纳米薄片表面带负电，因此可通过静电引力与氨基封端的聚乙二醇相结合，聚乙二醇为靶向光热黑磷纳米制剂提供了亲水性表面。

本发明中，可选地，所述黑磷纳米薄片的尺寸为50nm-200nm。适合的黑磷纳米薄片尺寸，可以有效增强纳米制剂的EPR效应，增加纳米制剂在癌症部位的富集，同时保证其在血液循环过程中不易被人体网状内皮组织清除。可选地，黑磷纳米薄片的尺寸为50nm-150nm、100nm-150nm、120nm-180nm、160nm-200nm。

本发明中，所述黑磷纳米薄片的厚度为2nm-3nm。黑磷纳米薄片适合的厚度能够显著提高纳米制剂的表面积-质量比，强化纳米制剂的光热治疗效果。厚度越薄，表面积-质量比比值越大。相同质量的黑磷纳米薄片制剂，比表面越大，光热效果越好；反之，光热效果下降。

本发明中，所述黑磷纳米薄片具有非常高的表面积-质量比，一方面能够最大限度地吸收近红外激发光，产生优异的光热性能；另一方面黑磷纳米薄片表面充满负电荷，能够增强与聚乙二醇之间的静电吸附能力，增强叶酸修饰的聚乙二醇表面负载量，加强靶向光热黑磷纳米制剂的稳定性和靶向效果。

本发明中，所述双氨端聚乙二醇的重均分子量为550-30000。

本发明第一方面提供的所述靶向光热黑磷纳米制剂，稳定性高、靶向识别能力好、光热性能优异、能够有效杀死癌细胞，可在细胞层面进行癌症的靶向光热治疗，从而可显著减少黑磷纳米薄片的体内清除；且该靶向光热黑磷纳米制剂具有良好的生物相容性，可通过生物降解或者正常的生理途径排出体外，对生物体无毒副作用、生物安全性高。

相应地，本发明实施例还提供了一种靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)提供黑磷纳米薄片；

(2)将羟基琥珀酰亚胺活化叶酸加入到双氨端聚乙二醇的二甲基亚砜溶液中，并加入适量催化剂，得到混合溶液，所述混合溶液在室温、避光条件下进行搅拌反应16-32小时，反应完成后过滤，得到叶酸修饰的聚乙二醇，所述叶酸通过酰胺键连接在聚乙二醇上，所述聚乙二醇的一端为氨基，另一端为亚氨基，所述亚氨基的氮原子与所述叶酸中的羰基碳原子相连构成所述酰胺键；

(3)依次采用探针超声、磁力搅拌的方式，在所述黑磷纳米薄片的表面包覆叶酸修饰的聚乙二醇，得到靶向光热黑磷纳米制剂，所述叶酸修饰的聚乙二醇通过静电引力吸附在所述黑磷纳米薄片表面，所述叶酸暴露在所述靶向光热黑磷纳米制剂的最外层。

本发明实施例步骤(1)中，可选地，所述黑磷纳米薄片的尺寸为50nm-200nm。适合的黑磷纳米薄片尺寸，可以有效增强纳米制剂的EPR效应，增加纳米制剂在癌症部位的富集，同时保证其在血液循环过程中不易被人体网状内皮组织清除。可选地，黑磷纳米薄片的尺寸为50nm-150nm、100nm-150nm、120nm-180nm、160nm-200nm。可选地，所述黑磷纳米薄片的厚度为2nm-3nm。黑磷纳米薄片适合的厚度能够显著提高纳米制剂的表面积-质量比，强化纳米制剂的光热治疗效果。

本发明实施例步骤(1)中，所述黑磷纳米薄片可采用溶液剥离结合探针超声法制备，并采用离心管离心方式收集、纯化，所述探针超声的超声时间为12-18小时，所述探针超声过程中，持续超声45秒-1小时，及等待15秒-1小时为一个周期，功放为20％-30％，所述离心的速率为1000rpm-2000rpm，时间为6-15分钟，温度为4℃。离心操作是为了沉淀分离未被剥离的块状黑磷，以提纯分离黑磷纳米薄片。

本发明实施例步骤(2)中，可选地，所述双氨端聚乙二醇的重均分子量为550-30000。可选地，所述催化剂可以是三乙胺。所述催化剂与反应体系的体积比为1:75-85。所述搅拌反应过程中的搅拌速度为300-600rpm。

本发明实施例步骤(2)中，所述羟基琥珀酰亚胺活化叶酸可采用如下方式制备：将叶酸溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)中，再加入羟基琥珀酰亚胺(NHS)、三乙胺和N,N'-二环己基碳酰亚胺(DCC)得到混合液，所述混合液在室温、避光条件下进行搅拌反应16-32小时，反应完成后过滤，得到所述羟基琥珀酰亚胺活化叶酸。

本发明步骤(2)中，反应完成后的过滤操作具体可以是：采用透析袋(MWCO:3000)透析除去未反应的羟基琥珀酰亚胺活化叶酸。

本发明实施例中所得叶酸修饰的聚乙二醇对细胞膜有较强的亲和力，可以很好地促进纳米制剂进入细胞内，有利于提高靶向光热黑磷纳米制剂的后续癌症光热治疗效果。

本发明中，可选地，所述黑磷纳米薄片、双氨端聚乙二醇、叶酸按质量比(1～3)∶(5～12)∶(2～6)投料。进一步可选地，所述黑磷纳米薄片、双氨端聚乙二醇、叶酸按质量比1∶4.2∶2.1投料。

本发明步骤(3)中，先采用探针超声方式对所述黑磷纳米薄片进行预包覆，再采用磁力搅拌方式进行进一步包覆。可选地，所述探针超声的时间为20-40分钟，所述探针超声过程中，持续超声45秒-1小时，及等待15秒-1小时为一个周期，功放为12％-20％。所述磁力搅拌的转速可以为800rpm-1200rpm，持续时间为3-4小时。

本发明步骤(3)中，进一步包括采用超滤膜离心的方式对所得靶向光热黑磷纳米制剂进行至少一次纯化、筛选，得到优化粒径大小的纯净靶向光热黑磷纳米制剂，所述超滤膜离心的速率为2000-4000rpm，时间为30-60分钟，温度为4-8℃。

进一步可选地，所述靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法包括重复多次的所述超滤膜离心操作，具体为：每次超滤膜离心操作结束后，用生理盐水重悬超滤膜上的靶向光热黑磷纳米制剂，然后进行下一次所述超滤膜离心操作。

本发明上述各个步骤中超声及离心持续时间、周期、转速及功放等各指标的参数设置不局限于上述的限定。

本发明第二方面提供的靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法，通过将黑磷纳米薄片与叶酸修饰的聚乙二醇通过静电吸附的方式包覆结合，制得靶向光热黑磷纳米制剂，制备过程简单易操作。

第三方面，本发明提供了一种上述的靶向光热黑磷纳米制剂在制备癌症光热消融治疗药物中的应用。所述靶向光热黑磷纳米制剂应用于癌症的靶向光热消融治疗。所述光热消融治疗通过808nm近红外波段激光激发。所述808nm近红外波段激光具有很强的皮肤穿透能力，能够有效到达深层组织及癌症部位。同时，所述靶向光热黑磷纳米制剂具有很好的生物相容性、无毒副作用。

下面分多个实施例对本发明实施例进行进一步的说明。其中，本发明实施例不限定于以下的具体实施例。在不变主权利的范围内，可以适当的进行变更实施。

实施例1

一种靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用溶液剥离结合探针超声法制备黑磷纳米薄片：取50mg块状黑磷材料，置于100mL超纯水中，进行探针超声，所述探针超声法的超声时间为12小时，过程为持续超声45秒，等待15秒为一个周期，功放为20％；超声结束后，取棕黑色剥离液置于离心管中，1000rpm离心10分钟，温度为4℃，沉淀未被剥离的块状黑磷，并小心分离沉淀的块状黑磷和上清液中的黑磷纳米薄片，以进一步提纯分离黑磷纳米薄片；

(2)在溶解有叶酸(1.0g,2.27mmol)的40mL的无水DMSO中加入三乙胺(0.5mL)，NHS(0.52g,5.00mmol)以及DCC(0.50g,2.50mmol)，得到混合液，该混合液在室温、避光条件下磁力搅拌反应24h后，过滤除去不溶的副产物和未反应的原料，得到NHS活化叶酸。在三乙胺存在的前提下，将2.5mL的NHS活化叶酸加入到双氨端聚乙二醇(分子量为3000)的无水DMSO溶液中，两者(NHS活化后叶酸：双端氨聚乙二醇)摩尔比为1:2，得到混合溶液。该混合溶液在室温、避光条件下磁力搅拌反应24h，通过耦合氨端共聚物，合成叶酸修饰的聚乙二醇FA-PEG-NH₂，在蒸馏水中透析(MWCO:1000)，以除去未反应的叶酸，对FA-PEG-NH₂进行纯化；

(3)采用探针超声与磁力搅拌的相结合的方式，在黑磷纳米薄片的表面包覆叶酸修饰的聚乙二醇制备靶向光热黑磷纳米制剂；其中黑磷纳米薄片和叶酸修饰的聚乙二醇的质量比为1:6.3。具体地，先采用探针超声方式对黑磷纳米薄片进行叶酸修饰的聚乙二醇预包覆，探针超声过程在二者悬液中进行，探针超声的时间为40分钟，过程为持续超声45秒，等待15秒为一个周期，功放为15％。然后采用在室温下磁力搅拌的方式对黑磷纳米薄片进行叶酸修饰的聚乙二醇进一步包覆，磁力搅拌转速为800rpm，持续时间为4小时；单纯聚乙二醇包覆的黑磷纳米光热制剂(无叶酸修饰)可以通过相同的方式制备，制备原料由叶酸修饰的氨端聚乙二醇替换为无修饰的氨端聚乙二醇；

(4)采用超滤膜离心的方式纯化、筛选步骤(3)所得靶向光热黑磷纳米制剂，得到优化粒径大小的纯净靶向光热黑磷纳米制剂：取步骤(3)中反应混合液加入到超滤管(MWCO 100kDa；Millipore)中离心，分离未包覆的叶酸修饰的聚乙二醇和制备得到的靶向光热黑磷纳米制剂；超滤膜离心的速率为4000rpm，时间为30分钟，温度为4℃。超滤膜离心后，用生理盐水重悬滤膜上的靶向光热黑磷纳米制剂，重复超滤膜离心和生理盐水重悬3次，即可得到纯净的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA。

图1为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的结构示意图，包括黑磷纳米薄片10、通过静电引力吸附在黑磷纳米薄片10表面的聚乙二醇20和通过酰胺键连接在聚乙二醇20上的叶酸30；聚乙二醇20的一端为氨基，另一端为亚氨基，所述亚氨基的氮原子与叶酸30中的羰基碳原子相连构成所述酰胺键，所述叶酸30暴露在纳米制剂的最外层。

图2(a)和图2(b)分别为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的扫描透射电子显微镜(STEM)和X射线能量色散谱(EDS mapping)，从图中可看出，本实施例制得的BP-PEG-FA粒径大约为100nm左右，粒径范围适合产生较好的EPR效应，并且可以获知本实施例制得的BP-PEG-FA的元素构成为碳、氮、氧、磷四种元素，初步验证靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA制备成功。

图3为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的粒径分布图，与图2中结果具有很好的一致性。

图4为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在制备过程中Zeta电位的变化图。黑磷纳米薄片BP NSs的Zeta电位在-14mV左右，表面负电绝对值较高，能够有效与氨端聚乙二醇发生相互作用，进行聚乙二醇包覆。聚乙二醇包覆后的黑磷光热纳米制剂(包括无叶酸修饰BP-PEG NSs和有叶酸修饰BP-PEG-FA NSs)的Zeta电位在-10mV～-18mV之间，维持了较高的绝对值，纳米制剂之间相互排斥作用较强，因而在分散相中高度稳定。

图5为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的傅里叶红外光谱图(FT-IR)。从图中可以看出，在～2900cm^-1吸收峰来自靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA中聚乙二醇部分的CH振动峰和C-O振动峰，在～1637到～1653cm^-1的吸收峰来自叶酸部分的酰胺结合，进一步验证了靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA制备成功。

实施例2

一种靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用溶液剥离结合探针超声法制备黑磷纳米薄片：取50mg块状黑磷材料，置于100mL超纯水中，进行探针超声，所述探针超声法的超声时间为18小时，过程为持续超声1小时，等待1小时为一个周期，功放为20％。超声结束后，取棕黑色剥离液置于离心管中，2000rpm离心6分钟，温度为4℃，沉淀未被剥离的块状黑磷，并小心分离沉淀的块状黑磷和上清液中的黑磷纳米薄片，以进一步提纯分离黑磷纳米薄片；

(2)在溶解有叶酸(1.0g,2.27mmol)的40mL的无水DMSO中加入三乙胺(0.5mL)，NHS(0.52g,5.00mmol)以及DCC(0.50g,2.50mmol)，得到混合液，该混合液在室温、避光条件下磁力搅拌反应24h后，过滤除去不溶的副产物和未反应的原料，得到NHS活化叶酸。在三乙胺存在的前提下，将2.5mL的NHS活化叶酸加入到双氨端聚乙二醇(分子量为5000)的DMSO溶液中，两者等摩尔比，得到混合溶液。该混合溶液在室温、避光条件下磁力搅拌反应24h，通过耦合氨端共聚物，合成叶酸修饰的聚乙二醇FA-PEG-NH₂，在蒸馏水中透析(MWCO:3000)，以除去未反应的叶酸，对FA-PEG-NH₂进行纯化；

(3)采用探针超声与磁力搅拌的相结合的方式，在黑磷纳米薄片的表面包覆叶酸修饰的聚乙二醇制备靶向光热黑磷纳米制剂，其中黑磷纳米薄片和叶酸修饰的聚乙二醇的质量比为1:5。具体地，先采用探针超声方式对黑磷纳米薄片进行叶酸修饰的氨端聚乙二醇进行预包覆，探针超声过程在二者悬液中进行，探针超声的时间为持续30分钟，功放为12％；再在室温下采用磁力搅拌的方式对黑磷纳米薄片进行叶酸修饰的聚乙二醇的进一步包覆，磁力搅拌转速为1000rpm，持续时间为4小时；单纯聚乙二醇包覆的黑磷纳米光热制剂(无叶酸修饰)可以通过相同的方式制备，制备原料由叶酸修饰的氨端聚乙二醇替换为无修饰的氨端聚乙二醇；

(4)采用超滤膜离心的方式纯化、筛选步骤(3)所得靶向光热黑磷纳米制剂，得到优化粒径大小的纯净靶向光热黑磷纳米制剂：取步骤(3)中反应混合液加入到超滤管(MWCO 100kDa；Millipore)中离心，分离未包覆的叶酸修饰的聚乙二醇和制备得到的靶向光热黑磷纳米制剂；超滤膜离心的速率为4000rpm，时间为30分钟，温度为4℃。超滤膜离心后，用生理盐水重悬滤膜上的靶向光热黑磷纳米制剂，重复超滤膜离心和生理盐水重悬4次，即可得到纯净的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA。

图6为本发明实施例2制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在808nm近红外激光照射下随时间变化的光热曲线图谱。从图中可以看出，本发明实施例靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA具有很好的光热特性，在强度为1.0W/cm²的808nm激光照射下，浓度为100μg/mL的靶向光热黑磷纳米制剂的温度在10分钟内上升了约26℃。

图7为本发明实施例2制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在多次808nm近红外激光照射下的光热稳定性。从图中可以看出，本发明实施例靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在多次808nm近红外激光照射下温度变化稳定，近红外激光激发的光稳定性好。

图8为本发明实施例2制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在不同制备时间下的光热曲线图谱。从图中可以看出，制备一周后与刚刚制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在相同条件下的近红外激光激发后温度变化一致，因此，表明本发明实施例制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA可以储备放置后使用。

实施例3

一种靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用溶液剥离结合探针超声法制备黑磷纳米薄片，取50mg块状黑磷材料，置于100mL超纯水中，进行探针超声，所述探针超声法的超声时间为16小时，过程为持续超声1小时，等待1小时为一个周期，功放为25％。超声结束后，取棕黑色剥离液置于离心管中，1000rpm离心15分钟，温度为4℃，沉淀未被剥离的块状黑磷，并小心分离沉淀的块状黑磷和上清液中的黑磷纳米薄片，以进一步提纯分离黑磷纳米薄片；

(2)在溶解有叶酸(1.0g,2.27mmol)的40mL的无水DMSO中加入三乙胺(0.5mL)，NHS(0.52g,5.00mmol)以及DCC(0.50g,2.50mmol)，得到混合液，该混合液在室温、避光条件下磁力搅拌反应24h后，过滤除去不溶的副产物和未反应的原料，得到NHS活化叶酸。在三乙胺存在的前提下，将2.5mL的NHS活化叶酸加入到双氨端聚乙二醇(分子量为550)的DMSO溶液中，两者等摩尔比，得到混合溶液。该混合溶液在室温、避光条件下磁力搅拌反应24h，通过耦合氨端共聚物，合成叶酸修饰的聚乙二醇FA-PEG-NH₂，在蒸馏水中透析(MWCO:500)，以除去未反应的叶酸，对FA-PEG-NH₂进行纯化；

(3)采用探针超声与磁力搅拌的相结合的方式，在黑磷纳米薄片的表面包覆叶酸修饰的聚乙二醇制备靶向光热黑磷纳米制剂，其中黑磷纳米薄片和叶酸修饰的聚乙二醇的质量比为1:8。具体地，先采用探针超声方式对黑磷纳米薄片进行叶酸修饰的氨端聚乙二醇进行预包覆，探针超声过程在二者悬液中进行，探针超声的时间为持续30分钟，功放为15％；再在室温下采用磁力搅拌的方式对黑磷纳米薄片进行叶酸修饰的聚乙二醇的进一步包覆，磁力搅拌转速为850rpm，持续时间为4小时；单纯聚乙二醇包覆的黑磷纳米光热制剂(无叶酸修饰)可以通过相同的方式制备，制备原料由叶酸修饰的氨端聚乙二醇替换为无叶酸修饰的氨端聚乙二醇；

(4)采用超滤膜离心的方式纯化、筛选步骤(3)所得靶向光热黑磷纳米制剂，得到优化粒径大小的纯净靶向光热黑磷纳米制剂：取步骤(3)中反应混合液加入到超滤管(MWCO 100kDa；Millipore)中离心，分离未包覆的叶酸修饰的聚乙二醇和制备得到的靶向光热黑磷纳米制剂；超滤膜离心的速率为4000rpm，时间为40分钟，温度为4℃。超滤膜离心后，用生理盐水重悬滤膜上的靶向光热黑磷纳米制剂，重复超滤膜离心和生理盐水重悬5次，即可得到纯净的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA。

实施例4

一种靶向光热黑磷纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用溶液剥离结合探针超声法制备黑磷纳米薄片，取50mg块状黑磷材料，置于100mL超纯水中，进行探针超声，所述探针超声法的超声时间为14小时，过程为持续超声0.5小时，等待0.5小时为一个周期，功放为30％。超声结束后，取棕黑色剥离液置于离心管中，2000rpm离心10分钟，温度为4℃，沉淀未被剥离的块状黑磷，并小心分离沉淀的块状黑磷和上清液中的黑磷纳米薄片，以进一步提纯分离黑磷纳米薄片；

(2)在溶解有叶酸(1.0g,2.27mmol)的40mL的无水DMSO中加入三乙胺(0.5mL)，NHS(0.52g,5.00mmol)以及DCC(0.50g,2.50mmol)，得到混合液，该混合液在室温、避光条件下磁力搅拌反应24h后，过滤除去不溶的副产物和未反应的原料，得到NHS活化叶酸。在三乙胺存在的前提下，将2.5mL的NHS活化叶酸加入到双氨端聚乙二醇(分子量为30000)的DMSO溶液中，两者等摩尔比，得到混合溶液。该混合溶液在室温、避光条件下磁力搅拌反应24h，通过耦合氨端共聚物，合成叶酸修饰的聚乙二醇FA-PEG-NH₂，在蒸馏水中透析(MWCO:3000)，以除去未反应的叶酸，对FA-PEG-NH₂进行纯化；

(3)采用探针超声与磁力搅拌的相结合的方式，在黑磷纳米薄片的表面包覆叶酸修饰的聚乙二醇制备靶向光热黑磷纳米制剂，其中黑磷纳米薄片和叶酸修饰的聚乙二醇的质量比为1:12。具体地，先采用探针超声方式对黑磷纳米薄片进行叶酸修饰的氨端聚乙二醇进行预包覆，探针超声过程在二者悬液中进行，探针超声的时间为持续20分钟，功放为20％；再在室温下采用磁力搅拌的方式对黑磷纳米薄片进行叶酸修饰的聚乙二醇的进一步包覆，磁力搅拌转速为1200rpm，持续时间为3小时；单纯聚乙二醇包覆的黑磷纳米光热制剂(无叶酸修饰)可以通过相同的方式制备，制备原料由叶酸修饰的氨端聚乙二醇替换为无修饰的氨端聚乙二醇；

(4)采用超滤膜离心的方式纯化、筛选步骤(3)所得靶向光热黑磷纳米制剂，得到优化粒径大小的纯净靶向光热黑磷纳米制剂：取步骤(3)中反应混合液加入到超滤管(MWCO 100kDa；Millipore)中离心，分离未包覆的叶酸修饰的聚乙二醇和制备得到的靶向光热黑磷纳米制剂；超滤膜离心的速率为4000rpm，时间为40分钟，温度为4℃。超滤膜离心后，用生理盐水重悬滤膜上的靶向光热黑磷纳米制剂，重复超滤膜离心和生理盐水重悬4次，即可得到纯净的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA。

应用实施例

使用含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液培养Hela细胞于37℃，5％CO₂的培养箱中。待细胞铺满细胞培养瓶底部后，弃去陈旧培养基，用PBS冲洗一次，加入1mL 0.25％的胰蛋白酶，37℃消化1-2分钟，加入少量含有血清的完全培养基，用弯头吸管轻轻吹打使细胞脱离瓶壁成为单细胞悬液。将此单细胞悬液均匀接种于6孔细胞培养板中，再加入1mL培养基，37℃、5％CO₂孵箱中培养24小时。于细胞中加入本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA，继续培养4小时。用冰冷的PBS冲洗三次，加入甲醇固定细胞20min，弃去甲醇，加入DAPI染液孵育5min，再用PBS冲洗三次，于FV-1000激光共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况。观察DAPI所用激发光波长为340nm，通过Bright通道观察靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的摄取情况。

待正常培养于10％胎牛血清的DMEM高糖培养液中的Hela细胞铺满细胞培养瓶底部后，弃去陈旧培养基，用PBS冲洗一次，加入1mL 0.25％的胰蛋白酶，37℃消化1-2分钟，加入少量含有血清的完全培养基，轻轻吹打使细胞脱离瓶壁成为单细胞悬液。将此悬液进行细胞计数、稀释后按5000个细胞/孔的密度均匀接种于96孔细胞培养板中，于37℃，5％CO₂的培养箱中继续培养24小时使细胞贴壁。用完全培养基分散本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA(浓度分别是10，25，50μg/mL)作为待测样品；不含靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的完全培养基培养的Hela细胞作为对照组。待接种于96孔细胞培养板中的Hela细胞培养24h贴壁后，弃去陈旧培养基，用PBS冲洗一次，加入不同浓度的实验组和对照组分别培养4小时，随后在强度为1.0W/cm²的808nm激光照射10分钟，弃去陈旧培养基，用PBS冲洗一次后，加入完全培养基，37℃孵育过夜后，通过MTT法(每个组均设置5个复孔)测定不同组的细胞活性以测定靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA体外癌症光热治疗效果。

图9为激光共聚焦扫描电子显微镜(CLSM)观察本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA的Hela细胞摄取图片。具体地图9(a)、图9(b)、图9(c)分别为细胞核用DAPI染成蓝色，依次通过DAPI通道、Bright通道和混合通道观察的图像。从图中可以看出，本发明实施例的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA能够有效进入癌症细胞，进而能够在细胞内部发生光热治疗效果。

图10为本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在不同癌症细胞(Hela、MCF-7、HepG2和PC3)中的毒性结果。从图中可以看出，本发明实施例的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在无激光照射情况下不具备细胞毒性，生物安全性好、无毒副作用。

图11为不同浓度的本发明实施例1制备的靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA在Hela细胞中的体外靶向光热治疗效果。图11中横坐标黑磷浓度是指黑磷靶向光热制剂中含有黑磷的浓度。Control指未做任何处理细胞，作为空白参照。从图中可以看出，在强度为1.0W/cm²的808nm激光照射下，与未经靶向修饰的黑磷纳米薄片(BP NSs)和黑磷光热纳米制剂(BP-PEG NSs)相比，靶向光热黑磷纳米制剂BP-PEG-FA具有更为优异的体外靶向光热治疗效果，能够有效杀死癌细胞，并且只在近红外激光的照射部位产生治疗效果，从而极大程度上减少了对正常细胞、组织及器官的伤害，具有针对性。

需要说明的是，根据上述说明书的揭示和和阐述，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些等同修改和变更也应当在本发明的权利要求的保护范围之内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。