本发明涉及药物领域,特别是涉及一种石金钱龟多肽混合物在制备抗肿瘤药物领域的应用以及包括该石金钱龟多肽混合物的抗肿瘤药物。
背景技术:
癌症仍在严重危害着人类生命和健康,全球癌症病例仍在持续增加,很大程度上是由人口老龄化、世界人口增长和致癌行为习惯增加等所致,特别是发展中国家的吸烟行为。报道提到,中国2015年新增430万癌症病例,癌症的死亡病例超过280万,有专家预计,中国每年的癌症新发病例总数到2020年将达到400万左右,每年病例总数将达到600万。肺癌仍然是男性最常见癌症,占癌症总发病率的17%和死亡率的14%。乳腺癌是女性中最常被诊断出的肿瘤,是女性癌症的首要死因,占癌症总病例的23%和死亡病例的14%。发展中国家的癌症存活期相对较短,主要原因是癌症诊出时间偏晚和治疗手段有限。
癌症主要的治疗手段包括手术治疗、化疗及放疗。化学药物治疗是肿瘤治疗的主要手段之一,传统化疗的疗效与病人对药物的敏感程度、耐受程度和药物毒性反应等相关,多数化疗药物属于细胞毒类抗肿瘤药,具有择性差、毒性大和易产生肿瘤多药耐药等缺陷,传统化疗用药已经难以满足临床的需要。
由于肿瘤细胞有其特殊的生长模式,如无限增殖、生长信号可进行自我调节,对外界生长抑制信号敏感性较差,以及具有极强的抗细胞凋亡能力,可以自主调控供给营养血管的生成和免疫逃逸等特性,使一般的抗肿瘤药物很难达到较好的杀死肿瘤细胞的功效。而肽类对肿瘤具有较好的亲和力和较强的特异性以及以肽为基础的治疗,与其它小分子化学药物及抗体相比,由于他们体积微小,因此更容易渗透到组织中,再者就是多肽类具有低毒性等优点,还可以增加对肿瘤治疗的敏感度,因此成为近年来抗肿瘤治疗新型抗癌方法研究的热点之一。虽然多肽类化合物具有一定的活性,尤其是在抗肿瘤方面,但2015版药典收录的多肽药物仅有20多种,且皆是国外的已过专利保护期或未在我国申请专利的药物,而抗肿瘤肽仅有一种(醋酸奥曲肽),因此开发出具有自主知识产权的抗肿瘤多肽药物也成为多肽研发的一个热点。
技术实现要素:
基于此,有必要提供一种石金钱龟多肽混合物在制备抗肿瘤药物领域的应用以及包括该石金钱龟多肽混合物的抗肿瘤药物。
一种石金钱龟多肽混合物在制备抗肿瘤药物领域的应用。
在一个实施例中,所述石金钱龟多肽混合物的平均分子质量为2000~3000。
在一个实施例中,所述石金钱龟多肽混合物包括1470条肽段和313个蛋白质。
在一个实施例中,所述石金钱龟多肽混合物包括具有抗肿瘤活性的7个功能性蛋白:Ras-相关蛋白、T复合蛋白-1亚基δ、GTP结合蛋白、热休克蛋白90、Ctr转运蛋白、热休克同源蛋白71和肌动蛋白4。
在一个实施例中,所述石金钱龟多肽混合物通过如下方法制得:
按照质量比为1:5~10将石金钱龟肉糜与超纯水混合,在温度为40℃~50℃的范围内,调节pH为7~8,加入中性蛋白酶并充分反应,得到反应液;
对所述反应液进行灭酶处理后,离心除去沉淀并保留上清液,对所述上清液进行冷冻干燥,得到所述石金钱龟多肽混合物。
在一个实施例中,所述调节pH为7~8的操作为:采用NaOH调节pH为7~8。
在一个实施例中,所述灭酶处理为:80℃~90℃热处理5min~10min。
在一个实施例中,所述离心为:6000r/min~10000r/min离心10min~20min。
在一个实施例中,所述抗肿瘤药物为抗乳腺癌药物。
一种抗肿瘤药物,包括石金钱龟多肽混合物。
石金钱龟多肽混合物具有良好的抗肿瘤的作用,经过试验验证,石金钱龟多肽混合物可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖,可阻滞MDA-MB-231的G2-M期、可阻滞MCF-7的S期,并可明显抑制乳腺癌细胞MCF-7在BALB/c-Nude裸鼠体内的增殖。因此,石金钱龟多肽混合物在制备抗肿瘤药物领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1a~图1j为石金钱龟多肽混合物抑制肿瘤细胞MDA-MB-231、HeLa、SGC-7901、COLO-320、MCF-7、Hep-G2、PC-3、K562、A-375和A-549的增殖的测定图;
图2a为石金钱龟多肽混合物对乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞周期影响测定对比图;
图2b为石金钱龟多肽混合物对乳腺癌细胞MDA-MB-231的细胞周期影响测定柱状图;
图3a为石金钱龟多肽混合物对乳腺癌细胞MCF-7的细胞周期影响测定对比图;
图3b为石金钱龟多肽混合物对乳腺癌细胞MCF-7的细胞周期影响测定柱状图;
图4a为石金钱龟多肽混合物对MCF-7细胞瘤在裸鼠体内生长状况影响的测定对比图;
图4b为石金钱龟多肽混合物对MCF-7细胞瘤在裸鼠体内生长状况影响的体积测定对比图;
图4c为石金钱龟多肽混合物对MCF-7细胞瘤在裸鼠体内生长状况影响的瘤重测定对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明公开了一种石金钱龟多肽混合物在制备抗肿瘤药物领域的应用。
优选的,石金钱龟多肽混合物的平均分子质量为2000~3000。
优选的,石金钱龟多肽混合物包括1470条肽段和313个蛋白质。
优选的,石金钱龟多肽混合物包括Ras-相关蛋白(Rab)、T复合蛋白-1亚基δ(TCP-1)、GTP结合蛋白(SAR1b)、热休克蛋白90(HSP90a)、Ctr转运蛋白(ATOX1)、热休克同源蛋白71(71KDa)和肌动蛋白4。
Ras-相关蛋白(Rab)、T复合蛋白-1亚基δ(TCP-1)、GTP结合蛋白(SAR1b)、热休克蛋白90(HSP90a)、Ctr转运蛋白(ATOX1)、热休克同源蛋白71(71KDa)和肌动蛋白4均具有抗肿瘤活性。
Ras-相关蛋白(Rab)的序列如SEQ ID No.1所示,T复合蛋白-1亚基δ(TCP-1)的序列如SEQ ID No.2所示,GTP结合蛋白(SAR1b)的序列如SEQ ID No.3所示,热休克蛋白90(HSP90a)的序列如SEQ ID No.4所示,Ctr转运蛋白(ATOX1)的序列如SEQ ID No.5所示,热休克同源蛋白71(71KDa)的序列如SEQ ID No.6所示,肌动蛋白4的序列如SEQ ID No.7所示。
具体的,石金钱龟多肽混合物通过如下方法制得:
按照质量比为1:5~10将石金钱龟肉糜与超纯水混合,在温度为40℃~50℃的范围内,调节pH为7~8,加入中性蛋白酶并充分反应(中性蛋白酶的加入量为37313.43U/g,反应时间优选为10h),得到反应液;
对反应液进行灭酶处理后,离心除去沉淀并保留上清液,对上清液进行冷冻干燥,得到石金钱龟多肽混合物。
制得的石金钱龟多肽混合物经过检测,包括Ras-相关蛋白(Rab)、T复合蛋白-1亚基δ(TCP-1)、GTP结合蛋白(SAR1b)、热休克蛋白90(HSP90a)、Ctr转运蛋白(ATOX1)、热休克同源蛋白71(71KDa)和肌动蛋白4。
超纯水是指将水中的导电介质几乎全部去除,又将水中不离解的胶体物质、气体和有机物均去除至很低程度的水。一般来说,超纯水为电阻率大于18MΩ×cm的水。
优选的,调节pH为7~8的操作为:采用NaOH调节pH为7~8。
优选的,灭酶处理为:80℃~90℃热处理5min~10min。
更优选的,灭酶处理为:85℃热处理10min。
优选的,离心为:6000r/min~10000r/min离心10min~20min。
更优选的,离心为:8000r/min离心30min。
优选的,抗肿瘤药物为抗乳腺癌药物。
本发明还公开了一种抗肿瘤药物,包括上述石金钱龟多肽混合物。
石金钱龟多肽混合物具有良好的抗肿瘤的作用,经过试验验证,石金钱龟多肽混合物可明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖,可阻滞MDA-MB-231的G2-M期、可阻滞MCF-7的S期,并可明显抑制乳腺癌细胞MCF-7在BALB/c-Nude裸鼠体内的增殖。因此,石金钱龟多肽混合物在制备抗肿瘤药物领域具有良好的应用前景。
以下为具体实施例。
具体实施例中采用药物和仪器均为本领域常规选择。
实施例1、石金钱龟多肽混合物的制备
将10g石金钱龟肉糜与80g超纯水混合,在温度为45℃、pH为7.5的条件下,加入中性蛋白酶(25000U,37313.43U/g)并充分反应10h,得到反应液。
对反应液在85℃灭酶处理10min,8000r/min离心30min,除去沉淀并保留上清液,对上清液进行冷冻干燥,得到粗产物,即石金钱龟多肽混合物
将得到的石金钱龟多肽(GDP)混合物稀释成原始浓度1g/mL,4℃保存备用。
实施例2、石金钱龟多肽混合物的抗肿瘤性能测定
1、石金钱龟多肽抑制肿瘤细胞增殖的测定
取对数生长期的肿瘤细胞株制成一定浓度的细胞悬液,接种至96孔板,每孔接种5000个细胞(100μL),置于5%CO2,37℃培养箱中,培养24h后弃掉原培养基,并用PBS洗一遍,然后分别加入不同浓度的石金钱龟多肽混合物溶液,每个浓度设3个平行孔,同时设加PBS的对照组,置5%CO2,37℃培养箱,孵育24h后,倒掉原培养基,加PBS洗2遍,然后每孔加10μL MTT溶液,放培养箱孵育4h后,吸去MTT溶液,然后每孔加100μL DMSO溶液,避光充分震荡后置酶联免疫检测仪在570nm波长下测吸光度,计算细胞存活率。
实验过程中用到的肿瘤细胞株包括:MDA-MB-231、HeLa、SGC-7901、COLO-320、MCF-7、Hep-G2、PC-3、K562、A-375和A-549(均购买于ATCC细胞库),实验结果如图1a~图1j所示。
由图1a~图1j可以看出,石金钱龟多肽混合物对MCF-7和MDA-MB-231的增殖具有明显抑制作用。
2、石金钱龟多肽对肿瘤细胞细胞周期的影响
取对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231制成一定浓度的细胞悬液(1×106个/mL),加入24孔(0.2mL/孔)培养板置于5%CO2,37℃培养箱中,24h后加入不同稀释度的石金钱龟多肽,每个浓度设3个复孔,继续培养24h。用PBS液洗2次,用预冷的75%乙醇固定过夜,加入碘化丙啶染料,4℃避光染色50min,400目尼龙网过滤,用流式细胞仪检测乳腺癌细胞的细胞周期分布情况。试验结果如图2a、图2b、图3a和图3b所示。
由图2a、图2b、图3a和图3b可以看出,石金钱龟多肽混合物对MCF-7和MDA-MB-231的细胞周期具有抑制作用,石金钱龟多肽混合物可阻滞MDA-MB-231细胞的G2-M期、可阻滞MCF-7细胞的S期。
3、石金钱龟多肽动物实验测定
实验条件(实验动物和饲养环境):40只雄性BALB/c-Nude裸鼠购买于中山大学实验动物中心,鼠龄4~5周,体重16~18g。接种肿瘤前先饲养观察一周左右。将裸鼠饲养在暨南大学实验动物中心,SPF级别,饲养条件受到严格控制,恒温、恒温,并且环境中无任何病原体。裸鼠饲料及饮水都经过高温灭菌。
分组:将40只裸鼠分为5组,接种MCF-7细胞。
准备细胞:观察裸鼠的一周时间里,取对数生长期的MCF-7细胞,传代于100mm的培养皿中,置于5%CO2,37℃培养箱中培养,收集足够多的乳腺癌细胞。
裸鼠异体移植瘤模型的建立:取对数生长期的MCF-7细胞,消化(1000rpm×5min),PBS洗两遍,吸尽PBS,转移至15mL离心管中,收集MCF-7细胞,用稀释好的高浓度基质胶混匀细胞(PBS:基质胶=2:1)。调整细胞的密度,使得裸鼠接种MCF-7细胞的密度为5×106个/只,MCF-7细胞的密度为6×106个/只,每只裸鼠接种0.2mL混有细胞的基质胶。
给药:接种完细胞约一周,待肿瘤长至100mm3左右,将裸鼠随机分为5组,阴性对照组,Control组,高剂量组,中剂量组和低剂量组,隔天给药一次。每次给药前先称量裸鼠的体重并用游标卡尺记录裸鼠肿瘤的长径和短径,共给药15天。
处死:最后一次给药结束24h内,断颈法处死裸鼠,剥离其肿瘤进行称重,计算各组体内肿瘤的抑制率。
结果处理:肿瘤体积(mm3)=1/2×(L×W2),L为肿瘤的长径,W为肿瘤的短径。肿瘤抑制率(%)=(1-给药组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重)×100%。实验结果如图4a、图4b和图4c所示。
由图4a、图4b和图4c可以看出,石金钱龟多肽混合物可明显抑制乳腺癌细胞MCF-7在BALB/c-Nude裸鼠体内的增殖。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳凯联龟业有限公司
<120> 石金钱龟多肽混合物的应用以及抗肿瘤药物
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 225
<212> PRT
<213> Ras-相关蛋白
<400> 1
Gly His Arg Gln Ser Trp Gly Gly Gln Gly Trp Ala Gly Arg Gly Cys
1 5 10 15
Arg Ser Arg Val Arg Gly Thr Asp Arg Ala Val Tyr Cys Thr Gly Pro
20 25 30
Ala Pro Leu Gly Pro Pro Phe Asp Gly Phe Cys Cys Cys Val Phe Leu
35 40 45
Pro Gly Val Glu Phe Gly Ala Arg Met Ile Asn Ile Asp Ser Lys Gln
50 55 60
Ile Lys Leu Gln Ile Trp Asp Thr Ala Gly Gln Glu Ser Phe Arg Ser
65 70 75 80
Ile Thr Arg Ser Tyr Tyr Arg Gly Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Tyr
85 90 95
Asp Ile Thr Arg Arg Glu Thr Phe Asn His Leu Thr Ser Trp Leu Glu
100 105 110
Asp Ala Arg Gln His Ser Ser Ser Asn Met Val Ile Met Leu Ile Gly
115 120 125
Asn Lys Ser Asp Leu Glu Ser Arg Arg Asp Val Gln Lys Ala Glu Gly
130 135 140
Glu Ala Phe Ala Arg Glu His Gly Leu Val Phe Met Glu Thr Ser Ala
145 150 155 160
Lys Thr Ser Thr Asn Val Glu Glu Ala Phe Ile Asp Thr Ala Lys Glu
165 170 175
Ile Tyr Arg Lys Ile Gln Gln Gly Leu Phe Asp Val Asn Asn Glu Ala
180 185 190
Asn Gly Ile Lys Ile Gly Pro Gln Gln Pro Ser Gly Ala Ala Pro Gly
195 200 205
Ala Gly Ser Arg His Ser Pro Gln Gly Ser Gly Asp Ser Ser Gly Cys
210 215 220
Cys
225
<210> 2
<211> 586
<212> PRT
<213> T复合蛋白-1 亚基δ
<400> 2
Pro Leu Ser Pro Val Gly Pro Glu Val Gln Arg Leu Arg Arg Arg Val
1 5 10 15
Leu Glu Ala Ser Arg Arg Gly Ser Leu Val Arg Ala Gly Gly Pro Gly
20 25 30
Arg Ser Val Ser Ile Gln Ser Leu Ala Ala Ala Gly Arg Gly Gly Val
35 40 45
Ala Met Pro Glu Asn Ala Gly Ser Arg Ala Phe Thr Gly Gly Asn Gly
50 55 60
Gly Arg Lys Arg Ser Ala Tyr Gln Asp Arg Asp Lys Pro Ala Gln Ile
65 70 75 80
Arg Phe Ser Asn Ile Ser Ala Gly Lys Ala Val Ala Asp Ala Ile Arg
85 90 95
Thr Ser Leu Gly Pro Lys Gly Met Asp Lys Met Ile Gln Asp Gly Lys
100 105 110
Gly Asp Val Thr Ile Thr Asn Asp Gly Ala Thr Ile Leu Lys Gln Met
115 120 125
Gln Val Leu His Pro Ala Ala Lys Met Leu Val Glu Leu Ser Lys Ala
130 135 140
Gln Asp Ile Glu Ala Gly Asp Gly Thr Thr Ser Val Val Val Ile Ala
145 150 155 160
Gly Ala Leu Leu Asp Ala Cys Ser Arg Leu Leu Gln Lys Gly Ile His
165 170 175
Pro Thr Ile Ile Ser Glu Ser Phe Gln Lys Ala Leu Asp Lys Ser Thr
180 185 190
Glu Val Leu Thr Asp Met Gly Gln Pro Val Glu Leu Ser Asp Arg Glu
195 200 205
Thr Leu Leu Asn Ser Ala Thr Thr Ser Leu Asn Ser Lys Val Val Ser
210 215 220
Gln Tyr Ser Ser Leu Leu Ser Pro Met Ser Val Asp Ala Val Met Lys
225 230 235 240
Val Ile Asp Pro Thr Thr Ala Ser Ser Val Asp Leu Arg Asp Ile Lys
245 250 255
Ile Val Lys Lys Leu Gly Gly Thr Ile Asp Asp Cys Glu Leu Val Glu
260 265 270
Gly Leu Val Leu Thr Gln Lys Leu Ala Asn Thr Gly Val Thr Arg Val
275 280 285
Glu Lys Ala Lys Ile Gly Leu Ile Gln Phe Cys Leu Ser Ala Pro Lys
290 295 300
Thr Asp Met Asp Asn Gln Ile Val Val Ser Asp Tyr Ala Gln Met Asp
305 310 315 320
Arg Val Leu Arg Glu Glu Arg Ala Tyr Ile Leu Asn Leu Val Lys Gln
325 330 335
Ile Lys Lys Ala Gly Cys Asn Val Leu Leu Ile Gln Lys Ser Ile Leu
340 345 350
Arg Asp Ala Leu Ser Asp Leu Ala Leu His Phe Leu Asn Lys Met Lys
355 360 365
Ile Met Val Ile Lys Asp Ile Glu Arg Glu Asp Ile Glu Phe Ile Cys
370 375 380
Lys Thr Ile Gly Thr Lys Pro Val Ala His Ile Asp Gln Phe Ile Ala
385 390 395 400
Asp Thr Leu Gly Ser Ala Glu Leu Ala Glu Glu Val Asn Leu Asn Gly
405 410 415
Ser Gly Lys Leu Ile Lys Ile Thr Gly Cys Ala Ser Pro Gly Lys Thr
420 425 430
Val Thr Ile Val Val Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val Met Glu Glu Ala
435 440 445
Glu Arg Ser Ile His Asp Ala Leu Cys Val Ile Arg Cys Leu Val Lys
450 455 460
Lys Arg Ala Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ala Pro Glu Ile Glu Leu Ala
465 470 475 480
Leu Arg Leu Asn Glu Tyr Ala Arg Thr Leu Ser Gly Met Asp Ser Tyr
485 490 495
Cys Val Arg Ala Tyr Gly Asp Ala Met Glu Val Ile Pro Ser Thr Leu
500 505 510
Ala Glu Asn Ala Gly Leu Asn Pro Ile Ser Thr Val Thr Glu Leu Arg
515 520 525
Asn Arg His Ala Gln Gly Glu Lys Thr Ala Gly Ile Asn Ile Arg Lys
530 535 540
Gly Gly Ile Ser Asn Ile Leu Glu Glu Leu Val Val Gln Pro Leu Leu
545 550 555 560
Val Ser Leu Ser Ala Val Thr Leu Ala Thr Glu Thr Val Arg Ser Ile
565 570 575
Leu Lys Ile Asp Asp Val Val Asn Thr Arg
580 585
<210> 3
<211> 201
<212> PRT
<213> GTP结合蛋白
<400> 3
Asp Ser Asp Met Ser Phe Ile Phe Asp Trp Ile Tyr Ser Gly Phe Ser
1 5 10 15
Ser Val Leu Gln Phe Leu Gly Leu Tyr Lys Lys Ser Gly Lys Leu Val
20 25 30
Phe Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly Lys Thr Thr Leu Leu His Met Leu
35 40 45
Lys Asp Asp Arg Leu Gly Gln His Val Pro Thr Leu His Pro Thr Ser
50 55 60
Glu Glu Leu Thr Ile Ala Gly Met Thr Phe Thr Thr Phe Asp Leu Gly
65 70 75 80
Gly His Thr Gln Ala Arg Arg Val Trp Lys Asn Tyr Leu Pro Ala Ile
85 90 95
Asn Gly Ile Val Phe Leu Val Asp Cys Ala Asp His Glu Arg Leu Thr
100 105 110
Glu Ser Lys Glu Glu Leu Asp Leu Leu Met Thr Asp Glu Thr Val Ala
115 120 125
Asn Val Pro Ile Leu Ile Leu Gly Asn Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala
130 135 140
Ile Ser Glu Glu Arg Leu Arg Asp Met Phe Gly Leu Tyr Gly Gln Thr
145 150 155 160
Thr Gly Lys Gly Asn Val Ser Leu Lys Glu Leu Asn Ala Arg Pro Leu
165 170 175
Glu Val Phe Met Cys Ser Val Leu Lys Arg Gln Gly Tyr Gly Glu Gly
180 185 190
Phe Arg Trp Met Ala Gln Tyr Ile Asp
195 200
<210> 4
<211> 737
<212> PRT
<213> 热休克蛋白90
<400> 4
Gly Ala Val Ala Ala Ile Ala Ala Lys Met Pro Glu Ala Val Gln Thr
1 5 10 15
Gln Asp Gln Pro Met Glu Glu Glu Val Glu Thr Phe Ala Phe Gln Ala
20 25 30
Glu Ile Ala Gln Leu Met Ser Leu Ile Ile Asn Thr Phe Tyr Ser Asn
35 40 45
Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ser Ser Asp Ala Leu
50 55 60
Asp Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Asp Pro Ser Lys Leu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Lys Asp Leu Lys Ile Asn Ile Leu Pro Asn Lys His Asp Arg Thr
85 90 95
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100 105 110
Asn Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Lys Ala Phe Met Glu
115 120 125
Ala Leu Gln Ala Gly Ala Asp Ile Ser Met Ile Gly Gln Phe Gly Val
130 135 140
Gly Phe Tyr Ser Ala Tyr Leu Val Ala Glu Lys Val Thr Val Ile Thr
145 150 155 160
Lys His Asn Asp Asp Glu Gln Tyr Ala Trp Glu Ser Ser Ala Gly Gly
165 170 175
Ser Phe Thr Val Arg Leu Asp Asn Gly Glu Pro Leu Gly Arg Gly Thr
180 185 190
Lys Val Ile Leu His Leu Lys Glu Asp Gln Thr Glu Tyr Leu Glu Glu
195 200 205
Arg Arg Ile Lys Glu Ile Val Lys Lys His Ser Gln Phe Ile Gly Tyr
210 215 220
Pro Ile Thr Leu Phe Val Glu Lys Glu Arg Asp Lys Glu Val Ser Asp
225 230 235 240
Asp Glu Ala Glu Glu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Lys
245 250 255
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260 265 270
Glu Lys Lys Asp Gly Asp Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Glu Lys
275 280 285
Tyr Ile Asp Gln Glu Glu Leu Asn Lys Thr Lys Pro Ile Trp Thr Arg
290 295 300
Asn Pro Asp Asp Ile Thr Asn Glu Glu Tyr Gly Glu Phe Tyr Lys Ser
305 310 315 320
Leu Thr Asn Asp Trp Glu Asp His Leu Ala Val Lys His Phe Ser Val
325 330 335
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340 345 350
Pro Phe Asp Leu Phe Glu Asn Arg Lys Lys Lys Asn Asn Ile Lys Leu
355 360 365
Tyr Val Arg Arg Val Phe Ile Met Asp Asn Cys Glu Glu Leu Ile Pro
370 375 380
Glu Tyr Leu Asn Phe Met Arg Gly Val Val Asp Ser Glu Asp Leu Pro
385 390 395 400
Leu Asn Ile Ser Arg Glu Met Leu Gln Gln Ser Lys Ile Leu Lys Val
405 410 415
Ile Arg Lys Asn Leu Val Lys Lys Cys Leu Glu Leu Phe Thr Glu Leu
420 425 430
Ala Glu Asp Lys Glu Asn Tyr Lys Lys Phe Tyr Glu Gln Phe Ser Lys
435 440 445
Asn Ile Lys Leu Gly Ile His Glu Asp Ser Gln Asn Arg Lys Lys Leu
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Ser Glu Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Ser Ala Ser Gly Asp Glu Met Val
465 470 475 480
Ser Leu Lys Asp Tyr Cys Thr Arg Met Lys Glu Asn Gln Lys His Ile
485 490 495
Tyr Tyr Ile Thr Gly Glu Thr Lys Asp Gln Val Ala Asn Ser Ala Phe
500 505 510
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Ile Asn Pro Asp His Ser Ile Ile Glu Thr Leu Arg Gln Lys Ala Glu
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Ala Asp Lys Asn Asp Lys Ser Val Lys Asp Leu Val Ile Leu Leu Tyr
660 665 670
Glu Thr Ala Leu Leu Ser Ser Gly Phe Ser Leu Glu Asp Pro Gln Thr
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<400> 5
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