山芝麻酸甲酯在制备治疗化学性肝纤维化药物中的应用的制作方法

文档序号:11090714阅读:1024来源:国知局

本发明涉及中药山芝麻提取物的用途,具体地说是山芝麻酸甲酯为原料在制备治疗四氯化碳引起的化学性肝纤维化药物中的应用。



背景技术:

肝纤维化是多种慢性肝病发展成为肝硬化的必经病理环节,发病率高,严重威胁着广大人民群众的身体健康,然而,临床研究慢性肝病肝纤维化常常受到许多客观条件的限制,所以采用动物模型手段研究肝纤维化已受到普遍重视并广为接受。四氯化碳(CCl4)是诱导大鼠肝纤维化模型最广泛应用的肝毒性物质,它诱导的肝纤维化动物模型在形态学、病理生理学的某些方面与人肝纤维化相似,是国内外常用的肝纤维化模型。研究表明肝纤维化尚有逆转至正常的可能,因此阻止或逆转肝纤维化进程成为治疗慢性肝病的重要策略。

目前,临床对肝纤维化的治疗仍没有明确的方案和有效治疗药物。近些年来,国内外大量研究表明天然药物和中药在治疗肝纤维化方面显示出了可靠疗效和较少不良反应的特点。因此采用现代化技术从天然药物和中药中开发治疗肝纤维化的新药具有重要意义。

山芝麻作为一种传统草药,为梧桐科山芝麻属植物山芝麻Helictercs angustifolia L.,具有抗病毒,抗脂质氧化及护肝等多方面的作用,其活性成分之一山芝麻酸甲酯(methyl helicterate,MH)对CCl4诱导的肝损伤、炎症、肝纤维化的作用仍知之不多。



技术实现要素:

本发明的目的是通过对山芝麻酸甲酯治疗化学性肝纤维化进行研究,开发山芝麻酸甲酯为原料在制备治疗四氯化碳引起的化学性肝纤维化药物的新用途。

本发明是基于发明人的实验研究而完成的。研究分两大部分:

一、山芝麻酸甲酯的制备

提取方法:10kg山芝麻药材粉碎后,用80L 80%乙醇回流提取3次,合并3次乙醇提取液,真空回收乙醇,得到乙醇提取物;然后乙醇提取物加蒸馏水重悬,依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取,乙酸乙酯层萃取物溶解在热水中,过滤,浓缩后得到黄色粉末粗产物,接着上硅胶柱进一步分离,采用氯仿和甲醇混合物进行梯度洗脱,用薄层色谱收集相同组份,其中,第2组分上ODS柱和高效液相色谱进一步纯化,最后得到白色晶体山芝麻酸甲酯。

二、山芝麻酸甲酯治疗CCl4诱导肝纤维药效学实验

将SD雄性大鼠以CCl4诱导大鼠肝纤维化模型,观察山芝麻酸甲酯治疗化学性肝纤维化的作用。结果表明山芝麻酸甲酯能明显降低血清谷丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)的水平;肝组织前列腺素E2(PGE2)的含量;血浆白细胞介素-6(IL-6),人肿瘤坏死因子-α(TNF-α),髓过氧化物酶(MPO)的水平;降低肝组织及血清丙二醛(MDA)的水平,显著提高肝组织超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(catalase),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),谷胱甘肽还原酶(GSH-Rd)的活性,提示满天星异荭草苷具有抗脂质过氧化反应的作用。

H&E染色病理检查结果显示,正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整,以中央静脉为中心,向四周呈放射状排列,肝细胞未见变性或坏死。模型组大鼠肝细胞出现肿胀、气球样变,肝小叶被破坏,或肝局灶性坏死以及淋巴细胞浸润的现象。山芝麻酸甲酯组大鼠可观察到肝组织病理损伤比模型组明显减轻。

酶联免疫吸附(ELISA)法和比色法分别测定NF-κB p65和细胞色素P4502E1(CYP2E1)的活性,结果表明,与模型组比较,山芝麻酸甲酯可明显抑制NF-κB p65,CYP2E1的活性。

免疫组化法测定Fas,FasL和CYP2E1的表达,结果表明,与模型组比较,山芝麻酸甲酯可明显抑制Fas,FasL和CYP2E1的表达。

Western blot法测定大鼠肝组织诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、环氧酶(COX-2)、胱天蛋白酶3(caspase-3),胱天蛋白酶8(caspase-8)的表达,结果表明,与模型组比较,山芝麻酸甲酯可明显抑制iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表达。

本发明开发了山芝麻酸甲酯在制备治疗四氯化碳引起的化学性肝纤维化药物中的应用。

所述的山芝麻酸甲酯是应用于治疗四氯化碳引起的化学性慢性肝损伤。

所述的山芝麻酸甲酯是应用于治疗四氯化碳引起的肝脏炎症。

所述的山芝麻酸甲酯是应用于治疗四氯化碳引起的化学性肝纤维化。

总之,本发明首次对中药活性成分山芝麻酸甲酯治疗化学性肝纤维化进行了研究,实验表明,山芝麻酸甲酯可作用于化学性肝纤维化的多个环节或多个靶点,可有效的抑制脂质过氧化反应、清除氧自由基、抑制炎症反应、减轻肝组织病理损伤、活化NF-κB、下调Fas/FasL和CYP2E1的水平,使肝损伤明显减轻,对防治肝损伤具有独特优势。山芝麻酸甲酯对CCl4引起的肝损伤具有明显抑制作用,是治疗化学性肝纤维化的一种非常有潜在价值的新药。

具体实施方式

一、山芝麻酸甲酯的制备

提取方法:10kg山芝麻药材粉碎后,用80L 80%乙醇回流提取3次,合并3次乙醇提取液,真空回收乙醇,得到乙醇提取物248.7g。然后乙醇提取物加蒸馏水重悬,依次用乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取。乙酸乙酯层萃取物溶解在热水中,0.45um滤头过滤,浓缩后得到黄色粉末粗产物(51.6g),接着上硅胶柱(200~300目)进一步分离,采用氯仿和甲醇(0~100%甲醇,1500mL/馏分)混合物进行梯度洗脱,用薄层色谱收集相同组份,其中,第2组分上ODS柱和高效液相色谱进一步纯化,最后得到白色晶体(22.3g)。

光谱检测数据:ESI-MS(m/z):655[M+Na]+;1H NMR(CDCl3,400MHz)d:8.02(2H,dd,J=7.9,1.7Hz,H-20,-60),7.58(1H,t,J=7.4Hz,H-40),7.45(2H,t,J=7.7Hz,H-30,-50),4.74(1H,brs,H-29a),4.63(1H,brs,H-29b),4.45(1H,dd,J=11.2,5.0Hz,H-3),3.68(3H,s,17-COOCH3),3.02(1H,m,H-19),2.02(3H,s,3-OCOCH3),1.71(3H,s,H-30),1.02(3H,s,H-24),0.89(3H,s,H-25),0.82(3H,s,H-26),0.79(3H,s,H-23).13C NMR(CDCl3,100MHz)d:176.6(C-28),170.8(3-OCOCH3),166.9(27-CH2OCO–),150.1(C-20),132.6(C-40),130.5(C-10),129.3(C-30,-50),128.5(C-20,-60),110.1(C-29),80.7(C-3),63.7(C-27),56.4(C-17),55.6(C-5),52.0(17-COOCH3),51.3(C-9),49.8(C-18),46.9(C-19),45.7(C-14),41.5(C-8),39.2(C-13),38.5(C-1),37.8(C-4),37.4(C-10),36.6(C-22),35.3(C-7),32.5(C-16),30.4(C-21),27.9(C-23),25.3(C-12),24.3(C-15),23.7(C-2),21.2(3-OCOCH3),21.1(C-11),19.4(C-30),18.2(C-6),16.7(C-24),16.6(C-25),16.4(C-26)。

实验结果提示,所得单体化合物为山芝麻酸甲酯(methyl helicterate),其分子式为C40H56O6,分子量为632.89。

二、山芝麻酸甲酯治疗CCl4诱导肝纤维化药效学实验

实验方案:

(1)实验动物模型的制备、分组及处理

SD大鼠,(200±10g),适应性饲养1w后,随机分为正常对照组、模型对照组、水飞蓟素阳性对照组(silymarin),以及山芝麻酸甲酯低剂量组(MH-L)、中剂量组(MH-M)、高剂量组(MH-H),每组12只。除正常组外,其余各组大鼠灌胃给予20%CCl4(1ml/kg,溶于花生油中),每周2次,总共8周;与此同时,阳性对照组大鼠灌胃给予水飞蓟素(50mg/kg/d),山芝麻酸甲酯治疗组大鼠灌胃给予山芝麻酸甲酯(16.72、33.45、66.90mg/kg/d)作为低、中、高剂量组。正常对照组大鼠灌胃给予等容量的生理盐水。8周后,处死大鼠,取血,4000r/min离心5min后,用抗凝管(50U/ml)分别收集血清与血浆。取出肝脏,清洗干净。血清、血浆及肝组织均贮存在-80℃冰箱待用。

(2)检测指标

①肝组织病理学观察:常规病理检察;

②血清ALT,AST,ALP和ALB的水平以及肝组织PGE2的含量;

③血浆IL-6,TNF-α,MPO的水平;

④SOD、catalase、GSH-Px、GSH-Rd和MDA的检测;

⑤NF-κB p65和CYP2E1的活性;

⑥免疫组化检测肝组织Fas、FasL、CYP2E1的表达;

⑦Western blot检测肝组织iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表达;

(3)实验结果

1.肝组织病理检查情况

正常组大鼠肝小叶结构清晰且完整,以中央静脉为中心,向四周呈放射状排列,肝细胞未见变性或坏死。模型组大鼠肝细胞出现肿胀、气球样变,肝小叶被破坏,或肝局灶性坏死以及淋巴细胞浸润的现象。山芝麻酸甲酯组大鼠可观察到肝组织病理损伤比模型组明显减轻。

2.血清ALT,AST,ALP和ALB的水平以及肝组织PGE2的含量;

模型组大鼠血清ALT、AST和ALP均高于正常组老鼠,经药物干预后,silymarin组与MH-L、MH-M、MH-H组均能显著降低血清中ALT、AST和ALP的含量;模型组大鼠血清ALB低于正常组大鼠,给予药物后,silymarin组与MH-L、MH-M、MH-H组均能显著提高血清ALB水平(p<0.05或p<0.01)。结果见表1。

表1 MH对肝纤维化大鼠血清ALT,AST,ALP,ALB以及肝组织PGE2的影响

注:与正常对照组比较,ap<0.05;bp<0.05。

3.血浆IL-6,TNF-α,MPO的水平;

模型组大鼠血浆IL-6,TNF-α,MPO均高于正常组大鼠,经药物干预后,silymarin组与MH-L、MH-M、MH-H组均能显著降低血浆中IL-6,TNF-α,MPO的水平(p<0.05或p<0.01)。结果见表2。

表2 MH对肝纤维化大鼠血浆IL-6,TNF-α,MPO含量的影响

注:与正常对照组比较,ap<0.05;bp<0.05。

4.肝组织SOD、catalase、GSH-Px、GSH-Rd和MDA的活性

模型组大鼠GSH-Px、GSH-Rd、catalase和SOD低于正常组大鼠,MDA则高于正常组大鼠,给予药物后,silymarin组与MH-L、MH-M、MH-H组均能升高GSH-Px、GSH-Rd、catalase和SOD的含量,并降低MDA含量(p<0.05)。结果见表3。

表3 MH对肝纤维化大鼠肝组织SOD、catalase、GSH-Px、GSH-Rd和MDA活性的影响

注:与正常对照组比较,ap<0.05;bp<0.05。

5.NF-κB p65和CYP2E1的活性

模型组大鼠NF-κB p65和CYP2E1高于正常组大鼠,给予药物后,silymarin组与MH-L、MH-M、MH-H组均能降低NF-κB p65和CYP2E1的活性(p<0.05)。结果见表4。

表4 MH对肝纤维化大鼠肝组织NF-κB p65和CYP2E1活性的影响

注:与正常对照组比较,ap<0.05;bp<0.05。

6.肝组织Fas、FasL、CYP2E1的表达;

模型组大鼠肝组织Fas、FasL、CYP2E1的表达高于正常组大鼠,经药物干预后,silymarin组与MH-L、MH-M、MH-H组能明显降低Fas、FasL、CYP2E1的表达(p<0.05)。结果见表5。

表5 MH对肝纤维化大鼠肝组织Fas、FasL、CYP2E1表达的影响

注:与正常对照组比较,ap<0.05,bp<0.05。

7.肝组织iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表达;

模型组大鼠肝组织iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表达高于正常组大鼠,经药物干预后,silymarin组与MH-L、MH-M、MH-H组能明显降低iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白的表达(p<0.05)。结果见表6。

表6 MH对肝纤维化大鼠肝组织iNOS、COX-2、caspase-3和caspase-8蛋白表达的影响

注:与正常对照组比较,ap<0.05,bp<0.05。

8.结论:山芝麻酸甲酯可减轻CCl4引起的大鼠病理性肝损伤、减轻肝纤维化。

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