一种多肽纳米微球、制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用与流程

本发明属于肿瘤分子生物学领域，特别是涉及一种多肽纳米微球、制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

多肽在生命过程中具有关键作用，多肽药物是发展最快的领域之一，随着多肽合成技术及多肽重组表达技术的发展，越来越多的多肽药物应用于临床治疗。多肽药物具有制备方便、活性强、容易修饰、不易产生耐药性等优点，但也存在体内容易降解、半衰期短等问题。此外，许多大分子多肽具有良好的抑瘤作用，但由于其难于进入细胞发挥作用，无法作为抗肿瘤药物应用，限制了这类药物的应用。因此，迫切需要采用新的技术提高多肽穿透细胞膜/核膜的能力，提高这类药物的血浆半衰期，这一技术的突破对发展多肽/蛋白药物具有重要价值。

海鞘多肽CS5931是我们研究团队由海洋生物海鞘中获得的抗肿瘤多肽，前期研究表明，CS5931由58个氨基酸组成，分子量5931Da，可以通过线粒体途径诱导多种肿瘤细胞凋亡，对肝癌、结肠癌及肺癌等都具有很强的杀伤活性，对小鼠肝癌和人结肠癌裸鼠移植性肿瘤的抑瘤率分别达到59%和70%。CS5931具有发展成为新型抗肿瘤药物的潜力。但我们前期研究发现CS5931可以主要作用于肿瘤细胞膜表面的烯醇式酶1（Enolase1），能进入细胞内的量很少。但多肽作为药物应用，极易受到体内蛋白酶的攻击而降解，多数多肽的半衰期仅为十至几十分钟。我们测定了CS5931的半衰期，发现其在兔体内的血浆半衰期仅为22min。因此，增加多肽的半衰期对进一步提高其抗肿瘤效果具有重要意义。

纳米技术是近年来发展最快的领域之一，在生物科学的研究方面，纳米技术也获得了广泛应用，包括新型纳米药物的研发、纳米医用材料的应用都取得了突破性进展。本发明将多肽CS5931制备为纳米微球，可大大提高其抗肿瘤活性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种多肽CS5931纳米微球，并提供了该纳米微球的制备方法及其在抗肿瘤药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种多肽纳米微球，其特征在于：包括纳米载体和由载体包裹或吸附的多肽CS5931。

优选的，所述多肽CS5931由58个氨基酸组成，分子量5931Da，N末端序列为：MVVPCDGQSECPDGNT。

优选的，所述纳米载体为植物油或十二烷制备的纳米颗粒，所述植物油包括大豆油，橄榄油或其它可食用非调和油。

更优选的，所述纳米载体与多肽CS5931的体积重量比为10：1-3ml/g。

更进一步的，所述的多肽微球的制备方法，包括以下步骤：将多肽CS5931溶于5-15倍体积蒸馏水制备为水溶液，加入植物油或十二烷，将超声探头置于水油液面分界处，超声处理制备成纳米微球，采用超滤膜分离纳米微球，即得。

优选的，所述的多肽纳米微球的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将多肽CS5931溶于10倍体积蒸馏水制备为多肽水溶液，多肽水溶液按体积比3:2加入植物油或十二烷，将超声探头置于水油液面分界处，反应温度为20℃，超声强度为150W/cm²，超声时间为3min，采用超滤膜分离纳米微球，收集微球体积小于200纳米的微球，即得。

本发明还提供了上述的多肽纳米微球在抗肿瘤治疗药物中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

1）多肽CS5931具有一定的抗肿瘤活性，但其稳定性差，同时不能直接进入细胞发挥抗肿瘤作用；本发明将多肽CS5931制备成稳定的纳米微球，其稳定性显著增强，在室温（25℃）条件下保存一周而不降解。这很好地解决了多肽的保存问题，为多肽药物的应用开辟了新的途径。

2）本发明将具有显著抗肿瘤活性的多肽CS5931制备为多肽纳米微球，经MTT法检测，该纳米微球具有更高的抗肿瘤活性，其半数抑制浓度（IC₅₀）约为多肽CS5931的十分之一，抗肿瘤活性显著增强。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明。

附图1为本发明的多肽CS5931纳米微球用戊二醛固定后的电镜扫描图。

附图2为本发明的多肽CS5931纳米微球的甲醛变性PAGE凝胶电泳图，图中，M：蛋白Marker；1：Cs5931凝胶电泳；2：Cs5931纳米微球凝胶电泳。

附图3为本发明的多肽CS5931纳米微球对结肠癌HCT116和肝癌Bel7402细胞增殖作用图；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。

实施例1.多肽CS5931纳米微球的制备方案

多肽CS5931参照以下文献方法进行制备：

MarDrugs.2016Mar21;14(3).pii:E47.doi:10.3390/md14030047.

将多肽CS5931溶于10倍体积蒸馏水制备为多肽水溶液，多肽水溶液按体积比3:2加入保护油层（大豆油），将超声探头置于水油液面分界处（≈150W/cm²），反应温度设定为20℃，超声时间为3Min。采用20kDa的超滤膜分离纳米微球，纳米微球分离出来后经DLS和SME方法分析其大小及粒径分布。多肽CS5931纳米颗粒用戊二醛固定后用扫描电镜分析，实施结果见附图1所示，标尺：100纳米。结果表明应用此方法可制备为200纳米直径大小的多肽CS5931纳米微球，且成均质分布在溶液中。

实施例2.多肽CS5931纳米微球体外稳定性检测

为检测多肽CS5931纳米微球的体外稳定性，将制备得到多肽CS5931样品和采用本发明制备的多肽纳米微球样品，分别在25℃条件下放置0-7天，期间用紫外分光广度计在280纳米处监测蛋白的紫外吸收值变化，结果表明，多肽CS5931放置7天后，吸收度显著降低，但其纳米微球，吸收度没有变化，说明多肽CS5931制备为纳米微球后稳定性显著升高。进一步我们采用甲醛变性PAGE凝胶电泳检测多肽CS5931的完整性，以评价多肽CS5931纳米微球在室温条件下的保存时间。实施结果见附图2，结果表明：多肽CS5931应用实施例1的方法制备为纳米颗粒后可以在室温25℃条件下存放7天而保持多肽的完整性，但未经处理的多肽CS5931在室温条件下存放7天完全降解。

实施例3.多肽CS5931纳米微球体外抗肿瘤活性检测

消化收集处于对数生长期的结肠癌HCT116和肝癌Bel7402细胞，每孔3000个细胞接种于96孔板，24h后，分别加入不同浓度的未处理的多肽及纳米微球（0.25、0.5、1、2、4µM）、阴性对照采用PBS缓冲液，分别于44h加入0.5mg/mLMTT，4h后每孔加入DMSO150µL，溶解后于490nm处测吸收。计算不同浓度的抑制率，并计算IC₅₀。存活率计算公式如下：存活率(%)=OD_实验/OD_对照×100。

不同浓度的多肽及纳米微球对结肠癌HCT116和肝癌Bel7402细胞的抑制曲线如图3所示。可以看出，多肽能剂量依赖性抑制HCT116和肝癌Bel7402细胞生长，IC₅₀分别为7.9和9.5µM，而多肽制备为纳米微球后抗肿瘤活性大大升高，且对这两种细胞的IC₅₀分别为0.75，1.1µM。