一种用于治疗皮肤创面的组合物及其制备方法与流程

本发明属于蛋白质/多肽药物技术领域，具体而言，本发明涉及一种包含FGF-21的药物组合物，其用于治疗皮肤创面。另外，本发明还涉及包括该药物组合物的药物制剂和应用等。

背景技术：

皮肤，人体最大的器官，不仅作为人体的第一道物理防线，保护机体免受外来因素的侵害，同时具备许多生物学功能，例如免疫监视、自我修复等。烧伤、烫伤、糖尿病和压疮等疾病使皮肤的完整性遭到破坏，引起多种严重不良后果。皮肤损伤是医学界最普遍、最繁重的问题，给患者带来严重的心理负担和沉重的经济负担。在我国，每年有数百万急性创伤病例，包括烧烫伤、手术伤口、外伤等。据统计，每年我国创面修复与再生治疗需求高达1亿人次左右。损伤使组织暴露在环境中，增加病人感染的可能性，造成体液流失，电解质紊乱。

皮肤创面愈合也是一个高度复杂、需要多因素共同协调的动态过程。此过程涉及多个不同、部分重叠的阶段，因此涉及的药物可能会非常多。例如，中国专利申请第201310083149号公开了一种促进皮肤组织快速生长修复的生物制剂，其特征在于，包含如下重量比的组分：活性生长因子群及营养成份20-50份和生物总黄酮1份，所述的活性生长因子群及营养成份包含表皮生长因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、干细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子、(碱性)成纤维细胞生长因子(bFGF)、胶原蛋白、透明质酸、多肽、核酸、氨基酸。

然而，本发明人发现，现有技术中的蛋白质类药物(也称活性生长因子群及营养成份)不但成分复杂，而且用量大，非常不容易稳定生产，难以在实践中推广应用。尤其是，现有的成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)家族不同成员的功能和结构各不相同，目前有23种，能确认选择其中之一已属不易。

本发明人没有在现有技术的困难面前退缩，经过长期的艰苦研究，尤其是结合本发明人的经验，发现了一种包含FGF-21的成分组合，其中蛋白质类药物的用量不但少，而且明确，适合推广应用。更令人意外地，其中的FGF-21用量无需高即可取得更优异的药效，这样高效而低成本的效果更是预料之外的。而且，研究之后，本发明人进行检索，发现与本发明的成分最接近的现有技术是苏仲春等人的论文(中国病理生理杂志2013，29(2):294-301)，然而其是为了培养干细胞，而不是使用干细胞，更不是为了治疗治疗皮肤创面。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种用于治疗皮肤创面的药物组合物。外，本发明还提供了包括该药物组合物的药物制剂和应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了用于治疗皮肤创面的药物组合物，其包括成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、银杏叶总黄酮和干细胞。

FGF21是现有已知的，而且现有技术热衷于研究FGF21的非天然突变体，例如中国专利申请200880009653、200980130476、200980150308、201080031036、201180028014、201410150150号，而本发明人发现，使用人天然FGF21(即未经上述突变的FGF21)的效果更好，因此在本发明的具体实施方式中，FGF21是人天然FGF21。

EGF也是现有已知的，在本发明的具体实施方式中，EGF是人天然EGF，其可以通过重组生产，如可参见中国专利申请00117272号。另外，本发明的EGF可以替换成酸性纤维原细胞生长因子或胰岛素样生长因子。

银杏叶总黄酮又称为银杏叶总黄酮苷提取物，其通常与银杏叶总内酯提取物混合为银杏叶提取物来组合使用。本发明单独使用银杏叶总黄酮，其制备方法可参见中国专利申请02129905号中记载的银杏叶总黄酮苷提取物的制备方法。

干细胞可以选自脂肪干细胞、骨髓干细胞、骨髓间充质干细胞、皮肤源祖细胞、脐血干细胞、外周血干细胞和表皮干细胞的一种或几种组合，优选是骨髓间充质干细胞。尽管本发明人认为自体的干细胞效果更佳，但是为了稳定生产和避免伦理问题，在本发明的具体实施方式中，干细胞是已经公开作为商品销售的Prochymal。

优选本发明第一方面的药物组合物由成纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子(EGF)、银杏叶总黄酮和干细胞组成。

也优选在本发明第一方面的药物组合物中，FGF21、EGF、银杏叶总黄酮和干细胞的比例为0.2-20μg：0.2-20μg：10-1000μg：1×10⁵-1×10⁷个，优选为1-3μg：1-3μg：50-150μg：5×10⁵-1.5×10⁶个，最优选为2μg：2μg：100μg：1×10⁶个。尤其是本发明人令人意外地发现，FGF21不是越多越好，因此最优比例的FGF21不但疗效好，而且节约了FGF21的成本。

在第二方面，本发明提供了用于治疗皮肤创面的药物制剂，其包括本发明第一方面的药物组合物和药学上可接受的辅料。在本文中，药学上可接受的辅料指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、载体、溶剂或其他制剂辅料。例如，稀释剂、赋形剂，如微晶纤维素、甘露醇等；填充剂，如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，如碳酸钙和/或碳酸氢钠；吸收促进剂，如季铵化合物；表面活性剂，如十六烷醇；载体、溶剂，如水、生理盐水、高岭土、皂粘土等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。本发明第一方面的药物组合物优选用生理盐水溶解或稀释。本发明人发现，本发明第一方面的药物组合物同时混合于生理盐水中，容易快速失效，因此其中各成分分别溶于生理盐水，这样可以保存更长时间。优选在本发明的具体实施方式中，药学上可接受的辅料是生理盐水和/或肝素-泊洛沙姆复合物。

肝素-泊洛沙姆复合物是现有已知的，如参见中国专利申请201110280783号。在本发明的具体实施方式中，肝素-泊洛沙姆复合物刚加入到液体中的时候，在正在形成水凝胶的过程中，加入药物活性成分。肝素-泊洛沙姆复合物本身对创伤修复没有疗效，但是其能增强本发明第一方面的药物组合物的疗效。因此优选在本发明第二方面的药物制剂中，FGF21和肝素-泊洛沙姆复合物的比例为0.2-20μg：50-5000μg，优选为1-3μg：250-750μg，最优选为2μg：500μg，其其他物质的比例可以通过换算得到。

在第三方面，本发明提供了本发明第一方面的药物组合物在制备用于治疗皮肤创面的药物中的应用。

优选在本发明第三方面的应用中，皮肤创面是由烧伤、冷伤、挤压伤、刃器伤、火器伤或冲击伤造成的。

也优选在本发明第三方面的应用中，药物是本发明第二方面的药物制剂。

在另一个方面，本发明提供了本发明第二方面的药物制剂的制备方法，其包括用生理盐水溶解或稀释FGF21、EGF、银杏叶总黄酮和干细胞，分别形成FGF21溶液、EGF溶液、银杏叶总黄酮溶液和干细胞溶液，然后混合入药学上可接受的辅料。尤其是当使用肝素-泊洛沙姆复合物的情况下，当其刚加入到液体中的时候，在正在形成水凝胶的过程中，加入FGF21溶液、EGF溶液、银杏叶总黄酮溶液和干细胞溶液。

本发明取得的有益效果在于：所有成分的生物相容性好，无毒性，低免疫原性，可降解，至今未发现副作用和不良反映；可有效减少创伤的炎症反应，减少创伤面积，促进创面愈合，尤其对顽固性创伤(如，糖尿病病人的创伤)的治疗效果显著；成分明确，高成本成分的用量少，成本低，有利于其实际推广和应用。

为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们全文在本文中完整记载过一遍了。以下将通过具体的实施例和附图对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

附图说明

图1：皮肤创伤治疗后伤口愈合情况。

图2：组织在第17天的HE染色。

图3：组织在第17天的马森染色。

图4：组织在第17天的免疫荧光染色。

具体实施方式

下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是,下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的,它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1 本发明的药物的制备

①成纤维细胞生长因子21溶液的配制：取天然人成纤维细胞生长因子21，用生理盐水溶解，配制成10mg/mL的溶液；

②表皮生长因子溶液的配制：取天然人表皮生长因子，用生理盐水溶解，配制成10mg/mL的溶液；

③银杏叶总黄酮溶液的配制：取银杏叶总黄酮，用生理盐水溶解，配制成10mg/mL的溶液；

④干细胞溶液的配制：取骨髓间充质干细胞Prochymal(可购自美国Osiris公司)，用生理盐水稀释至浓度为1×10⁹/L；

按照表1各组分投料配比，加入18％(w/v)肝素-泊洛沙姆复合物的水凝胶中(还未形成水凝胶时立即投料)，搅拌混合，配制得到实验药物。

表1不用组别的药物配方

注：“-”代表此项不添加物质。

实施例2 皮肤全层切除模型的建立和评价

取6-7周大的C57BL/6雄性小鼠，以4％水合氯醛腹腔注射麻醉(剂量为0.01ml/g)，用胶布固定小鼠四肢，用剃毛机剃去老鼠背部毛发，脱毛膏去除干净，使用酒精对其背部皮肤进行消毒。将环形胶圈固定在在背部中线两侧，距离耳朵2.5cm处的位置上，使环形胶圈完美贴合在背部。采用圆形皮肤打孔器在其背部做两个直径为6mm的创面，防止皮肤由于皱缩而愈合。

将动物随机分组(组别见表1)，其中对照组(实验组7)：皮肤创伤后，不给药，只给予相同剂量的生理盐水；其他组分别给药实施例1制备的各种药物。然后，用3M透明敷料覆盖在创面上，防止伤口感染。用无菌弹力绷带环绕老鼠创面一周，固定，防止老鼠咬硅胶片。

实施例3 疗效评价

于17天后，进行整体的效果评价，其指标如下：

a.行为学：比较实验开始和结束时的小鼠背部皮肤创面恢复情况；

b.组织形态学：给药治疗17天后，处死各组大鼠，收集损伤的皮肤组织，制作病理切片并进行HE染色和Massion染色观察，其中，镜下观察发现给药组(实验组1C，FGF-21)的再上皮化程度和肉芽组织的厚度明显高于对照组(实验组7，Control)(见附图2)，与对照组(实验组7，Control)相比，给药组(实验组1C，FGF-21)的胶原含量表达更高，并且它的排列更加规则(见附图3)；

c.结构和功能蛋白的表达水平：收集损伤的皮肤组织，运用免疫荧光染色和免疫组化染色检测各组损伤皮肤内各内皮细胞标记物(显示创伤后的血管生成情况)的表达水平，其中，与对照组(实验组7，Control)相比，给药组(实验组1C，FGF-21)血管表达量明显增加(见附图4)。

表2：不同实验组疗效评价

各试验组从行为学、组织形态学、结构和功能蛋白水平三方面进行综合评分，将各指标分级，“-”表示无效，“+”表示三项指标均有改善或升高，其中，行为学中的“+”表示创面愈合效率，“+”越多表示各指标改善越明显或表达越，创面大小越缩小；组织形态学中的“+”表示再生胶原增多，排列紧密有序，肉芽组织增生明显；结构和功能蛋白水平中的“+”表示相应蛋白的表达升高。

整体的效果评价结果如表2所示，其中，使用少量的肝素-泊洛沙姆复合物本身，对创伤修复没有作用，但是与其他活性成分联合使用，能较大幅度增加疗效；纤维细胞生长因子21(FGF21)、表皮生长因子类药物、银杏叶总黄酮和干细胞的四种成分组合能对创伤愈合显著起效，缺失其中一种成分都会使整体效果差一些；尤其令人惊讶的是，FGF21不是用量越多越好，而是以2μg的用量为最佳。

在实验期间，进行创面愈合评价，计算创面愈合率(％)＝(造模第一天创面面积—取材日创面面积)/造模第一天创面面积×100％。分别在第0、3、7、12、17天测量创面面积。通过肉眼观察，发现给药组(实验组1C，FGF-21)的创面愈合情况显著优于对照组(实验组7，Control)(见附图1)。