一种用于增强记忆力的血浆提取物及其制备方法和应用与流程

文档序号:12075263
一种用于增强记忆力的血浆提取物及其制备方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域,涉及一种血浆提取物,具体地,涉及一种从血浆中分离的、用于增强记忆力的混合物及其制备方法,该混合物可用于预防、改善和治疗老年痴呆症,并具有增强记忆力的作用。



背景技术:

阿尔兹海默综合症(Alzheimer′s disease,AD)又叫老年痴呆症,是老年期常见的一类慢性、进行性神经细胞退型性病变,其特点是病人的记忆和认知能力逐渐丧失。病人在确诊后3到9年内死亡,占临床死亡病例的50%到56%。该病病因目前的认识是大脑内积累的异常折叠的beta-淀粉样蛋白和Tau蛋白导致了老年痴呆症。

老年痴呆症目前市场上的药物主要是西药,其特征是必须长期坚持服用,然而却疗效微小,只能缓解部分症状,不能控制病情的发展。长期服用的另外一个缺陷是药物副作用大,同时病人产生药物依赖性。例如,中国发明专利申请“一类具有改善阿尔兹海默病作用的β1-肾上腺素受体激动剂”(申请号:201210543597.5),公开了一类具有β1-肾上腺素受体激动活性的化合物或其药学上可接受的盐,用于治疗阿尔茨海默病。但该化合物对于阿尔茨海默病的疗效尚不明确。为此,市场上急需疗效更好,副作用性更低的药物用于该病。

目前的最新研究表明:给年老老鼠持续注射年轻老鼠的血浆能提升年老老鼠的认知水平(Villeda S.A.Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.Nature Medicine 2014;20:659-663)。为此,血浆中可能含有某些物质能有效的提升老年痴呆症患者的认知水平。但是,这些物质的具体组分、以及分离获取方法还未见报道。



技术实现要素:

针对现有技术的缺陷,本发明的目的之一在于提供一种用于增强记忆力的血浆提取物。

本发明的目的之二在于提供上述血浆提取物的制备方法。

本发明的目的之三在于提供上述血浆提取物的应用。

为了实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:

一种用于增强记忆力的血浆提取物,包括多种蛋白质和多种小分子;所述血浆分离物的SDS-PAGE变性胶电泳至少包括5条肉眼清晰可见的条带,所述条带的分子量为:25kD、35kD、50kD、69kD、105kD。

在血浆提取物的优选实施方式中,通过蛋白质谱分析,所述血浆提取物中至少含有57种蛋白,具体如下方表1所示。优选地,所述多种小分子至少包括与所述57种蛋白中任何一种蛋白结合的小分子。

在血浆提取物的优选实施方式中,所述血浆来源于哺乳动物;优选地,所述血浆来源于人类。

为了实现上述目的,本发明采用了以下另一技术方案:

上述用于增强记忆力的血浆提取物的制备方法包括以下步骤:血浆收集、分子量截留、SD灭活、离心分离、阴离子交换、透析、浓缩;优选地,该制备方法在血浆收集步骤和分子量截留步骤之间还包括:低温过滤步骤和低温超滤步骤。

在制备方法的优选实施方式中,在所述血浆收集步骤中,利用抗凝管收集血液,再通过离心收集上清液,得到血浆;优选地,所述离心中,离心力为500-1000g,时间为10-20分钟,离心温度为0-15℃。

在制备方法的优选实施方式中,在所述低温过滤步骤中,在压力条件下将所述血浆进行过滤,得到滤液;优选地,滤膜的孔径为不小于0.22微米,更优选所述滤膜的孔径为0.22微米和0.45微米;优选地,所述过滤的温度为0-5℃,压力为1-20MPa。

在制备方法的优选实施方式中,在所述低温超滤步骤中,将所述滤液通过施加压力进行膜包超滤,得到低温超滤产物;优选地,所述膜包截留分子量为3kD-10kD;优选地,所述超滤的温度为0-8℃,压力为1-20MPa;优选地,所述超滤使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HBS缓冲液中的一种;更优选地,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-8.8,所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-500mM、pH值为6.0-9.2,所述HBS缓冲液的浓度为0.5-350mM、pH值为6.4-8.4;更优选地,所述缓冲液为100mM、pH值为8.0的Tris-盐酸缓冲液。

在制备方法的优选实施方式中,在所述分子量截留步骤中,将所述血浆或所述低温超滤产物通过施加压力进行分子量截留,得到分子量截留产物;优选地,所述分子量截留产物的分子量为大于10kD,更优选为大于10kD至小于等于50kD;优选地,所述施加压力的方式为:将所述低温超滤产物置于浓缩管中进行离心;更优选地,所述浓缩管允许10-50kD的物质通过;所述离心的离心力为500-3000g,时间为10-120分钟,温度为0-15℃;优选地,所述施加压力的方式为:将所述低温超滤产物置于浓缩杯中通过液氮进行加压;更优选地,所述浓缩杯允许10-50kD的物质通过;所述加压的压力为1-20MPa,加压时间为4-8小时。

在制备方法的优选实施方式中,在所述SD灭活步骤中,将所述分子量截留产物用SD灭活剂重新悬浮后静置,得到灭活产物;优选地,所述静置温度为4~28℃,时间为6~24小时;更优选为所述静置温度为20℃,时间为8小时;优选地,所述SD灭活剂含有0.3~2%的N-丁基三磷酸盐、0.5~2%的吐温。

在制备方法的优选实施方式中,在所述离心分离步骤中,将所述灭活产物离心后保留上清液,得到离心分离产物;优选地,所述离心中,离心力为2000-5000g,时间为10-20分钟,温度为0-6℃。

在制备方法的优选实施方式中,在所述阴离子交换步骤中,将所述离心分离产物加入阴离子交换柱中进行步级洗脱,收集洗脱液,混合后得到阴离子交换产物;优选地,所述步级洗脱中,先用第一次洗脱缓冲液洗脱,得到第一次洗脱液;再用第二次洗脱液洗脱,得到废液;再用第三次洗脱液洗脱,得到第三次洗脱液;合并所述第一次洗脱液和第三次洗脱液,得到阴离子交换产物;更优选地,所述第一次洗脱液缓冲液中含有100-150mM的氯化钠,所述第二次洗脱液缓冲液含有250-300mM的氯化钠,所述第三次洗脱液缓冲液含有450-500mM的氯化钠;进一步优选地,所述第一次洗脱缓冲液、第二次洗脱缓冲液、第三次洗脱缓冲液,均为浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2的Tris-盐酸缓冲液。

在制备方法的优选实施方式中,在所述透析步骤中,将所述阴离子交换产物进行透析,收集透析容器中的产物得到透析产物;优选地,所述透析使用的透析缓冲液为Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、HBS缓冲液中的一种;更优选地,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-8.8,所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-500mM、pH值为6.0-9.2,所述HBS缓冲液的浓度为0.5-350mM、pH值为6.4-8.4;进一步优选地,所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液;优选地,所述透析的时间为20-72h;优选地,所述透析的体积比是1:(100-10000)。

在制备方法的优选实施方式中,在所述浓缩步骤中,将所述透析产物进行浓缩,得到浓缩产物,即为所述血浆提取物;优选地,所述透析产物的体积是所述浓缩产物的不小于5倍,更优选为5-100倍;优选地,所述浓缩是采用浓缩管离心,所述浓缩管允许1.5-3.5KD的物质通过,所述离心中,离心力为1000-1500g,温度为2-8℃;优选地,所述浓缩是采用浓缩杯加压,所述浓缩杯允许1.5-3.5KD的物质通过,所述加压的压力为1-20MPa。

为了实现上述目的,本发明采用了以下另一技术方案:

一种药物组合物,包含上述血浆提取物和药学上可接受的载体。

在药物组合物的优选实施方式中,所述药学上可接受的载体为:药学上可接受的缓冲液、蛋白质、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性剂中的一种或多种。

在药物组合物的优选实施方式中,所述药物组合物包括如下组分:1倍体积的上述血浆提取物,9倍体积的8.5wt%NaCl或1.5M、pH7.0的PBS;优选地,所述药物组合物中还包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺;更优选地,所述白蛋白在所述药物组合物中的质量体积百分比为2%,所述葡萄糖在所述药物组合物中的质量体积百分比为1%,所述谷氨酰胺在所述药物组合物中的质量体积百分比为3%。

为了实现上述目的,本发明采用了以下另一技术方案:

一种缓释制剂,包含上述血浆提取物或者上述药物组合物、以及药学上可接受的生物相容物质;优选地,所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。

为了实现上述目的,本发明采用了以下另一技术方案:

一种试剂盒,包含上述血浆提取物、上述药物组合物,或上述缓释制剂。

为了实现上述目的,本发明采用了以下另一技术方案:

上述血浆提取物、上述药物组合物、上述缓释制剂或上述试剂盒,在预防、改善或/和治疗老年痴呆症药物中的应用。

上述血浆提取物、上述药物组合物、上述缓释制剂、上述试剂盒,在增强记忆力药物中的应用。

相比于现有技术,本发明具有如下有益效果:

1、本发明提供的从血浆提取物可以比血浆和目前药物更有效地提升老年痴呆症患者的认知水平。与此同时,长期服用这种混合物可以大大降低长期服用西药带来的副作用和药物依赖。

2、本发明制备的血浆提取物可以用于预防、改善和治疗老年痴呆症,此外其还可以起到增强记忆力的作用。

3、本发明的血浆提取物的制备方法简单易行,可以直接工业化放大,大量生产血浆提取物供临床应用。

4、本发明的血浆提取物的制备方法的各个步骤及其参数之间协同作用,共同提高了该血浆提取物的疗效。

附图说明

图1:检测例1中,实施例1制备的HC4201614血浆提取物SDS-变性胶电泳鉴定结果电泳图。泳道M:蛋白分子量标准;泳道1-4:HC4201614血浆提取物。

图2:检测例1中,不同处理后的原代海马细胞的显微照片。往不同的培养有原代海马细胞的DMEM培养基里分别加入HC4201614血浆提取物,和未处理的人血浆,作为实验组;对照组海马细胞中加入了生理盐水。一天后在显微镜下对海马细胞进行成像;图中(a)、(b)、(c)分别是HC4201614血浆提取物、未处理的人血浆、生理盐水(即对照组)处理后的原代海马细胞。

图3:检测例1中,实施例1制备的HC4201614血浆提取物抑制原代海马细胞凋亡的活性的柱状图。往不同的培养有原代海马细胞的DMEM培养基里分别加入HC4201614血浆提取物,和未处理的人血浆,作为实验组;对照组海马细胞中只加生理盐水;一天后在显微镜下对海马细胞进行计数,计算实验组细胞数目和对照组细胞数目。

图4:检测例1中,实施例1制备的HC4201614血浆提取物促进原代海马细胞之间突触形成的活性的散点图;往不同的培养有原代海马细胞的DMEM培养基里分别加入HC4201614血浆提取物,和未处理的人血浆,作为实验组;对照组海马细胞中只加生理盐水;一天后在显微镜下对突触数目进行计数,计算实验组突触数目和对照组突触数目。

图5:检测例1中,实施例1制备的HC4201614血浆提取物提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力动物模型数据的柱状图。将HC4201614血浆提取物系统地注射到阿尔兹海默症小鼠模型中;通过水迷宫实验,评价给药对阿尔兹海默症小鼠记忆力的提升作用。

具体实施方式

为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明,下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明,但本发明并不限于此。

首先,本发明提供一种用于增强记忆力的血浆提取物,其来源于血浆,即从血浆中分离出的血浆提取物HC4201614,所述混合物包括多种蛋白质和多种小分子,所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳具有5条肉眼清晰可见的条带,所述条带的分子量为:25kD、35kD、50kD、69kD、105kD。

通过蛋白质谱(比如MS/MS)分析鉴定,所述血浆提取物至少含有57种蛋白,具体如以下表1所示;所述血浆提取物中还含有多种小分子,其中至少包括与所述57种蛋白中任何一种蛋白结合的小分子。

表1:本发明血浆提取物含有的蛋白

所述血浆来源于哺乳动物,比如人类、鼠类等,优选来源于人类。

其次,本发明提供述血浆提取物血浆提取物HC4201614的制备方法,所述血浆提取物从血浆提取制备而成,所述制备方法依次包括以下步骤:血浆收集、分子量截留、SD灭活、离心分离、阴离子交换、透析、浓缩步骤;优选地,在血浆收集步骤之后,分子量截留步骤之前,该制备方法还包括低温过滤步骤和低温超滤步骤。具体如下:

(1)血浆收集:

利用抗凝管收集血液,再通过离心收集上清液,得到血浆;优选地,所述离心力为500-1000g,离心时间为10-20min,离心温度为0-15℃。

在本发明的实施例中,上述离心力可以为500g、750g、800g、1000g等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述离心时间可以为10min、15min、20min等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述离心温度可以为0℃、5℃、7℃、10℃、15℃等中任意值或任意两者之间的数值范围。

为进一步控制最终制备得到的血浆分离物的质量,优选地,所述血浆收集步骤之后还需要进行低温过滤步骤和低温超滤步骤,之后再进行分子量截留等步骤。

(2)低温过滤:

将所述血浆收集步骤得到的血浆加入滤器中,使用蠕动泵施加压力进行过滤(压力范围为1-20MPa),得到滤液;所述滤器的滤膜孔径不小于0.22微米,优选为0.22或0.45微米,整个过滤装置的温度控制在0-5℃,优选为0-4℃。

上述滤膜孔径不能小于0.22微米,不然血细胞不能通过过滤除去;同时过滤的温度不能高于5℃,最好是0-4℃,不然最终产物里面的蛋白可能变性从而失去活性。本步骤是为了去除血浆中可能残留的血细胞。

在本发明的实施例中,上述压力可以为1MPa、5MPa、10MPa、15MPa、20MPa等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述温度可以为0℃、2℃、45℃、6℃、8℃等中任意值或任意两者之间的数值范围。

(3)低温超滤:

将所述低温过滤得到的滤液进行膜包超滤,使用蠕动泵施加压力(范围为1~20MPa),得到低温超滤产物;在膜包超滤过程中,有效成分会进入缓冲液中;所述膜包截留的分子量为3kD-10kD,超滤使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液,Tris-盐酸缓冲液和HBS缓冲液等常用缓冲液,整个超滤装置的温度控制在0-8℃,优选地,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-8.8,所述磷酸缓冲液的浓度为1-500mM、pH值为6.0-9.2,所述HBS缓冲液的浓度为0.5-350mM、pH值为6.4-8.4;更优选地,所述缓冲液为100mM、pH值为8.0的Tris-盐酸缓冲液。

上述膜包孔径不能大于10kD,不然在超滤过程中一些有效果的蛋白就会流失;上述超滤的温度应该控制在0-8℃,不然最终产物里面的蛋白可能变性从而失去活性。本步骤将血浆里面的物质置换到在pH确定的缓冲液中,从而方便控制溶液体系的pH。

在本发明的实施例中,上述压力可以为1MPa、5MPa、10MPa、15MPa、20MPa等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述膜包截留分子量可以为3kD、5kD、7kD、10kD等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述Tris-盐酸缓冲液的浓度可以为0.2mM、1mM、5mM、10mM、50mM、100、125mM、150mM、200mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为7.0、8.0、8.5、8.8等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述磷酸缓冲液的浓度可以为1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、350mM、400mM、500mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为6.0、7.0、8.0、9.2等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述HBS缓冲液的浓度可以为0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、300mM、350mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为6.4、7.0、7.5、8.0、8.4等中任意值或任意两者之间的数值范围。

(4)分子量截留:

所述分子量截留步骤中,将所述低温超滤产物(如果不进行低温过滤和低温超滤步骤,则将步骤一得到的血浆)通过浓缩管或浓缩杯施加压力进行分子量截留,得到分子量截留产物,所述浓缩管或浓缩杯允许10-50kD的物质通过;例如:当用10kD的浓缩管或浓缩杯时,将浓缩管或浓缩杯中截留到的分子量大于10kD的物质作为分子量截留产物;当用50kD的浓缩管或浓缩杯时,将浓缩管或浓缩杯中截留到的分子量大于50kD的物质作为分子量截留产物;

其中,第一种施加压力的方式为:将所述低温超滤产物(或血浆)置于浓缩管中进行离心,收集上清液作为分子量截留产物;所述浓缩管允许10-50kD的物质通过,所述离心的离心力为500-3000g,时间为10-120分钟,温度为0-15℃;第二种施加压力的方式为:将所述低温超滤产物(或血浆)置于浓缩杯中通过液氮进行加压;所述浓缩杯允许10-50kD的物质通过,收集杯中剩余的物质作为分子量截留产物,加压时间4-8小时;所述加压的压力为1-20MPa。

本步骤中,当浓缩管或浓缩杯允许通过的物质大于50kD时,一些分子量小于50kD的有效成分将会在操作过程中流逝,当浓缩管或浓缩杯允许通过的物质小于10kD时,该操作又会非常地耗时。温度设定为0到15℃,高于15度℃,最终产物里的一些有效果的蛋白组分可能会变性失去活性,低于0度℃,该操作对温控仪器的要求又会显著地提高。本步骤的目的是分离得到本发明中有功效的蛋白组分以及这些蛋白结合的小分子。

在本发明的实施例中,上述离心力可以为500g、1000g、1500g、2000g、3000g等中任意值或任意两者之间的数值范围,时间可以为10min、30min、60min、90min、120min等中任意值或任意两者之间的数值范围,温度可以为0℃、5℃、10℃、15℃等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述压力可以为1MPa、5MPa、10MPa、15MPa、20MPa等中任意值或任意两者之间的数值范围。

(5)SD灭活:

将所述分子量截留产物用SD灭活剂重新悬浮,放于4~28℃静置6~24h,优选20℃静置8h,得到灭活产物;SD灭活剂含有0.3~2%TnBP(N-丁基三磷酸盐)和0.5~2%Tween80,优选为含有0.3%TnBP和1%Tween80。SD灭活剂的配制如下:以配制100mL的SD灭活剂为例,将0.3-2ml TnBP溶于适量水中,然后加入0.5~2mLTween80,混合均匀后用水补至100mL。

上述静置的温度不能低于4℃,时间不能短于6小时,不然病毒灭活的效果会比较一般,不同病毒的灭活时间也不同。本步骤的目的是使得初始原料人血中的潜在病毒失去活性,从而提高最终产品的安全性。

在本发明的实施例中,上述静置的时间可以为6h、8h、12h、18h、20h、24h、28h等中任意值或任意两者之间的数值范围,温度可以为4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述TnBP的百分比浓度可以为0.3%、0.5%、1%、1.5%、2%等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述Tween80的百分比浓度可以为0.5%、1%、1.5%、2%等中任意值或任意两者之间的数值范围,。

(5)离心分离:

将所述灭活产物进行离心分离,保留上清液,作为离心分离产物;优选地,所述离心力为2000-5000g,离心时间为10-20min,离心温度为0-6℃。

上述离心力不能小于2000g,离心时间不能小于10min,不然变性聚集沉淀的杂蛋白会出现沉降不实的情况。本步骤去除了一些因为SD病毒灭活步骤而变性聚集沉淀的杂蛋白,不然这些变性聚沉的杂蛋白会干扰下游的阴离子交换步骤。

在本发明的实施例中,上述离心力可以为2000g、2500g、3000g、4000g、5000g等中任意值或任意两者之间的数值范围,时间可以为10min、12min、15min、20min等中任意值或任意两者之间的数值范围,温度可以为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、6℃等中任意值或任意两者之间的数值范围。

(7)阴离子交换:

将所述离心分离产物加入阴离子交换柱(比如SourceQ)中,进行步级洗脱,收集洗脱液,混合后得到阴离子交换产物;

其中,所述步级洗脱中,先用第一次洗脱缓冲液洗脱,得到第一次洗脱液;再用第二次洗脱缓冲液洗脱,得到废液;再用第三次洗脱缓冲液洗脱,得到第三次洗脱液;合并所述第一次洗脱液和第三次洗脱液,得到阴离子交换产物;选择洗脱3次的目的是去除第二次洗脱得到的废液;因为第二次洗脱的液体,对神经元细胞有毒性,若不去除,将会大大降低最终整个混合物的疗效;上述每次洗脱中,等紫外检测器显示出现蛋白时开始收集即可,蛋白出完时停止收集,即得到每一次洗脱的洗脱液;如果采用这些范围以外的参数,制备出的产物,其蛋白和小分子组成上和HC4201614差异会较大,与此同时疗效会显著下降。

所述第一次洗脱缓冲液中含有100-150mM的氯化钠,所述第二次洗脱缓冲液含有250-300mM的氯化钠,所述第三次洗脱缓冲液含有450-500mM的氯化钠;三次洗脱的洗脱缓冲液均为浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2的Tris-盐酸缓冲液;每次的洗脱速度控制在仪器允许的范围内,如2-5ml/min。

在本发明的实施例中,上述第一次洗脱缓冲液中氯化钠的浓度可以为100mM、110mM、125mM、140mM、150mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述第二次洗脱缓冲液中氯化钠的浓度可以为250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述第三次洗脱缓冲液中氯化钠的浓度可以为450mM、460mM、470mM、480mM、490mM、500mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述Tris-盐酸缓冲液的浓度可以为0.2mM、0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为7.0、8.0、8.5、9.2等中任意值或任意两者之间的数值范围。

(8)透析:

将所述阴离子交换后的产物放入透析袋或管中进行透析,透析后收集透析袋或管中的产物,作为透析产物;其中,所述透析时使用的透析缓冲液为Tris-盐酸缓冲液,磷酸缓冲液或HBS缓冲液;优选地,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-8.8,所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-500mM、pH值为6.0-9.2,所述HBS缓冲液的浓度为0.5-350mM、pH值为6.4-8.4;更优选地,所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液;透析时间为20-72h,透析体积比是1:(100-10000)。

本步骤中的透析时间小于20小时,会发生杂质去除不完全的情况,当透析时间超过72小时,生产的时间成本又会显著增加。本步骤中的透析操作,可以去除之前步骤中的杂质,如灭活剂,以防止该介质对下游产品制备产生不良影响;当透析体积比小于1:100时,之前步骤中的杂质,如灭活剂等将不能完全去除;当透析体积比大于1:10000时,将会使用大量的透析同时需要大量的时间透析,增加时间成本。

在本发明的实施例中,上述Tris-盐酸缓冲液的浓度可以为0.2mM、1mM、5mM、10mM、50mM、100mM、125mM、150mM、200等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为7.0、7.5、8.0、8.5、8.8等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述磷酸缓冲液的浓度可以为1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、350mM、400mM、500mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为6.4、7.0、7.5、8.0等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述HBS缓冲液的浓度可以为0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、300mM、350mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为6.0、7.0、8.0、8.4等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述透析时间可以为20h、25h、50h、60h、72h等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述透析体积比可以为1:100、1:500、1:1000、1:2500、1:5000、1:10000等中任意值或任意两者之间的数值范围。

(9)浓缩:

将所述透析产物进行浓缩,得到浓缩后的产物即所述血浆提取物HC4201614;其中,浓缩前体积是浓缩后体积的不小于5倍,优选为5-100倍;优选地,所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的,所述浓缩管允许1.0-3.5KD的物质通过,所述离心力为1000-1500g,温度为2-8℃,浓缩倍数达到要求后停止浓缩即可;优选地,所述浓缩是采用浓缩杯加压的方式进行的,所述浓缩杯允许1.5-3.5KD的物质通过,所述加压的压力范围为1~20MPa。

当浓缩倍数低于5倍时,单位成分的疗效一般,且渗透压偏低,需要另行补充一些氯化钠调节渗透压;浓缩使用的压力小于1MPa或者离心力小于1000g时,浓缩速度会非常慢,耗时比较长;所用的浓缩管或浓缩杯大小大于3.5kD时,最终制备的混合物里面的一些有效成分会流失,但当浓缩管或浓缩杯大小小于1.5kD时,浓缩速度也会非常慢,耗时比较长;浓缩温度高于8℃时,浓缩过程中一些有效成分可能会因为温度偏高而变性从而失去活性,浓缩温度低于2℃时,温度控制系统的价钱又会相对较高,同时存在浓缩产物因为温度太低发生聚集沉淀的风险;本步骤的目的之一是提高所述血浆提取物HC4201614中有效组分的浓度,从而提高单位成分的疗效;目的之二是通过浓缩,调节溶液的渗透压。

在本发明的实施例中,上述倍数可以为5倍、10倍、15倍、25倍、50倍、75倍、100倍等中任意值或任意两者之间的数值范围,所述浓缩管、浓缩杯允许通过的物质的大小均为1.5KD、1.75KD、2KD、2.25KD、2.5KD、3.0kD、3.5kD等中任意值或任意两者之间的数值范围,所述离心力为1000g、1100g、1200g、1300g、1400g、1500g等中任意值或任意两者之间的数值范围可以为温度为2℃、4℃、5℃、8℃等中任意值或任意两者之间的数值范围,所述压力为1MPa、5MPa、7.5MPa、10MPa、15MPa等中任意值或任意两者之间的数值范围。

上述制备方法中使用的各种常用试剂均采用常规方法配制。

再者,本发明提供一种药物组合物,包含所述血浆提取物HC4201614和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括:药学上可接受的缓冲液、蛋白质、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性剂中的一种或多种。

作为优选的实施方式,所述药物组合物包括如下组分:1倍体积的所述血浆提取物HC4201614,9倍体积的8.5wt%NaCl或1.5M、pH7.0的PBS;优选地,所述药物组合物中还包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺,其中,所述白蛋白在所述药物组合物中的质量体积百分比为2%,所述葡萄糖在所述药物组合物中的质量体积百分比为1%,所述谷氨酰胺在所述药物组合物中的质量体积百分比为3%。

再者,本发明提供一种缓释制剂,包含所述血浆提取物HC4201614以及药学上可接受的生物相容物质;优选地,所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊;所述药学上可接受的生物相容物质包括:含水的pH缓冲液,包括磷酸盐、柠檬酸盐、或其他有机酸的缓冲液、抗坏血酸或其他抗氧化剂,低分子量(不超过10个残基)多肽、血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白或其他蛋白质、聚乙烯吡咯烷酮或其他亲水性多聚体、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸或其他氨基酸、单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精或其他糖类、EDTA或其他螯合剂、甘露醇、山梨醇或其他糖醇、钠离子或其他成盐反离子、聚乙二醇(PEG)、或其他非离子表面活性剂。

再者,本发明提供一种试剂盒,包含有:所述血浆提取物HC4201614、或/和包含所述血浆提取物HC4201614的上述药物组合物、或/和包含所述血浆提取物HC4201614的上述缓释剂。

再者,本发明提供所述血浆提取物HC4201614、或/和包含所述血浆提取物HC4201614的上述药物组合物、或/和包含所述血浆提取物HC4201614的上述缓释剂、或/和包含所述血浆提取物HC4201614的上述试剂盒,在预防、改善或/和治疗老年痴呆症的药物中的应用。

最后,本发明提供所述血浆提取物HC4201614、或/和包含所述血浆提取物HC4201614的上述药物组合物、或/和包含所述血浆提取物HC4201614的上述缓释剂、或/和包含所述血浆提取物HC4201614的上述试剂盒,在增强记忆力的药物中的应用。

下面通过实施例对本发明混合物的制备、鉴定和应用进行说明。以下实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法,请参照SambrookJ等主编,科学出版社,2002,分子克隆实验指南(第三版)或相应产品的说明书。

下面通过实施例对本发明混合物的制备、鉴定和应用进行说明。以下实施例中使用的原代海马细胞是按照如下参考文献培养的:Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronal activity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J Cell Sci 127(Pt 10):2249-2260。

实施例1

本实施例是血浆提取物HC4201614的制备方法,该方法包括以下步骤:

(1)收集血浆

健康人的血液由医院献血所得,采血管为抗凝管,采血过程中边放血边摇晃采血管,防止血液凝固;将含有血液的采血管放入离心机,设定离心力为800g,离心15分钟,离心温度为4℃;然后用移液器小心吸取上清,即为收集到的人血浆。

(2)低温过滤:

将收集到的血浆加入滤膜孔径为0.22微米的滤器中,使用蠕动泵施加压力10MPa进行过滤,其过程中整个过滤装置的温度控制在0-4℃,得到滤液。

(3)低温超滤:

将该滤液用截留的分子量为8kD的膜包超滤,使用蠕动泵施加压力10MPa,其过程中使用的缓冲液为浓度100mM、pH8.0的Tris盐酸缓冲液,整个超滤装置的温度控制在0-4℃,收集超滤后的缓冲液得到低温超滤产物。

(4)分子量截留:

将该低温超滤产物放入允许30kD的物质通过的浓缩管中,于4℃离心力2000g离心60分钟,收集、上清液,得到分子量截留产物。

(5)SD灭活:

将该分子量截留淀产物用SD灭活剂(含有1%TnBP,1%Tween80)重新悬浮,放于25℃静置10小时,静置后的产物即为灭活产物。

(6)离心分离:

将该灭活产物于3500g、0-4℃离心15分钟,保留上清液,作为离心分离产物。

(7)阴离子交换:

将该离心分离产物加入阴离子交换柱(比如SourceQ,购自GE Healthcare,平均粒度为30微米,阴离子交换柱体积为25毫升)中,先用含有125mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第一次洗脱,保留洗脱液;接着用含有275mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第二次洗脱,废弃洗脱液;最后用含有475mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第三次洗脱,保留洗脱液;合并上述第一次和第三次洗脱得到洗脱液,作为阴离子交换产物。

每次洗脱中,紫外显现有蛋白出现时开始收集,蛋白出峰完毕时停止收集,即得到该次洗脱的洗脱液;每次洗脱速度为4ml/min,上样速度为3ml/ml。

(8)透析:

将该离子交换产物加入到孔径约为0.25纳米透析袋中,然后将该透析袋放入1L的烧杯中,再向该烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0),边搅拌边透析,透析体积比为1:1000;透析温度为4℃,透析时间为24小时,得到透析产物。

(9)浓缩:

取少量该透析产物加入到体积为2mL的浓缩管中,浓缩管允许大小为2.5kD的物质通过;再将浓缩管放入离心机中,设定离心力为1200g,设定温度为4℃,启动离心机,开始浓缩,直到最终体积为500微升;之后,将剩余的该透析产物的再次加入该离心管中,以使体积达到2mL,以相同的参数进行离心,再次浓缩至最终体积为500微升;如此循环浓缩,直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升,作为浓缩产物,即为上述血浆提取物HC4201614。

检测例1

本实施例是对实施例1制备的血浆提取物HC4201614进行各种检测。

检测1:SDS-PAGE变性胶电泳鉴定,该鉴定方法包括以下步骤:

(1)从上述血浆提取物HC4201614里取出2微升,在紫外280nm下测定其吸光度,从而计算血浆提取物HC4201614的蛋白浓度。

(2)取一定体积的血浆提取物HC4201614,与1微升5×蛋白上样缓冲液(购自北京兰博利德生物技术有限公司,货号D621)混合,即为需要进行电泳的样品,该样品里面有10微克的蛋白质。

(3)将电泳样品升温至100℃,加热20分钟使蛋白质变性,然后立即将样品放到冰上,等待5分钟后开始跑SDS-PAGE变性还原胶(所述SDS变性还原胶的配制方法如下:30(w/v)%的丙烯酰胺Acr-Bis(购自GEHealthcare)取1.3ml、1.5MTris-盐酸缓冲液(pH8.8,购自GEHealthcare)取1.3ml、10(w/v)%的SDS取0.05ml、10%(w/v)过硫酸铵(购自GEHealthcare)取0.05ml、TEMED(购自GEHealthcare)取0.003ml、以及水取2.3ml,共计5ml,混合后在室温即可凝固成胶)。跑胶时,每个泳道的蛋白上样量为10微克,设定跑胶电压为100V,开始跑胶,跑胶时间为1小时。

(4)跑完胶后,用考马斯亮蓝染色液(该染色液的制备方法为:将2.5g考马斯亮蓝R-250溶于500ml95%乙醇溶液,加入100ml85%的乙酸溶液,然后,用蒸馏水补充至1000ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定)对胶进行染色。

检测结果参见图1:其中:泳道M:蛋白分子量标准;泳道1-4:HC4201614混合物;该血浆提取物HC4201614里至少含有5条肉眼可见多肽,其分子量分别为从小到大依次是25kD、35kD、50kD、69kD、105kD。

检测2:蛋白质质谱鉴定,该鉴定方法包括如下步骤:

(1)将血浆提取物HC4201614转移到FALCON管中,加入两倍体积的样品缓冲液(缓冲液的配方为:7.5M尿素UREA,1.5M硫脲THIOUREA,4(w/v)%3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS,0.05(w/v)%十二烷基硫酸钠SDS,100mM二硫苏糖醇DDT,各组分前的所示浓度是其相应组分在缓冲液中的浓度),并通过3kDamolecular weight cut-off spin columns(Pall GmbH,Austria)离心管离心浓缩,得到浓缩液。

(2)浓缩液用二硫苏糖醇进行还原反应,得到还原产物;其中,浓缩液与二硫苏糖醇的体积比为1:3,反应时间为15分钟,温度为室温。

(3)再将该还原产物与碘乙酰胺进行反应,得到烷基化产物;其中,该还原产物与碘乙酰胺的体积比1:1,反应时间为15分钟,温度为室温;

(4)随后用胰蛋白酶在37℃进行消化反应过夜,其中烷基化产物与胰蛋白酶的体积比1:1,得到消化后的肽段。

(5)胰蛋白酶消化所得肽段通过C18色谱柱纯化,得到样品。

(6)所得样品真空离心干燥并随后保存在-20℃冰箱中用于MS/MS分析。MS/MS分析具体如下:HPLC用的是Ultimate 3000系统,其中配备了PepMap100 C-18 trap column(300μm×5mm)和PepMap100 C-18 analytical column(75μm×250mm)两根柱子。质谱仪采用Amazon speed ETD,MS数据采集范围为400-1400m/z,MS/MS的肽段处理范围为100-2800m/z。随后,每个MS数据会自动搜索与其匹配的三个质量最好的CID MS/MS峰谱。喷嘴口电压设置为1400伏特。氮气保护的温度为150℃,流速为3升/分钟。MS的蛋白质识别和无标记定量(LFQ)数据分析采用开放源代码软件MaxQuant 1.3.0.5。通过搜索SwissProt数据库(版本10/2003 20354项)对蛋白质进行鉴定,鉴定结果参见表1。

检测3:检测血浆提取物HC4201614具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法包括以下步骤:

(1)从上述血浆提取物HC4201614里取出2微升,在紫外280nm下测定其吸光度,从而计算上述血浆提取物HC4201614的蛋白浓度。

(2)用24孔板培养原代海马细胞,培养所用培养基为DMEM,培养条件为37℃,5vol%二氧化碳。

(3)等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时,往培养基里加入血浆提取物HC4201614,每个孔中加入的血浆提取物HC4201614含蛋白1000微克,作为实验组1-血浆提取物HC4201614。同时实验组中还包括:即往不同孔的培养基里分别加入蛋白含量为1000微克的人血浆(实施例1制备方法的步骤(1)制备得到),命名为实验组2-人血浆。同时设置对照组,在对照组中,等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时,往孔的培养基中添加100微升的生理盐水。

(4)在原先的条件下继续培养细胞24小时,然后在光学显微镜下对各实验组和对照组进行细胞数量和突触数量的计数。

如图2,其中(a),(b),(c)分别是按照实验组1-HC4201614、实验组2-人血浆、对照组处理后得到的原代海马细胞。可观测到无论是海马细胞数量还是形成的突触数量,实验组1-HC4201614混合物均远远大于对照组,大于实验组2-人血浆。

如图3,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1250-1700个/平方厘米,远大于实验组2的约500-750个/平方厘米,和对照组的约400-700个/平方厘米,证明血浆提取物HC4201614具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。

如图4,实验组1的突触形成数量达到约140个/平方厘米,远大于实验组2的约70个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明分离物HC4201614具有促进海马细胞之间突触形成的活性。

检测4:检测血浆提取物HC4201614能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力,该检测方法包括以下步骤:

(1)本实施例采用5XFAD老年痴呆小鼠模型,订购于美国jackson laboratory,并按照动物实验标准进行繁殖和饲养;其中每一只实验模型小鼠都通过鼠尾进行基因鉴定,确保APP基因和PS1基因的稳定突变。

小鼠的分组为:实验组1-血浆提取物HC4201614:采用20只14周龄5XFAD雄性小鼠,注射实施例1制备的血浆提取物HC4201614;实验组2-人血浆:采用20只14周龄5XFAD雄性小鼠,注射实施例1制备方法的步骤(1)制备得到的血浆;对照组:采用20只14周龄5XFAD雄性小鼠,注射生理盐水。

各种给药通过鼠尾静脉注射进小鼠体内,实验组保证30微克蛋白/次的给药剂量,在行为学实验(具体为水迷宫实验,用于检测小鼠的学习能力和记忆力)前24天内每三天给药1次,共给药8次。

(2)水迷宫实验:在每天上午8点到下午1点间进行。水迷宫空间记忆训练期为4天,每天4次,每次训练间隔时间为10分钟;在实验中,每四个小鼠被随机分为一个训练组。对于每个训练组,水迷宫的平台位置被随机分配,且在整个训练中保持不变。训练中,小鼠从任意位置释放入水迷宫中,并允许它在120秒中搜索隐藏的平台。如果小鼠没有在120秒内找到平台,它将被引导到平台。每次训练中找到平台所用的时间和所经过的距离被智能摄像头自动记录下来。

水迷宫测试在最后一次训练48小时后进行。每次测试中,每只小鼠被释放入没有放置平台的水迷宫中,并允许其自由活动60秒。其游动路线被智能摄像头自动记录下来。测试期比训练期时间短一倍,以避免小鼠产生抑郁行为。小鼠在目标象限所花费的时间与其他三个象限所花费的时间被记录下来,用于对小鼠记忆力的评估。测试结果如图5,实验组1的目标象限停留记忆时间约为90秒,远远长于实验组2的约10秒和对照组的约5秒。

实施例2

本实施例中,除步骤(9)不同于实施例1以外,其他制备步骤均与实施例1相同,在本实施例中,步骤(9)具体如下:

将实施例1步骤(8)制备的透析产物加入允许2.5kD物质通过的浓缩杯中,盖上浓缩杯盖,将浓缩杯放入的层析柜,然后将浓缩杯接上液氮瓶,打开液氮瓶气阀门,设定压力为10MPa;在此气压下,浓缩杯开始浓缩透析后产物,观测到浓缩后产物的体积是浓缩前的1/50时,停止浓缩,得到浓缩产物,即为血浆提取物HC4201614。

检测例2

对实施例2制备的血浆提取物HC4201614进行各种检测。

检测1-3:采用与检测例1相同的方法对实施例2得到的血浆提取物HC4201614进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。

检测4:检测实施例2制备的血浆提取物HC4201614具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与检测例1中相同。检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1350-1800个/平方厘米,远大于实验组2的约500-750个/平方厘米,和对照组的约400-700个/平方厘米,证明血浆提取物HC4201614具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约150个/平方厘米,远大于实验组2的约70个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明分离物HC4201614具有促进海马细胞之间突触形成的活性。证明HC4201614混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。

检测5:检测实施例2制备的血浆提取物HC4201614能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与检测例1中相同。测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间约为100秒,远远长于实验组2的约10秒和对照组的约5秒。

实施例3

本实施例中,除步骤(4)不同于实施例1以外,其他制备步骤均与实施例1相同,在本实施例中,步骤(4)具体如下:

将实施例1步骤(1)制备的血浆加入允许30kD物质通过的浓缩杯中,盖上浓缩杯盖,将浓缩杯放入的层析柜,然后将浓缩杯接上液氮瓶,打开液氮瓶气阀门,设定压力为10MPa,加压480分钟,得到分子量截留产物。

检测例3

对实施例3制备的血浆提取物HC4201614进行各种检测。

检测1-3:采用与检测例1相同的方法对实施例3得到的血浆提取物HC4201614进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。

检测4:检测实施例3制备的血浆提取物HC4201614具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与检测例1中相同。检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1200-1500个/平方厘米,远大于实验组2的约500-750个/平方厘米,和对照组的约400-700个/平方厘米,证明血浆提取物HC4201614具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约150个/平方厘米,远大于实验组2的约70个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明分离物HC4201614具有促进海马细胞之间突触形成的活性。证明HC4201614混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。

检测5:检测实施例10制备的血浆提取物HC4201614能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与实施例5中相同。测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间约为90秒,远远长于实验组2的约10秒和对照组的约5秒。

实施例4

本实施例是血浆提取物HC4201614的制备方法,该方法包括以下步骤:

(1)收集血浆:与实施例1中步骤(1)的方法相同。

(2)低温过滤:

将收集到的血浆加入滤膜孔径为0.45微米的滤器中,使用蠕动泵施加压力20MPa进行过滤,其过程中整个过滤装置的温度控制在0-4℃,得到滤液。

(3)低温超滤:

将该滤液用截留的分子量为3kD的膜包超滤,使用蠕动泵施加压力20MPa,其过程中使用的缓冲液为浓度100mM、pH8.0的Tris盐酸缓冲液,整个超滤装置的温度控制在0-4℃,收集超滤后的缓冲液得到低温超滤产物。

(4)分子量截留:

将该低温超滤产物放入允许10kD的物质通过的浓缩管中,于0℃离心力500g离心120分钟,收集上清液,得到分子量截留产物。

(5)SD灭活:

将该分子量截留产物用SD灭活剂(含有1%TnBP,1%Tween80)重新悬浮,放于4℃静置24小时,静置后的产物即为灭活产物。

(6)离心分离:

将该灭活产物于2000g、0℃离心20分钟,保留上清液,作为离心分离产物。

(7)阴离子交换:

将该离心分离产物加入阴离子交换柱(比如SourceQ,购自GE Healthcare,平均粒度为30微米,阴离子交换柱体积为25毫升)中,先用含有125mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第一次洗脱,保留洗脱液;接着用含有275mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第二次洗脱,废弃洗脱液;最后用含有475mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第三次洗脱,保留洗脱液;合并上述第一次和第三次洗脱得到洗脱液,作为阴离子交换产物。

每次洗脱中,紫外显现有蛋白出现时开始收集,蛋白出峰完毕时停止收集,即得到该次洗脱的洗脱液;每次洗脱速度为4ml/min,上样速度为3ml/ml。

(8)透析:

将该离子交换产物加入到孔径约为0.25纳米透析袋中,然后将该透析袋放入1L的烧杯中,再向该烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0),边搅拌边透析;透析温度为4℃,透析时间为20小时,得到透析产物。

(9)浓缩:

取少量该透析产物加入到体积为2mL的浓缩管中,浓缩管允许大小为1.5kD的物质通过;再将浓缩管放入离心机中,设定离心力为1000g,设定温度为4℃,启动离心机,开始浓缩,直到最终体积为500微升;之后,将剩余的该透析产物的再次加入该离心管中,以使体积达到2mL,以相同的参数进行离心,再次浓缩至最终体积为500微升;如此循环浓缩,直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升,作为浓缩产物,即为上述血浆提取物HC4201614。

检测例4

对实施例4制备的血浆提取物HC4201614进行各种检测。

检测1-3:采用与检测例1相同的方法对本实施例得到的血浆提取物HC4201614进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。

检测4:检测实施例4制备的血浆提取物HC4201614具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与实施例4中相同。检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1200-1750个/平方厘米,远大于实验组2的约500-750个/平方厘米,和对照组的约400-700个/平方厘米,证明血浆提取物HC4201614具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约120个/平方厘米,远大于实验组2的约70个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明分离物HC4201614具有促进海马细胞之间突触形成的活性。证明HC4201614混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。

检测5:检测实施例4制备的血浆提取物HC4201614能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与实施例5中相同。测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间约为90秒,远远长于实验组2的约10秒和对照组的约5秒。

实施例5

本实施例是血浆提取物HC4201614的制备方法,该方法包括以下步骤:

(1)收集血浆:与实施例1中步骤(1)的方法相同。

(2)低温过滤:

将收集到的血浆加入滤膜孔径为0.22微米的滤器中,使用蠕动泵施加压力20MPa进行过滤,其过程中整个过滤装置的温度控制在0-4℃,得到滤液。

(3)低温超滤:

将该滤液用截留的分子量为10kD的膜包超滤,使用蠕动泵施加压力1MPa,其过程中使用的缓冲液为浓度100mM、pH8.0的Tris盐酸缓冲液,整个超滤装置的温度控制在0-4℃,收集超滤后的缓冲液得到低温超滤产物。

(4)分子量截留:

将该低温超滤产物放入允许50kD的物质通过的浓缩管中,于0℃离心力3000g离心10分钟,收集上清液,得到分子量截留产物。

(5)SD灭活:

将该分子量截留产物用SD灭活剂(含有1%TnBP,1%Tween80)重新悬浮,放于28℃静置6小时,静置后的产物即为灭活产物。

(6)离心分离:

将该灭活产物于5000g、4℃离心10分钟,保留上清液,作为离心分离产物。

(7)阴离子交换:

将该离心分离产物加入阴离子交换柱(比如SourceQ,购自GE Healthcare,平均粒度为3微米,阴离子交换柱体积为25毫升)中,先用含有100mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第一次洗脱,保留洗脱液;接着用含有250mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第二次洗脱,废弃洗脱液;最后用含有450mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第三次洗脱,保留洗脱液;合并上述第一次和第三次洗脱得到洗脱液,作为阴离子交换产物。

每次洗脱中,紫外显现有蛋白出现时开始收集,蛋白出峰完毕时停止收集,即得到该次洗脱的洗脱液;每次洗脱速度为4ml/min,上样速度为3ml/ml。

(8)透析:

将该离子交换产物加入到孔径约为0.25纳米透析袋中,然后将该透析袋放入1L的烧杯中,再向该烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0),边搅拌边透析;透析温度为4℃,透析时间为72小时,得到透析产物。

(9)浓缩:

取少量该透析产物加入到体积为2mL的浓缩管中,浓缩管允许大小为3.5kD的物质通过;再将浓缩管放入离心机中,设定离心力为1500g,设定温度为4℃,启动离心机,开始浓缩,直到最终体积为500微升;之后,将剩余的该透析产物的再次加入该离心管中,以使体积达到2mL,以相同的参数进行离心,再次浓缩至最终体积为500微升;如此循环浓缩,直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升,作为浓缩产物,即为上述血浆提取物HC4201614。

采用与实施例2-3相同的方法对本实施例得到的血浆提取物HC4201614进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。

检测例5

检测1-3:采用与检测例1相同的方法对实施例5得到的血浆提取物HC4201614进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。

检测4:检测实施例5制备的血浆提取物HC4201614具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与检测例1中相同。检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1400-1800个/平方厘米,远大于实验组2的约500-750个/平方厘米,和对照组的约400-700个/平方厘米,证明血浆提取物HC4201614具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约120个/平方厘米,远大于实验组2的约70个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明分离物HC4201614具有促进海马细胞之间突触形成的活性。证明HC4201614混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。

检测5:检测实施例5制备的血浆提取物HC4201614能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与测试例1中相同。测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间约为100秒,远远长于实验组2的约10秒和对照组的约5秒。

实施例6

本实施例是血浆提取物HC4201614的制备方法,该方法包括以下步骤:

(1)收集血浆:与实施例1中步骤(1)的方法相同。

(2)低温过滤:

将收集到的血浆加入滤膜孔径为0.22微米的滤器中,使用蠕动泵施加压力15MPa进行过滤,其过程中整个过滤装置的温度控制在0-4℃,得到滤液。

(3)低温超滤:

将该滤液用截留的分子量为5kD的膜包超滤,使用蠕动泵施加压力15MPa,其过程中使用的缓冲液为浓度100mM、pH8.0的Tris盐酸缓冲液,整个超滤装置的温度控制在0-4℃,收集超滤后的缓冲液得到低温超滤产物。

(4)分子量截留:

将该低温超滤产物放入允许40kD的物质通过的浓缩管中,于5℃离心力1000g离心90分钟,收集上清液,得到分子量截留产物。

(5)SD灭活:

将该分子量截留产物用SD灭活剂(含有1%TnBP,1%Tween80)重新悬浮,放于15℃静置15小时,静置后的产物即为灭活产物。

(6)离心分离:

将该灭活产物于4000g、6℃离心15分钟,保留上清液,作为离心分离产物。

(7)阴离子交换:

将该离心分离产物加入阴离子交换柱(比如SourceQ,购自GE Healthcare,平均粒度为3微米,阴离子交换柱体积为25毫升)中,先用含有150mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第一次洗脱,保留洗脱液;接着用含有300mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第二次洗脱,废弃洗脱液;最后用含有500mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液(100mM、pH8.0)进行第三次洗脱,保留洗脱液;合并上述第一次和第三次洗脱得到洗脱液,作为阴离子交换产物。

每次洗脱中,紫外显现有蛋白出现时开始收集,蛋白出峰完毕时停止收集,即得到该次洗脱的洗脱液;每次洗脱速度为4ml/min,上样速度为3ml/ml。

(8)透析:

将该离子交换产物加入到孔径约为0.25纳米透析袋中,然后将该透析袋放入1L的烧杯中,再向该烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0),边搅拌边透析;透析温度为4℃,透析时间为50小时,得到透析产物。

(9)浓缩:

取少量该透析产物加入到体积为2mL的浓缩管中,浓缩管允许大小为2kD的物质通过;再将浓缩管放入离心机中,设定离心力为1200g,设定温度为4℃,启动离心机,开始浓缩,直到最终体积为500微升;之后,将剩余的该透析产物的再次加入该离心管中,以使体积达到2mL,以相同的参数进行离心,再次浓缩至最终体积为500微升;如此循环浓缩,直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升,作为浓缩产物,即为上述血浆提取物HC4201614。

检测例6

对实施例6制备的血浆提取物HC4201614进行各种检测。

检测1-3:采用与检测例1相同的方法对实施例6得到的血浆提取物HC4201614进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。

检测4:检测实施例:6制备的血浆提取物HC4201614具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与检测例1中相同。检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1000-1500个/平方厘米,远大于实验组2的约500-750个/平方厘米,和对照组的约400-700个/平方厘米,证明血浆提取物HC4201614具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约100个/平方厘米,远大于实验组2的约70个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明分离物HC4201614具有促进海马细胞之间突触形成的活性。证明HC4201614混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。

检测5:检测实施例6制备的血浆提取物HC4201614能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与检测例1中相同。测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间约为100秒,远远长于实验组2的约10秒和对照组的约5秒。

实施例7

除步骤(3)低温超滤步骤中使用的膜包截留的分子量为13kD以外,其他操作步骤与实施例1相同。

该实施例得到的最终产物命名为C1,C1电泳结果如下:25kD、35kD、50kD、69kD、105kD;采用与检测例1相同的方法测试该产物C1抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性,其结果如下:

实验组1的原代海马细胞的数量达到约800-950个/平方厘米,实验组2的约550-780个/平方厘米,和对照组的约430-700个/平方厘米。实验组1的突触形成数量达到约82个/平方厘米,实验组2的约68个/平方厘米,对照组的约54个/平方厘米。

实施例8

除省略了步骤(4)分子量截留步骤外,其他操作步骤与实施例1相同。

该实施例得到的最终产物命名为C2,C2电泳结果如下:8kD、25kD、35kD、50kD、69kD、105kD;采用与检测例1相同的方法测试该产物C2抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性,其结果如下:

实验组1的原代海马细胞的数量达到约780-890个/平方厘米,实验组2的约500-750个/平方厘米,和对照组的约450-700个/平方厘米。实验组1的突触形成数量达到约80个/平方厘米,实验组2的约65个/平方厘米,对照组的约53个/平方厘米。

实施例9

除省略了步骤(5)和(6)以外,其他操作步骤与实施例1相同。

该实施例得到的最终产物命名为C3,C3电泳结果如下:25kD、35kD、50kD、69kD、105kD;采用与检测例1相同的方法测试该产物C3抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性,其结果如下:

实验组1的原代海马细胞的数量达到约790-960个/平方厘米,实验组2的约560-760个/平方厘米,和对照组的约440-710个/平方厘米。实验组1的突触形成数量达到约80个/平方厘米,实验组2的约66个/平方厘米,对照组的约53个/平方厘米。

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