本发明涉及药物组合物、医疗装置和化妆品组合物领域。
更具体地说，本发明涉及预防和治疗皮肤血管纤维瘤，特别是发生于结节性硬化综合征及其不悦目的皮肤表现。
结节性硬化症(或结节性硬化综合征的缩写tsc，或称为布尔纳维氏病)是与mtor通路的遗传缺陷相关的罕见疾病：它是一种常染色体显性突变，与编码肿瘤调节分子的tsc1和tsc2基因相关；这些基因的缺陷导致参与细胞自动调节的mtor通路的活化。
tsc的病理生理学特征是异常的血管形成和异常的细胞迁移和分化；此类疾病包括皮肤、心脏、脑和肾脏疾病；预后取决于疾病的内脏和神经系统发展。
tsc的皮肤病症状出现早，这是这种疾病的典型表现：
-第一皮肤症状为在刚出生的最初几个月先天存在或后天获得的色素斑点。然后，在鼻子和脸颊上出现蝴蝶状分布的面部血管纤维瘤(“皮脂腺瘤”，红斑或肿块的皮疹)。其由血管和纤维组织构成。在儿童期开始出现这种在社交方面尴尬的皮疹，可以使用磨皮术或激光治疗去除；
-甲周纤维瘤：也称为克南氏瘤(koenen'stumors)，这些瘤是在脚趾甲或指甲附近或下部生长的小肉质肿瘤，如果扩大或引起出血可能需要手术切除。这在儿童期非常罕见，但在中年时很常见。也可以由甲床创伤引起；
-血管纤维瘤，是包含许多扩张血管的纤维组织的良性肿瘤。
tsc的皮肤错构瘤(血管纤维瘤和甲周纤维瘤)由上皮细胞和间充质细胞簇组成。尽管tsc的遗传机制最近有进展，但解释导致组织变化如引起错构瘤的细胞的异常行为的分子机制仍然是未知的。虽然诊断有显著改善，但这与tsc治疗是不一样的，tsc仍然表现出症状。在受影响区域通过激光治疗皮肤临床表现。这些治疗不是永久性的，几个月后会再次出现皮肤损伤。us20130225630公开了通过局部施用雷帕霉素来治疗面部血管纤维瘤，但是仍然需要开发其他药物组合物或医疗装置，尤其是因为一些医生认为雷帕霉素的局部施用是不可取的，特别是在儿童面部上。
迄今为止，市场上没有用于治疗tsc皮肤表现的霜剂或皮肤组合物。因此，仍然非常需要开发替代疗法来预防和/或治疗由过度血管生成和/或纤维化引起的皮肤病症，例如血管纤维瘤和甲周纤维瘤，尤其是与tsc或类似病症一起发生的。
本发明的目的是开发用于治疗或预防皮肤血管生成和/或纤维化失调的药物组合物或医疗装置，特别是用于治疗或预防涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤失调。
特别地，本发明的目的在于提供一种药物组合物或医疗装置，用于治疗或预防皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
本发明的目的还在于提供一种化妆品组合物，用于治疗以下疾病的不悦目皮肤表现：皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
发明人发现，在涉及过度血管生成和/或纤维化的病症的情况下，岩藻依聚糖(fucoidan)与二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇(dimethylmethoxychromanol)组合抑制血管生成和/或纤维化。
发明人发现，岩藻依聚糖与二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇组合对承受涉及过度血管生成和/或纤维化病症的受试者是审美有益的。
因此，本发明涉及药物组合物或医疗装置或化妆品组合物，其包含：
-至少一种岩藻依聚糖，
-至少一种通式a或b的化合物：
其中r1和r2相同或不同，各自独立地选自-oh、-ch3、-cf3ch2o-和ch3o-基团。
在一个优选的实施例中，通式b的化合物是二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇。二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇(国际化妆品原料(inci)名称)也称为2,2-二甲基色满酮(2,2-dimethylchroman)，或称为lipochroman-6，其通式为：
该化合物在现有技术中是一种抗氧化剂，例如自由基清除剂，作为脂质过氧化作用的抑制剂，和使细胞免于过氧亚硝酸盐诱导的损伤的保护剂。
根据本发明，发明人发现，二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇抑制i型胶原的表达，特别是在成纤维细胞中，更具体地，是在模拟涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病的情况下，例如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮发生的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
有利地，二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇抑制胶原的过度表达，尤其是抑制i型胶原的过度表达。对i型胶原过度表达的抑制可以在维生素c和tgf-β刺激的成纤维细胞中通过原位免疫标记来测定。
根据本发明，发明人发现二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇还抑制内皮细胞和/或成纤维细胞中的假管(pseudotube)形成。在例如由假管形成的诱导剂(例如vegf)刺激的内皮细胞的培养物中，观察假管网络内分支点的数目，从而有利地评估假管形成。相应地，二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇被认为在以下疾病中观察到抑制新生血管形成：涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病，例如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
例如，二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇以lipotecsa生产的商品名为lipochroman-6出售。
相对于组合物的总重量，二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇在药物组合物或医疗装置或化妆品组合物中的总量以重量计优选为0.001-10％，更优选为0.01-5％，例如为0.1-5％。
根据本发明，发明人发现，岩藻依聚糖抑制内皮细胞和/或成纤维细胞中的假管形成。相应的，岩藻依聚糖被认为在以下疾病中观察到抑制新生血管形成：涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病，例如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
岩藻依聚糖指含有岩藻糖的硫酸多糖(fcsps)。岩藻依聚糖的骨架通常含有(1→3)连接的α-1-糠醛吡喃糖基单元或交替的(1→3)-和(1→4)-连接的α-1-糠醛吡喃糖基单元，还包括具有(1→6)-β-d-半乳糖和/或(1→2)-β-d-甘露吡喃糖基单元的硫酸化半乳糖苷与岩藻糖或纤维寡聚糖支链，和/或葡萄糖醛酸，木糖或葡萄糖取代物。在一个实施例中，岩藻依聚糖具有5-25重量％的硫。其通常可以以两种形式存在：f-岩藻依聚糖，包含95％以上岩藻多糖的硫酸酯，u-岩藻依聚糖，包含约20％葡糖醛酸。也可以获得其他形式。例如，有文献报道，西格玛化工有限公司(sigmachemicalco)制造的岩藻依聚糖分为13种分子种类[糖类化合物研究(carbohydrateresearch)，255,213-224(1994)]。在一个实施例中，岩藻依聚糖是硫酸多糖，从褐藻或棕色海藻例如海蕴、海带、墨角藻、裙带菜和羊栖菜中提取。
在一个实施例中，岩藻依聚糖来自藻类。在优选实施例中，岩藻依聚糖来自墨角藻属(fucus)或海带属(laminaria)。示例性的岩藻依聚糖来自于墨角藻(fucusvesiculosis)或海带(laminariajaponica)或其他来源，包括但不限于裙带菜(undariapinnitifada)和岩衣藻(ascophyllumnodosum)。
岩藻依聚糖的一个特别来源是裙带菜提取物的极性提取物(优选丁二醇和水提取物)。
在优选实施例中，根据本发明的岩藻依聚糖抑制内皮细胞的假管形成。
在优选实施例中，岩藻依聚糖是法国绿科公司(greentech，france)生产的商品名为phyteleneeg755bgwakame的产品。
在一个实施例中，相对于组合物的总重量，所述药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含的岩藻依聚糖的量以重量计为0.001-10％，优选0.01-8％，例如0.1-8％。
在一个实施例中，相对于组合物的总重量，本发明的组合物所含岩藻依聚糖的重量分数为1-5％。
根据本发明，发明人发现，岩藻依聚糖和二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇组合物抑制内皮细胞和/或成纤维细胞中的假管形成。相应的，岩藻依聚糖和二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇的组合被认为在以下疾病中观察到抑制新生血管形成：涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病，例如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
相应地，本发明还涉及岩藻依聚糖和二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇组合物用于抑制内皮细胞和/或成纤维细胞中假管形成的用途。更具体地说，本发明还涉及岩藻依聚糖和二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇组合物用于治疗和/或预防以下皮肤病的用途：涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病，例如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
在一个具体实施例中，本发明还涉及岩藻依聚糖和二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇组合物用于抑制在这种疾病状况下观察到的新生血管形成。
本发明可以包含一种或多种其它活性成分。
有利地，本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含白藜芦醇。
白藜芦醇(3,5,4'-三羟基-反式-二苯乙烯)是一种天然的植物雌激素，具有抗炎、抗氧化和抗增殖的特性。
白藜芦醇的化学结构
白藜芦醇主要发现于红葡萄和其他水果的果皮中；还通过化学合成和生物技术合成(微生物代谢工程)来生产。白藜芦醇优选为反式白藜芦醇。
在一个实施例中，白藜芦醇是葡萄(vitisvinifera)的极性提取物(优选乙二醇提取物)。
在一个实施例中，相对于组合物的总重量，药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含白藜芦醇的量以重量计为0.001-10％，优选0.01-5％，例如0.1-0.5％。
根据本发明，发明人还发现，岩藻依聚糖和白藜芦醇组合抑制内皮细胞和/或成纤维细胞中的假管形成。相应地，岩藻依聚糖和白藜芦醇组合被认为在以下情况中观察到抑制新生血管形成：涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病，例如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
相应地，本发明还涉及岩藻依聚糖和白藜芦醇组合用于抑制内皮细胞和/或成纤维细胞中假管形成的用途。更具体地说，本发明还涉及岩藻依聚糖和白藜芦醇组合用于治疗和/或预防以下疾病的用途：涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病症，如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和结节性硬化综合征发生的皮肤表现。
在一个具体实施例中，本发明还涉及岩藻依聚糖和白藜芦醇组合用于抑制在这种疾病状况下观察到的新生血管形成。
在一个具体实施例中，一种或多种其它活性成分选自：藻类黄酮、藻寡糖类，例如浒苔属(entenomorpha)的低聚糖、任选向量化地茶树(例如，互生叶白千层melaleucaalternifolia)提取物(环糊精)、绿茶提取物的黄酮类化合物和多酚类化合物、egcg、姜黄素，一种或多种精油，选自豆蔻(豆蔻cardamomum)、紫苏(紫苏perillafrutescens)、普通圣约翰草(贯叶连翘hypericumperforatum)、柠檬草(香茅cymbopogon)，密生牛至(密生牛至origanumcompactum)、丁香(丁香syzygiumaromaticum)、肉豆蔻(肉豆蔻myristicafragrans-无黄樟素)、乳香(乳香olibanum)，圣罗勒(圣罗勒ocimumtenuiflorum)、姜黄(姜黄curcuma)，及其任意混合物。
表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)也称为表没食子儿茶素-3-没食子酸盐，是表没食子儿茶素和没食子酸的酯，是一种儿茶素。egcg是茶中含量最丰富的一种儿茶素，是一种强效的抗氧化剂，可用于治疗许多疾病。
egcg的化学结构
本申请所用的术语“egcg”在此表示(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯和/或其一种或多种衍生物(例如酯化形式、糖苷、硫酸盐)。特别优选的是(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯本身。
特别优选的是水性绿茶提取物，以提取物的总量为基准，其含有egcg的含量至少为95％。优选通过us6383392、ep1103550和ep1077214中任何一篇所描述的方法获得。
在一个实施例中，药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含含有egcg的水性绿茶提取物。
在一个实施例中，相对于组合物的总重量，药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含egcg的量以重量计为0.001-10％，优选为0.01-5％，例如为0.1-5％。
姜黄素(curcumin)是流行的印度香料姜黄(curcumalonga)的主要姜黄素类化合物(curcuminoid)。姜黄是姜科(zingiberaceae)中的一员。另外两种姜黄素类化合物是脱甲氧基姜黄素和双脱甲氧基姜黄素。姜黄素类化合物(curcuminoids)是多酚类，是姜黄呈现黄色的原因。姜黄素(curcumin)可以通过溶剂萃取从脱油姜黄中分离出来。用于此目的的合适的溶剂包括丙酮、己烷、乙酸乙酯、二氯乙烷、氯仿等。萃取方便地在中等温度(约40℃至约55℃)下进行，除去部分溶剂，得到固体[u1]含量为30-60％的浓缩物。将该溶液冷却，得到姜黄素晶体，通过任何合适的方法如过滤或离心进行分离；这一过程得到含有95％姜黄素的产品。
在一个实施例中，相对于所述组合物的总重量，药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含姜黄素的量，以重量计为0.001-10％，优选0.01-5％，例如0.1-5％。
在一个实施例中，药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含其它药物活性成分。
药物组合物或医疗装置或化妆品组合物可以例如包括一种或多种活性成分，选自：豆蔻(cardamomum)、紫苏(perillafrutescens)、普通圣约翰草(贯叶连翘hypericumperforatum)、柠檬草(香茅cymbopogon)，密生牛至(origanumcompactum)、丁香(syzygiumaromaticum)、肉豆蔻(myristicafragrans-无黄樟素)、乳香(olibanum)、圣罗勒(ocimumtenuiflorum)、姜黄(curcuma)的精油及其任意混合物。
在一个实施例中，药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含人体可接受的赋形剂，更具体地，包含皮肤可接受的赋形剂。
根据一个具体方面，本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物是局部皮肤病学组合物。
根据具体实施例，本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含岩藻依聚糖、二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇和白藜芦醇、皮肤可接受的赋形剂以及任选的其它药学活性成分。
有利地，该组合物配制成皮肤可接受的形式，特别地，选自以下形式：水性溶液或油性溶液、霜剂或水性凝胶或油性凝胶，特别是在罐或管中；乳液；乳剂、微型乳剂或纳米乳剂，例如水包油或油包水或多种或含硅乳剂；洗剂，特别是在玻璃瓶、塑料瓶、计量瓶中，气溶胶或喷雾剂；安瓿；液体肥皂；护肤皂；软膏；泡沫和无水产品，优选为液体，糊状或固体，例如，以棒的形式，特别是唇膏的形式。
在一个实施例中，药物组合物或医疗装置或化妆品组合物是用于局部施用的霜剂、洗剂、精华液、香膏、凝胶。
在一个实施例中，药物组合物或医疗装置或化妆品组合物是固体制剂形式的食品补充剂，例如片剂、泡腾片剂、舌下片剂、口腔崩解片剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂或糊剂等，或液体制剂形式的食品补充剂，如糖浆、溶液、乳液或悬浮液等。
根据优选实施例，本发明的组合物呈现稳定的颜色。这种组合物可以避免绿茶提取物的存在。
本发明还涉及一种组合物及其在需要治疗的患者中施用从而限制皮肤发红的方法。
在一个具体实施例中，本发明涉及一种组合物及其用于限制皮肤发红的化妆品用途、治疗或方法，其包括在需要治疗的受试者的受皮肤病影响的皮肤区域施用所述化妆品组合物，所述皮肤病涉及过度血管生成和/或纤维化。
在一个具体实施例中，本发明涉及一种组合物及其在需要治疗的tsc患者中用于限制皮肤发红的化妆品用途、治疗或方法。
本发明还涉及一种组合物及其在治疗的患者中用于限制皮肤发红化妆品用途、治疗或方法。
在一个具体实施例中，本发明涉及一种基础修护精华组合物及其化妆品用途、治疗或方法，包括在需要治疗的受试者的受皮肤病影响的皮肤区域施用所述基础修护精华组合物，所述皮肤病涉及过度血管生成和/或纤维化。
在一个具体实施例中，本发明涉及一种组合物及其在需要治疗的tsc患者中用于基础修护的化妆品用途、治疗或方法。在一个实施例中，
在一个具体实施例中，本发明涉及一种组合物及其用于立即修复皮肤缺陷和/或提供控油效果(mattifyingeffect)的化妆品用途、治疗或方法。
本发明还涉及一种治疗方法，包括以同时地或按顺序地方式共同服用：至少一种岩藻依聚糖和至少一种通式a或b的化合物：
其中r1和r2如本发明中所限定的。
在一个实施例中，以同时地或按顺序地方式，共同服用白藜芦醇。
共同服用包括在相同制剂中服用本发明的化合物；在相同包装中提供本发明的所有化合物的单独制剂的试剂盒，通常具有共同服用的说明书；或具有同时地或按顺序服用组合物的说明书的试剂盒，其中本发明的化合物分开包装。“本发明的化合物”包括在本说明书中描述或要求保护的所有活性化合物。
有利地，本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物的一种或多种成分可以胶囊封装。
用于胶囊封装一种或多种活性成分的材料包括例如微球、微胶囊、纳米球、纳米胶囊及其组合。用于封装一种或多种活性成分的材料包括例如简单和多重封装材料(多层封装)，包括双重封装材料(双层封装)。
有利地，本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包括封装的岩藻依聚糖。
有利地，本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含封装的白藜芦醇。
有利地，本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含封装在相同或不同的封装材料中的岩藻依聚糖和白藜芦醇。优选地，本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物包含封装在不同封装材料中的岩藻依聚糖和白藜芦醇，优选为封装在不同的双层封装材料中，例如封装在双层微胶囊中。
本发明的药物组合物或医疗装置或化妆品组合物还可以含有通常的佐剂和添加剂，例如防腐剂/抗氧化剂、脂肪物质/油、水、有机溶剂、硅酮、增稠剂、软化剂、乳化剂、防晒剂、消泡剂、保湿剂和美学组分如香料、表面活性剂、填料、螯合剂、阴离子、阳离子、非离子或两性聚合物或其混合物、推进剂、酸化或碱化剂、染料、着色剂/染色剂、研磨剂、吸收剂、精油、皮肤敏感剂(skinsensates)、收敛剂、消泡剂、色素或纳米颜料或通常配制成化妆品组合物的任何其它成分。这些护肤工业中常用的、适用于本发明组合物的成分例如为“ctfa化妆品原料手册”第二版(1992)中描述的，但不限于这些成分。
本发明还涉及局部用组合物，例如化妆品组合物。这些组合物包含如本发明所述的用于药物组合物或医疗装置的成分。因此，本发明涉及一种美容疗法，其包括将化妆品组合物施用于受试者的皮肤上。
本发明的药物组合物或医疗装置特别用于治疗或预防皮肤病症，特别是皮肤失调。
本发明的药物组合物或医疗装置有助于防止或减轻常见于tsc患者的面部血管纤维瘤的出现，从而避免或延迟激光程序。这种组合物主要针对儿童、青少年和年轻的成年人。
在一个实施例中，药物组合物或医疗装置用于治疗或预防受试者中包含tsc通路缺陷的疾病。
“tsc通路缺陷(defectivetscpathway)”包括tsc通路的反常，由此导致对细胞或组织产生不利影响的生物学效应，通常为：表现型地、遗传地、生化地和分子地，表现在结节性硬化症中。缺陷型tsc通路可能被认为是本领域已知的。
相应地，本发明的药物组合物或医疗装置对于治疗涉及过度血管生成和/或纤维化的其它皮肤病是有用的。
在一个实施例中，药物组合物或医疗装置用于治疗或预防涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病。
在一个实施例中，药物组合物或医疗装置用于治疗或预防皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤。有利地，本发明的组合物用于预防和/或治疗血管纤维瘤。
在另一个实施例中，药物组合物或医疗装置用于治疗或预防发生于红斑痤疮、粉刺、特应性皮炎、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现。
在一个优选实施例中，药物组合物或医疗装置用于治疗或预防结节性硬化综合征，或用于治疗或预防发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
相应地，本发明涉及tsc患者的治疗。
在阅读说明书中提及的实施例时，本发明的其它目的、特征和优点对本领域技术人员来说将是显而易见的，这些实施例仅仅是为了说明给出的，并不以任何方式限制本发明的范围。
这些实施例构成了本发明不可分割的组成部分，从包括实施例在内的整个描述中，相对于现有技术出现的新颖性的任何特征在其功能和通用性方面构成了本发明。
因此，每个实施例都有一般范围。
此外，在实施例中，除非另有说明，所有百分数均以重量计；除非另有说明，温度以摄氏度表示；除非另有说明，压力为大气压。
实施例
缩写
tsc结节性硬化综合征(tuberoussclerosiscomplex)
dmem杜尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)
ebm内皮细胞基础培养基(endothelialcellbasalmedium)
egf表皮生长因子(epidermalgrowthfactor)
fcs胎牛血清(fetalcalfserum)
fgf纤维母细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor)
gam山羊抗小鼠(goatanti-mouse)
gar羊抗兔(goatanti-rabbit)
hmvec人类微血管内皮细胞(humanmicrovascularendothelialcell)
igf胰岛素样生长因子(insulinlikegrowthfactor)
nhdf正常人真皮成纤维细胞(normalhumandermalfibroblast)
od光密度(opticaldensity)
rt室温(roomtemperature)
sd标准偏差(standarddeviation)
sem平均标准误差(standarderrorofthemean)
tgf转变生长因子(transforminggrowthfactor)
vegf血管表皮生长因子(vascularepidermalgrowthfactor)
数据管理
使用微软excel软件分析原始数据
组间比较是通过不配对的学生t-检验进行的。n为5可以解释为统计学分析，但是对于n<5，统计值仅为信息。
本申请中使用的公式:
平均标准误差：sem＝sd/n
平均标准误差(sem)是衡量样本平均值与真实总体平均值之间偏离的程度。sem被计算为sd除以样本大小的平方根。
抑制率：抑制(％)
实施例1-i型胶原的抑制
通过原位免疫标记分析用维生素c+tgf-β刺激的nhdf中的i型胶原表达。活化的hmvec释放tgf-β，其通过nhdf刺激细胞外基质合成。tgf-β刺激胶原和维生素c的释放合成，创造出接近tsc病理条件的实验条件。
正常人真皮成纤维细胞(nhdf)
-细胞类型：nhdf，在第8通道使用
-培养条件：37℃，5％co2
-培养基：dmem培养基，补充有2mml-谷氨酰胺、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素和胎牛血清(fcs)10％
-测定培养基：dmem培养基，补充有2mml-谷氨酰胺、50u/ml青霉素、50μg/mlfcs1％的链霉素。
培养和治疗
将成纤维细胞接种在96孔板中，并在培养基中培养24小时。然后在维生素c+tgf-β(20μg/ml+10ng/ml)组合存在或不存在(非刺激的对照组)的情况下，用含有或不含有(对照组)测试化合物或者组合物的测定培养基来替换培养基。将细胞孵育72小时。所有实验条件在n＝3时进行。
测试的活性化合物
二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇：来自利普泰公司(lipotec)的
i型胶原在成纤维细胞中的表达-原位免疫标记
孵育后，弃去培养基，淋洗、固定并透化处理细胞。然后使用一级抗体抗i型胶原标记细胞。然后使用荧光二级抗体(gar-alexa488)揭示一级抗体，使用hoechst33258溶液(双苯胺)对细胞核进行平行染色。
使用incellanalyzertm1000(美国通用电气医疗集团)进行图像采集(每孔5张照片)。本申请中包含每个实验条件的代表性图像。
通过对细胞总数-荧光强度归一化来量化标记(使用美国通用电气医疗集团developertoolbox1.5软件对数据进行处理)。
结果见表1。
表1
对i型胶原表达的影响
由混合维生素c+tgf-(20μg/ml+10ng/ml)处理正常人真皮成纤维细胞(nhdf)，诱导了细胞对i型胶原的强烈表达。预期该效应并验证该测定。
在测定的实验条件下，50μg/ml的二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇诱导了由混合维生素c+tgf-β刺激的nhdf中的i型胶原表达的明显抑制(抑制率为71％)。
实施例2-抑制假管形成
通过原位免疫标记分析hmvec/nhdf共培养中的假管形成。
人类微血管内皮细胞(hmvec)
-细胞类型：hmvec，在第7通道使用
hmvec/nhdf共培养
-细胞类型：hmvec+nhdf(比例为50:50)
-培养条件：37℃，5％co2
-共培培养基：内皮细胞基础培养基2(ebm-2)，补充有5％胎牛血清(fcs)、重组人表皮生长因子(rhegf)、细胞生长因子(rhfgf)、r3胰岛素样生长因子-1(r3igf-1)、氢化可的松、维生素c和庆大霉素
+
dmem，补充有2mml-谷氨酰胺、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素和10％fcs。
培养和治疗
将hmvec和nhdf接种在96孔板中，并在共培培养基中培养24小时。然后将培养基除去，并在诱导物100ng/mlvegf存在或不存在(非刺激对照组)的情况下，用含有或不含(对照组)测试化合物、组合物或参照物(苏拉明5μm)的共培培养基来替换培养基。将细胞孵育10天，孵育72小时后治疗更新。所有实验条件在n＝3时进行。
测试的活性化合物
二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇：来自西班牙利普泰公司(lipotec)的
岩藻依聚糖：来自法国绿科公司的phyteleneeg755bgwakame(裙带菜)；
白藜芦醇：法国绿科公司的葡萄乙二醇提取物。
假管分支点的测定-原位免疫标记
孵育后，弃去培养基，淋洗、固定并透化处理细胞。然后使用一级抗体抗血友病因子标记细胞。然后使用荧光二级抗体(gar-alexa488)揭示一级抗体，使用hoechst33258溶液(双苯胺)对细胞核进行平行染色。
使用尼康diaphot300显微镜(透镜x4)观察假管的形成。使用尼康ds-fi1相机和nis-elements3.10软件进行图像采集(每孔1张照片)。这样伪管网络内的分支点数在每个图像上可以计数。
本申请中包含每个实验条件的代表性图像。每个条件的图像参考列于表2。
表2
活性化合物对hmvec/nhdf共培培养中分支点数的影响
(1)：统计显著性阈值
ns：>0.05，不显著*：0.01-0.05，显著
**：0.001至0.01，非常显著***：<0.001，极度显著
对假管形成的影响
在非刺激对照组条件下，人类微血管内皮细胞(hmvec)未形成假管，未观察到分支点。用vegf在100ng/ml条件下刺激hmvec诱导了假管的形成，并统计该毛细血管网络中的大量分支点。参照物苏拉明在5μm条件下诱导了伪管网络和支化点(抑制率为37％)数量的显著降低(37％的抑制)。这些结果可预期并验证了该测定。
在测定的实验条件下，浓度为30μg/ml的化合物岩藻依聚糖、浓度为30μg/ml+2μg/ml的岩藻依聚糖+白藜芦醇的组合物、浓度为30μg/ml+6μg/ml的岩藻依聚糖+二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇的组合物，诱导了假管形成的强烈抑制，其特征在于，网络结构的解体和分支点数量的强烈减少(抑制率分别为94％，96％和83％)。
结论
在本测试的实验条件下，单独用岩藻依聚糖测试或用岩藻依聚糖与白藜芦醇或二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇联合测试，均对hmvec的假管形成有很强的抑制作用。
二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇对由维生素c和tgf-β刺激的nhdf的i型胶原表达显示出中度抑制。
总体而言，本研究的结果表明，岩藻依聚糖化合物具有很强的抗血管生成特性。二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇化合物具有抗纤维化特性。
上述结果支持了岩藻依聚糖和二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇的组合抑制血管生成和纤维化，特别是在涉及度血管生成和/或纤维化的疾病的情况下。
因此，本发明的结果能够支持在药物组合物或医疗装置中使用岩藻依聚糖和二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇的组合，特别是用于治疗或预防皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，尤其特别是用于治疗或预防结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
此外，上述结果能够支持二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇还抑制i型胶原的表达，特别是在成纤维细胞中，更具体地，在模拟涉及以下疾病的情况下能抑制i型胶原的表达：过度血管生成和/或纤维化的皮肤病，例如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
此外，上述结果能够支持二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇抑制内皮细胞和/或成纤维细胞中的假管形成。相应的，二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇被认为在以下皮肤病中观察到抑制新生血管形成：涉及过度血管生成和/或纤维化的皮肤病，例如皮肤纤维化、血管纤维瘤、错构瘤和甲周纤维瘤，发生于红斑痤疮、粉刺、硬皮病、牛皮癣和红斑狼疮的皮肤表现，特别是结节性硬化综合征和发生于结节性硬化综合征的皮肤表现。
实施例3-制剂实施例
下表是本发明的制剂的实施例，对成分没有任何限制。
根据本领域普通技术人员的技能，制备包括至少一种岩藻依聚糖和至少二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇的以下凝胶制剂：
qsp：补充到100％
实施例4-制剂实施例
实施例4的制剂可用作皮肤的抗发红剂，并作为基础修护精华。
实施例5-制剂实施例
特别地，这种制剂专用于提供美容益处。该制剂用于立即修复皮肤缺陷，当用于皮肤上时很舒适。该制剂还提供了一种控油效果。
实施例6-制剂实施例
根据本领域技术人员的公知常识，基于不同的阶段(a、b、c和d)制备制剂。实施例6的制剂尤其专用于提供美容益处。这样的制剂可用作皮肤抗发红剂，并作为基础修护精华。该制剂用于立即修复皮肤缺陷，当用于皮肤上时很舒适。该制剂还提供了一种控油效果。
这种制剂包含岩藻依聚糖、二甲基甲氧基苯并二氢吡喃醇和白藜芦醇，其对于假管形成和i型胶原表达具有活性。