RNA引导的I型单纯性疱疹病毒和其它相关疱疹病毒的根治的制作方法

文档序号:13450987
RNA引导的I型单纯性疱疹病毒和其它相关疱疹病毒的根治的制作方法
本申请主张2015年1月14日提交的第62/103,354号美国临时专利申请案及2015年10月7日提交的第62/238,288号美国临时专利申请案的权益,其全部内容通过引用方式而并入本文。
背景技术
:1型单纯性疱疹病毒(HSV-1)是感染全世界大部分人口的人类嗜神经病毒(WhitleyandRoizman,2001,Lancet357:1513-1518;Xuetal,2006,JAMA,296:964-973)。尸体剖检发现,HSV-1基因组存在于85至90%的个体的三叉神经节中(Baringer,2000,Infectiousdiseasesofthenervoussystem,Butterworth-Heinemann,Oxford:139-164),且其在正常无症状个体中的血清阳性率为90%(KennedyandChaudhuri,2002,JNeurolNeurosurgPsychiatry,73:237-238)。大多数情况下,在初始感染后,HSV-1仅维持于潜伏期,而不造成明显症状。但是,在一些例子中,初次感染即造成发热、吞咽困难、吞咽痛、及唇舌上的疼痛性水疱(KennedyandSteiner,2013,JNeurovirol,19:346-350;WhitleyandRoizman,2001,Lancet357:1513-1518),对于新生儿,HSV-1初次感染可导致显着的发病率和死亡率(Westerbergetal,2008,IntJPediatrOtorhinolaryngol,72:931-937;WhitleyandRoizman,2001,Lancet357:1513-1518)。HSV-1在神经系统中的复制造成脑炎,其症状范围包括发热、局灶性神经缺陷、失语症及痉挛,其起因为额叶和颞叶内的感染和抗病毒炎性反应(Gildenetal,2007,NatureClinPractice3,82-94)。HSV-1潜伏的部位主要局限地现于脑神经节,但一些例子中,已经在胸神经节和大脑内检测到了病毒基因组(Fraseretal.,1981,ProcNatlAcadSciUSA,78:6461-6465;Mahalingametal,1992,AnnNeurol,31:444-448)。目前,对于HSV-1初次感染和疾病复发的治疗是非选择性的,并不预防潜伏性感染的建立或病毒再活化,且具有不良副作用,指出对于改善的和特异性的治疗策略存在强烈需求。HSV潜伏期开始和持续的机制并未被完全理解,但有证据指出了病毒RNA要素的角色(潜伏相关转录;LATS),该要素在潜伏期内被大量表达(Izumietal,1989,MicrobPathol,7:121-134;Kangetal,2003,Virol,312:233-244;Perngetal,2000,Science287:1500-1503;Stevensetal,1987,Science,235:1056-1059)。环境因素,包括UV光刺激、过热、社会压力和药理学药剂的主体可触发潜伏的HSV-1基因组的再活化、神经元内的有效病毒复制、及疾病恶化。HSV-1再活化的最常见且容易鉴别的临床征象是感冒疮(唇疱疹),但其它情况包括复发性生殖器疱疹也已经和HSV再活化联系起来(Xuetal,2006,JAMA,296:964-973)。使用核苷酸类似物进行药理学治疗是HSV1初次感染和病毒再活化事件的的支柱性疗法。具有最佳治疗指数的核苷酸类似物以病毒胸苷激酶(TK)为靶标,包括阿昔洛韦(acyclovir)及其衍生物。这些药物通过TK而进行单磷酸化,从而通过细胞酶机构形成ACV二磷酸酯和ACV三磷酸酯,并最终导致HSV1DNA链终结。尽管这些药物可有效限制由HSV1感染扩散至其它细胞造成的损伤,但它们对于潜伏性HSV1再活化的建立或未来的HSV1再活化事件是无效的。患者,尤其是那些具有潜在的免疫缺陷的患者,可发展对于TK抑制剂具有耐药性的HSV1株,并因此需要使用HSV1特异性较低的DNA抑制剂进行治疗。TK抑制剂也与肾毒性相关。其它抗疱疹剂以病毒DNA聚合酶UL30为靶标,如膦甲酸(foscarnet)及西多福韦(cidofovir)。这些药物可帮助控制HSV1初次感染及再活化的症状,加速病灶愈合的进程,以及减轻疼痛和缩短病毒脱落的持续时间。不幸的是,使用这些药物并不根除潜伏性HSV1感染。尤其在患有免疫缺陷的患者中,发展出了具有对于抗疱疹药物的耐药性的HSV1株。耐药性病毒株一般含有TK突变,但也出现了UL30突变。HSV1TK抑制剂和UL30活性剂并不能有效对抗具有UL30突变的HSV1。研发对抗HSV1的疫苗的尝试已经获得最小限度的成功(Belsheetal,2012,NEnglJMed366:34-43;WhitleyandRoizman,2001,Lancet357:1513-1518)。目前,尚无FDA许可的用于HSV1的接种疫苗。用于HSV1和HSV2的接种疫苗的初步测试表明,对于这些病毒,接种疫苗在先前未被感染的个体中很可能最有效,且很可能具有对于控制先前已经感染的患者中的多种再活化事件的最小效力。考虑到当前疗法的限制性,该领域需要用于治疗和预防溶菌性和潜伏性HSV1感染两者的组合物和方法。技术实现要素:一方面,本发明提供用于治疗或预防疱疹病毒感染的组合物。该组合物包含:a)CRISPR相关(Cas)的肽或编码Cas肽的分离的核酸;以及b)分离的引导性核酸或编码引导性核酸的分离的核酸,其中,该引导性核酸包含与疱疹病毒基因组中的靶标序列实质互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,该Cas肽是Cas9或其变体。一种具体实施例中,该Cas9变体包含一个或多个相对于野生酿脓链球菌Cas9(spCas9)的点突变,其是选自由下列所组成的群组:R780A、K810A、K848A、K855A、H982A、K1003A、R1060A、D1135E、N497A、R661A、Q695A、Q926A、L169A、Y450A、M495A、M694A、及M698A。一种具体实施例中,该Cas肽是Cpf1或其变体。一种具体实施例中,该编码Cas肽的分离的核酸被优化以用于在人细胞内表达。一种具体实施例中,该靶标序列包含疱疹病毒基因组的ICP0结构域内的序列。一种具体实施例中,该引导性核酸是RNA。一种具体实施例中,该引导性核酸包含crRNA及tracrRNA。一种具体实施例中,该组合物包含多个分离的引导性核酸,其中,每一引导性核酸包含与疱疹病毒基因组中不同的靶标序列实质互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,该组合物包含一种或多种分离的核酸,其中,该一种或多种分离的核酸编码多个引导性核酸,且每一引导性核酸包含与疱疹病毒基因组中不同的靶标序列实质互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,该疱疹病毒是选自由下列所组成的群组:I型单纯性疱疹病毒(HSV1)、单纯性疱疹病毒2(HSV2)、人疱疹病毒-3(HHV-3;水痘带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒-4(HHV-4;爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))、人疱疹病毒-5(HHV-5;巨细胞病毒(CMV)),人疱疹病毒-6(HHV-6;玫瑰疹病毒),人疱疹病毒-7(HHV-7)、及人疱疹病毒-8(HHV-8;卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV))。一种具体实施例中,该靶标序列是选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、及SEQIDNO:8所组成的群组。一方面,本发明提供医药组合物,其包含:a)CRISPR相关的(Cas)肽或编码Cas肽的分离的核酸;以及,b)分离的引导性核酸或编码引导性核酸的分离的核酸,其中该引导性核酸包含与疱疹病毒基因组中的靶标序列实质互补的核苷酸序列。一方面,本发明包含编码CRISPR相关的(Cas)肽和引导性核酸的表达载体,其中,该引导性核酸包含与疱疹病毒基因组中的靶标序列实质互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,本发明提供包含该表达载体的宿主细胞。一方面,本发明提供用于治疗或预防受试者的疱疹病毒感染或疱疹病毒相关的病变的方法。该方法包含令该受试者的细胞与治疗有效量的组合物接触,该组合物包含a)CRISPR相关的(Cas)肽或编码Cas肽的分离的核酸;以及b)分离的引导性核酸或编码引导性核酸的分离的核酸,其中该引导性核酸包含与疱疹病毒基因组中的靶标序列实质互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,该Cas肽是Cas9或其变体。一种具体实施例中,该Cas9变体包含一个或多个相对于野生型酿脓链球菌Cas9(spCas9)的点突变,其是选自由下列所组成的群组:R780A、K810A、K848A、K855A、H982A、K1003A、R1060A、D1135E、N497A、R661A、Q695A、Q926A、L169A、Y450A、M495A、M694A、及M698A。一种具体实施例中,该Cas肽是Cpf1或其变体。一种具体实施例中,该编码Cas肽的分离的核酸被优化以用于在人细胞内表达。一种具体实施例中,该靶标序列含有疱疹病毒基因组的ICP0结构域内的序列。一种具体实施例中,该引导性核酸是RNA。一种具体实施例中,该引导性核酸包含crRNA及tracrRNA。一种具体实施例中,该组合物包含多种分离的引导性核酸,其中,每一引导性核酸包含与疱疹病毒基因组中的不同靶标序列实质互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,该组合物包含一种或多种分离的核酸,其中该一种或多种分离的核酸编码多种引导性核酸,其中,每一引导性核酸包含与疱疹病毒基因组中的不同靶标序列实质互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,该疱疹病毒是选自由下列所组成的群组:I型单纯性疱疹病毒(HSV1)、单纯性疱疹病毒2(HSV2)、人疱疹病毒-3(HHV-3;水痘带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒-4(HHV-4;爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))、人疱疹病毒-5(HHV-5;巨细胞病毒(CMV))、人疱疹病毒-6(HHV-6;玫瑰疹病毒)、人疱疹病毒-7(HHV-7)、及人疱疹病毒-8(HHV-8;卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV))。一种具体实施例中,该疱疹病毒相关的病变是选自由唇疱疹、生殖器疱疹、水痘、带状疱疹、人α-疱疹病毒的原发性疱疹感染、贝尔氏麻痹、前庭神经炎、及疱疹性神经痛所组成的群组。一种具体实施例中,该靶标序列是选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、及SEQIDNO:8所组成的群组。附图说明当结合附图阅读时,下述对本发明优选具体实施例的详细说明将得到更好的理解。对于例示性说明本发明的目标,附图中显示了目前优选的具体实施例。但应理解,本发明并不受限于附图中所示的具体实施例的精确安排和构建。图1是溶菌性HSV1感染后,蛋白质表达的时间进程的图式。显示了代表性的极早期(IE,黑色)、早期(E,灰色)和晚期(L,浅灰色)蛋白质。VP16为封装于病毒衣壳内的一种晚期蛋白质,与宿主细胞蛋白质Oct1和HCF反应以启动病毒蛋白质合成。图2是Cas9/gRNA复合体的示意图。修饰Cas9/gRNA复合体(分别为黄色和灰色)结合至靶标DNA序列,且在前间区序列邻近基序(ProtospacerAdjacentMotif)NGG(黑底)的3个核苷酸内特异性地裂解。图3是ICP0的蛋白质序列的示意图,阐明了多个结构域[FHA(叉头相关的磷酸化基序)、RING(Cys3His1Cys4锌结合)结构域、PMHL结合结构域、SIAH(缺席同族体结合基序中的7个)、NLS(核定位序列)、USP7(泛素特异性蛋白酶7结合基序)、及ND10定位基序]。星号指明了磷酸化位点。通过箭头指明所选择的HSV1靶标DNA(tDNA)序列,且tDNA全序列及其识别名称一起沿着该图形线下方显示。图4说明使用Cas9/抗HSV1ICP0gRNA2A稳定转染F06细胞后,ICP0的surveyor试验琼脂糖胶电泳结果。这表明通过这克隆产生了具有180个碱基对的片段。左泳道显示分子尺寸标记物。右泳道显示未转染的F06细胞,该细胞含有HSV1ICP0基因组DNA。图5说明了使用Cas9/HSV1gRNA序列、Cas9/抗ICP0gRNA2A及Cas9/抗ICP0gRNA2C(缩写为Cas9/2A+2C)中的两者对L7细胞进行同步瞬时共转染的结果。包括2AtDNA序列及2CtDNA序列的ICP0的HSV1原生序列显示于图5的顶部。下方显示的10个DNA序列是克隆所得ICP0序列的序列,显示了1个碱基对的删除(对齐的序列中的空隙,在10个测序克隆体的8个中观察到该删除)或1个碱基对的插入(10个克隆体中的2个)。使用这两种引导性序列进行共转染导致ICP0序列的335bp部分的裂解,留下ICP0DNA的217bp序列。插图显示了指明所裂解的DNA片段的所裂解的217个碱基对(中间泳道)。右侧是未转染的L7细胞(亦称为无Cas9建构),指明了仅野生型片段的全长度。左侧是分子尺寸标记物。图6说明与对照组相比,在使用Cas9/抗HSV1ICP0gRNA2D进行感染后,细胞的病毒感染结果。使用Cas9/抗HSV1ICP0gRNA对正常Vero细胞进行稳定转染后,该细胞对于HSV1的感染的抗性显着变强,且低浓度的该病毒不能感染该细胞。这些结果与使用完全缺乏ICP0的突变HSV1病毒(ΔICP0)感染正常Vero细胞时所见等同。当补充外部ICP0时(F06细胞表达ICP0),如预期的,该细胞被显着降低浓度的缺乏ICP0的HSV1(ΔICP0)所感染。Pfu代表空斑形成单位,这是测定该实验中各条件下所加入的传染性HSV1的量的标准途径。Wt代表野生型或常规单纯性疱疹病毒,其含有ICP0DNA编码序列。图7,包含图7A至图7G,说明实验结果,指明CRISPR/Cas9引入了ICP0基因中的突变并减少了HSV-1复制。图7A:HSV-1ICP0基因组区域的示意图,显示了外显子II和环状结构域。显示了包括PAM(标记为绿色)在内的2A、2B和2C靶标的位置和核苷酸组成。例示性说明了PCR扩增中使用的多种引物(P)的位置。图7B:通过引物P3和P2(显示于图7A中)在表达Cas9(对照)或Cas9加上gRNAs2A及2C的L7细胞中扩增的DNA片段的凝胶分析。显示了通过外显子IIDNA在靶标2A和2C处裂解所造成的预期的552bp扩增子和217bp的较小DNA片段的位置、以及连接反应后剩余片段的扩增。图7C:217bp的克隆片段(显示于图7B中)的序列示踪,例示性说明在切除355bp后,所裂解的外显子IIDNA两端的钝端连接。图7D:DNA凝胶分析,例示性说明使用P3和P4引物的来自若干表达CAs9/gRNA2A的无性系细胞(名为InDels1至3)或不具gRNA2A的对照细胞的扩增子。图7E:克隆体InDel1和2中的DNA定序识别核苷酸的插入(通过黑箭头说明),以及InDel3中的191bpDNA的插入。图7F:L7细胞(对照)及其表达Cas9/gRNA2A的亚克隆体InDel3(显示于图7E中)在使用抗ICP0抗体进行免疫染色后的代表性共聚焦影像。绿色指明通过HSV-1的GFP的表达,而DAPI(蓝色)表示细胞核。图7G:病毒产生试验,指明内源性表达ICP0的亲本L7细胞(对照)的上清液中或InDel3、InDel2(显示于图7E中)中ΔICP0-HSV-1的滴度。图8说明了实验结果,表明了通过以ICP0表达为靶标,CRISPR/Cas9恢复了L7细胞中PML体的关联。对照的未感染L7细胞中PML体的免疫染色分析显示了细胞核内PML体的点状染色的外观(下排)。细胞核的DAPI染色(蓝色)显示于右图中。使用HSV-1/GFP对以低MOI表达Cas9的VeroL7细胞进行感染,显示PML的完全摧毁和HSV-1/GFP的野蛮复制,如绿色所示(中排)。在使用HSV-1/GFP进行感染的表达Cas9/gRNA2A的L7细胞中,未能中断细胞核中点状PML的形成且显着降低了该细胞中所检测到的病毒复制水平(绿色,上排)。图9,包含图9A至图9D,说明实验结果,表明表达Cas9/gRNA的人TC620细胞并不支持HSV-1复制。图9A:蛋白质提取物的西方印迹分析,用于检测TC620人少突神经胶质瘤细胞及其表达Cas9或Cas9/gRNA2A的亚克隆体(克隆体6和10)中的ICP0。在对照细胞及表达Cas9的细胞中检测到了110kDaICP0的表达,但该表达在克隆体6和10中严重减少。显示了看家蛋白α-微管蛋白的表达。图9C:使用经两种不同稀释的来自HSV-1/GFP感染的对照TC620或克隆体6和10的上清液进行的代表性空斑试验,显示了作为通过被感染细胞的Cas9/gRNA编辑而压制ICP0的结果,空斑的数目剧烈降低。图9D:通过空斑试验对HSV-1产生的定量,显示在持续产生Cas9加上gRNA2A的TC620细胞中,对病毒产生的剧烈压制。图10,包含图10A至图10F,说明实验结果,表明慢病毒(LV)介导的Cas9/gRNA输送压制了溶菌性循环过程中的HSV-1感染且阻止未感染的细胞被首次感染。图10A:来自TC260细胞的蛋白质提取物的西方印迹分析,其中,该细胞内源性表达Cas9,且经HSV-1/GFP感染24小时,随后以表达慢病毒的gRNA2A、2B或两者除了,并在48小时后收取用于蛋白质提取。显示了ICP0、ICP8、糖蛋白C、Cas9及α-微管蛋白的位置。图10B和图10C例示性说明了空斑试验的结果,其中,使用LVgRNA2A或LVgRNA2B处理的细胞显示病毒产生的剧烈下降。图10D:来自如上文揭示的被感染细胞的蛋白质提取物的西方印迹分析。图10E:TC620细胞中HSV-1/GFP复制的共聚焦免疫荧光评估,其中,该细胞在HSV-1感染之前以载体(LV)LVCas9、LVCas9加上LVgRNA2A、LVCas9加上gRNA2B、以及LVCas9加上LVgRNA2A及2B处理48小时。通过检查绿色荧光而显示HSV-1/GFP复制的下降,这表明使用LV-Cas9+LV-gRNA2A处理的细胞中被HSV-1感染的细胞较少。图10F:空斑试验,显示当使用HSV-1感染细胞时所释放的病毒滴度的下降,其中,该细胞使用产生Cas9的LV和如所揭示的gRNA进行预处理。图11,包含图11至图11C,说明实施例实验的结果。图11A:显示外显子II内断点的检测的色谱图,该检测是通过Cas9和gRNA2A及2C进行DNA裂解、及单个核苷酸A(上图)和G(下图)在断点部位插入的结果。图11B:gRNA2B和2C的重组在外显子II内切割,生成用于251bpDNA扩增的新模板。图11C:SURVEYOR试验,显示在使用Cel1核酸酶裂解后,外显子II内靶标A处的InDel突变造成了180bp的新DNA片段(标记为gRNA2A的泳道)。图12,包含图12A和图12B,说明了实施例实验结果,表明Cas9gRNA和Cas9蛋白质在经处理的人细胞中的产生。图12A:通过RT-PCR在未经处理(对照)、表达Cas9、或表达Cas9加上gRNA2A的人TC620细胞中产生gRNA2A。β-肌动蛋白转录本用作负载对照。图12B:标记-Cas9在TC620细胞中的表达通过西方印迹分析得以证实。图13,包含图13A至图13D,说明了实施例实验结果,表明使用HSV0-1对人细胞系TC620的有效感染。图13A:使用HSV-1/GFP以MOI为0.1、1或2来感染人少突神经胶质瘤细胞细胞系TC620,48小时后,通过荧光显微镜评估作为HSV-1表达和复制的指标的GFP表达。图13B:西方印迹分析,用于评估使用HSV-1感染TC620细胞48小时后,该细胞中的ICP0表达。图13C和图13D:以MOI=1感染TC620细胞48小时后,通过西方印迹分析对该细胞内的ICP8和糖蛋白C的检测。图14,包含图14A至图14C,说明了实施例实验结果,表明使用Cas9/gRNA处理人细胞并不影响细胞循环、细胞凋亡、或细胞存活。图14A:如图,使用细胞循环试验来研究Cas9/gRNA对于不表达Cas9或任何gRNA的TC620对照细胞的细胞循环的冲击,然而,Cas9的亚可隆体和Cas9/gRNA2A克隆体6和10的亚克隆体或单独表达Cas9或表达Cas9加上gRNA2A。显然,在这些细胞系中,没有检测到纵贯G1、S和G2/M极端的细胞循环进展的差异。图14B:如图14A所示的克隆细胞系的凋亡试验,在膜联蛋白染色的细胞群落中未显示显着的改变(1.0至2.1%的范围)。图14C:使用碘化丙啶染色试验进行的细胞生存试验显示,多个克隆体中具有Cas9或Cas9/gRNA表达的细胞的生存能力改变。图15,包含图15A和图15B,说明了实施例实验结果,表明Cas9/gRNA的产生并不造成宿主细胞DNA的改变。图15A:SURVEYOR试验的DNA凝胶分析,例示性说明,在来自PCR扩增的预期DNA片段的下方,未检测到可归因于Cas9/gRNA2A表达的条带。由该SURVEYOR试验试剂盒的供应商(IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA)提供对照。图15B:对含有潜在脱靶的细胞基因进行PCR扩增和Sanger定序的结果(如图15A中所示)透露,扩增子中没有InDel突变。箭头表明引物的位置及其与潜在脱靶的距离。红色指示PAM序列,而黑色指示对于每一细胞基因的潜在靶标序列。指示了每一扩增子的尺寸。图16,包含图16A至图16E,说明了实施例实验6的结果。图16A至图16E:根据图10E中揭示的方法,如每一图上方所示,对HSV-1/GFP在使用表达Cas9或多种gRNA的慢病毒载体(LV)处理的TC260细胞中的复制的落射荧光评估。影像是每一种情况的复制版的代表。具体实施方式本发明涉及用于治疗或预防有此需要的受试者的疱疹病毒感染的组合物和方法。例如,某些具体实施例中,本发明提供一种组合物,其特异性裂解人α-疱疹病毒如1型人单纯性疱疹病毒(HSV1)中的靶标序列。可包括规律间隔成簇短回文重复序列(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats(CRISPR))核酸或多肽以及特异引导性RNA序列的这些组合物,其可给药至罹患急性或潜伏性α-疱疹病毒感染的受试者。定义除非定义为反义,本文中使用的全部科技术语均具有与本发明所属领域技术人员一般理解相同的意义。虽然在本发明的实践和测试中可使用与本文中揭示的那些相似或等效的任何方法和材料,但本文中所揭示的是优选的方法和材料。本文中,下述术语各自具有与本节内容相关的意义。本文中,冠词“一(a)”和“一(an)”用来指该冠词的语法目标的一种或超过一种(即,至少一种)。举例来说,“一要素”意为一种要素或超过一种要素。本文中,当“约”指可测量的值如量、持续时间等时,意为涵盖从所指定值变动±20%、±10%、±5%、±1%、或±0.1%,而这些变动对于实施所揭露的方法是适宜的。当术语“不正常”用于有机体、组织、细胞或其组分的语境中时,指那些有机体、组织、细胞或其组分的至少一种可观察或可检测的特征(如,年龄、治疗、当时情况等)不同于显示为“正常”(预期)的代表性特征的有机体、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型为正常或预期的特征,对于不同的细胞或组织类型可能是不正常的。“疾病”是动物的一种健康状态,该状态下,动物不能维持体内平衡,且如果该疾病未被缓解,则该动物的健康状况恶化。相比之下,动物的“病变”是一种健康状态,该状态下,动物能维持体内平衡,但动物的健康状态比不存在该病变时不利。若不进行处理,病变并不一定造成该动物健康状态中的进一步的疾病。若疾病或病变的症状的严重性、患者所经历的症状的频率、或两者减轻,则该疾病或病变被“缓解”。“编码”指多核苷酸如基因、cDNA、或mRNA中特定核苷酸序列的固有性质,其在生物过程中用作合成其它聚合物或大分子的模板,该聚合物或大分子具有所定义的核苷酸序列(如,rRNA、tRNA和mRNA)或所定义的氨基酸序列及由该序列导致的生物性质。因此,若mRNA对应于基因转录和转译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质,则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列一致且通常提供于序列表中的编码链,以及用作基因或cDNA的转录模板的非编码链,两者均可指为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。化合物的“有效量”或“治疗有效量”是该化合物的量,该量足以向该化合物所给药的受试者提供有益效果。输送工具的“有效量”是足以有效结合或输送化合物的量。“表达载体”指包含重组多核苷酸的载体,该多核苷酸包含可操作地链接至待表达核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用要素;其它用于表达的要素可由宿主细胞或体内外表达系统提供。表达载体包括全部该领域已知的那些载体,如并入该重组多核苷酸的粘粒、质粒(如,裸质粒或包含于脂质体内的质粒)和病毒(如,慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、及腺相关病毒)。“同源”指两个多核苷酸分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列的一个位置均被相同碱基或氨基酸单体次单元占据时,如,若两个DNA分子中各自一位置被腺嘌呤占据,则该两个分子在该位置处是同源的。两个序列间同源性的百分比是下述函数:两个序列共有的匹配或同源位置的数目除以所比较的位置数再乘以100。例如,若两个序列的10个位置中的6个是匹配的或同源的,则两个序列为60%同源。举例来说,DNA序列ATTGCC和TATGGC共享50%的同源性。通常,当两个序列对准时作出比较,以给出最大同源性。“分离的”意为从天然状态改变或移除。例如,天然存在于活体动物体内的核酸或肽不是“分离的”,但部分或完全从其天然状态的共存材料隔离开来的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以实质纯化的形式存在,或可存在于非原生环境如,举例而言,宿主细胞内。本发明的语境中,使用通常出现的核酸碱基所采用的下述缩写。“A”指腺嘌呤,“C”指胞嘧啶,“G”指鸟嘌呤,“T”指胸腺嘧啶,而“U”指尿嘧啶。除非明确排除,“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此退化版本和编码相同氨基酸序列的全部核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”也可包括内含子,其含量为编码该蛋白质的该核酸序列可在一些版本中含有一个或多个内含子。本文中,术语“患者”、“受试者”、“个体”等可互换使用,且指任何动物、或其体外或原位的细胞,遵从本文中揭示的方法。某些非限制性具体实施例中,该患者、受试者或个体是人。组合物的“不经肠道”给药包括,例如,皮下给药(s.c.)、静脉给药(i.v.)、肌肉给药(i.m.)、或胸骨内注射,或输液技术。本文中使用的术语“多核苷酸”定义为核苷酸的链。此外,核酸是核苷酸的聚合物。因此,本文中,核酸和多核苷酸可互换使用。该领域技术人员具有核酸为多核苷酸的通常知识,且核酸可水解为单体性“核苷酸”。该单体性核苷酸可水解为核苷酸。本文中,多核苷酸包括,但不限于,通过该领域可使用的任何手段获得的全部核酸序列,该手段包括但不限于,重组手段,即,使用常规克隆技术和PCRTM等从重组库或细胞基因组克隆核酸序列;或通过合成手段获得。除非明确排除,“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此退化版本和编码相同氨基酸序列的全部核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”也可包括内含子,其含量为编码该蛋白质的该核酸序列可在一些版本中含有一个或多个内含子。本文中,术语“肽”、“多肽”、和“蛋白质”可互换使用,且指由通过肽键共价链接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或多肽必需含有至少两个氨基酸,且可包含于蛋白质或肽序列内的氨基酸的最大数目并无限制。多肽包括肽或蛋白质,该肽或蛋白质包含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸。本文中,该术语指短链和长链两者,短链在该领域中一般指为例如肽、寡肽和寡聚物,长链在该领域中通常指为多种类型的蛋白质。“多肽”包括,例如,生物活性片段、实质同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽、或其组合。本文中,术语“启动子”定义为通过细胞的合成机制或引入的合成机制识别的、启动多核苷酸序列的特异性转录所需的DNA序列。本文中,术语“启动子/调控序列”意为一核酸序列,其为表达可操作地链接至该启动子/调控序列的基因产物所需。一些情况下,这序列可以是核心启动子序列,而其它情况下,这序列也可包括增强子序列和表达该基因产物所需的其它调控要素。例如,该启动子/调控序列可以组织特异性模式表达该基因产物。“组成型”启动子是一种核苷酸序列,当可操作地链接至编码或指定一基因产物的多核苷酸时,组成型启动子造成在细胞的大部分或全部生理学条件下于该细胞内产生该基因产物。“诱导型”启动子是一种核苷酸序列,当可操作地链接至编码或指定一基因产物的多核苷酸时,诱导型启动子实质上仅在细胞中存在对应于该启动子的诱导物时于该细胞内产生该基因产物。“组织特异性”启动子是一种核苷酸序列,当可操作地链接至由基因编码或指定的多核苷酸时,组织特异性启动子实质上仅在细胞为与该启动子对应的组织细胞时在该细胞内产生该基因产物。“治疗性”处理是削减或消除病理学迹象为目的,对展现那些迹象的受试者进行的治疗。本文中,“治疗疾病或病变”意为减少患者经受该疾病或病变的症状的频率。本文中,疾病和病变可互换使用。本文中,短语“治疗有效量”指足以有效预防或治疗(延迟或预防其爆发、预防其进展、抑制、降低或反转)疾病或病症,包括缓解这些疾病的症状的量。本文中使用的“治疗”疾病意为减轻受试者经历的疾病或病变的至少一种迹象或症状的频率或严重性。本文中使用的术语“变体”是一种核酸序列或肽序列,其分别不同于参考核酸序列或肽序列,但保持参考分子的本质性质。核酸变体序列中的改变可不变更由该参考核酸编码的肽的氨基酸序列,或可导致氨基酸置换、加成、消除、融合和截断。肽变体序列中的改变典型是受限的或保守的,因此,参考肽的序列与变体整体上密切相似且在多数区域内是一致的。变体与参考肽的不同可能在于氨基酸序列中的以任意方式组合的一处或多处置换、加成、消除。核酸或肽的变体可以是天然出现的,如等位基因变体;或者可以是自然界尚未发现的变体。核酸和肽的非天然出现的变体可由突变技术作成或直接合成。“载体”是物质的组合物,其包含分离的核酸且可用来将该分离的核酸输送至细胞内部。该领域已知大量载体,其包括,但不限于,线性多核苷酸、与离子性或两性分子化合物相联系的多核苷酸、质粒、及病毒。因此,术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括非质粒化合物及非病毒化合物,该化合物促进核酸转移至细胞内,例如,聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒性载体的实例包括,但不限于,腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。范围:贯穿本公开内容,本发明的多个方面可以范围格式存在。应理解,以范围格式进行的说明仅为方便和简洁起见,而且不应解释为对本发明范畴的刚性限制。据此,范围的说明应认为是具有具体公开的全部可能的子范围以及该范围内的个体数值。例如,诸如1至6的范围说明应认为是具有具体公开的子范围如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等,以及该范围内的个体数字如1、2、2.7、3、4、5、5.3、和6。不管该范围广度如何,皆如此使用。说明本发明提供治疗和预防有此需要的受试者的疱疹病毒感染的组合物和方法。例如,某些具体具体实施例中,本发明提供一种组合物,其特异性裂解疱疹病毒的病毒基因组中的靶标序列,从而预防或减轻病毒复制的能力,并因此抑制疱疹病毒的感染性。本发明部分地基于使用对于I型人单纯性疱疹病毒(也指为HSV1)为特异性的单一和复合结构中的CRISPR-Cas9系统所获得的结果。在本文中别处存在的实验中使用的CRISPR-Cas9系统通过引入插入/删除(InDel)突变而牵连对应于关键HSV1蛋白最开始的两个编码外显子的病毒DNA序列的完整性。本文中表明,CRISPR-Cas9介导的HSV1特异性基因编辑导致了病毒基因表达的失活,并减缓或停止细胞中的病毒复制。例如,本文中揭示的CRISPR-Cas9分子具有移除HSV1基因组的大节段的潜力,并削弱病毒在被感染的细胞中复制的能力。此外,本文中的数据表明,细胞中预先存在的HSV1导向的Cas9令它们对HSV1感染免疫。例如,本文中的RNA引导的Cas9作为分子剪刀通过打断HSV1基因组的多个区域而起作用,废止病毒的复制。因此,本发明提供一种作为新颖的治疗性和预防性策略的组合物和方法,其以被感染的细胞内的HSV1基因组为靶标,以摧毁急性或潜伏性HSV1感染中的病毒基因组。一种具体实施例中,本发明提供用于治疗或预防有此需要的受试者的疱疹病毒感染的组合物和方法。一种具体实施例中,该组合物包含至少一种分离的引导性核酸分子,该分子包含与疱疹病毒基因组中的靶标区域互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,该组合物包含CRISPR相关(Cas)肽,或其功能性片段或衍生物。该分离的核酸引导性分子与该CRISPR相关(Cas)肽联合起到在该疱疹病毒基因组内的靶标位点处诱发一个或多个突变的功能,从而抑制该病毒的感染性。该组合物也涵盖编码CRISPR-Cas系统的一个或多个要素的分离的核酸。例如,一种具体实施例中,该组合物包含编码该引导性核酸分子和CRISPR相关(Cas)肽的至少一种的分离的核酸、或其功能性片段或衍生物。一种具体实施例中,本发明提供用于治疗或预防有此需要的受试者的疱疹病毒感染的方法。一种具体实施例中,该方法包含向该受试者给药有效量的组合物,该组合物包含引导性核酸分子、CRISPR相关的(Cas)肽、或其功能性片段或衍生物的至少一者。某些情况下,该方法包含给药一种组合物,该组合物包含编码该引导性核酸分子及CRISPR相关(Cas)肽的至少一种的分离的核酸、或其功能性片段或衍生物。某些具体具体实施例中,该方法包含向被诊断患有疱疹病毒感染、存在发展出疱疹病毒感染的风险、具有潜伏性疱疹病毒感染等的受试者给药本文中揭示的组合物。一种具体实施例中,该方法被用来治疗或预防疱疹病毒感染,其包括,但不限于,I型单纯性疱疹病毒(HSV1)、单纯性疱疹病毒2(HSV2)、人疱疹病毒-3(HHV-3;水痘带状疱疹病毒(VZV))、人疱疹病毒-4(HHV-4;爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))、人疱疹病毒-5(HHV-5;巨细胞病毒(CMV))、人疱疹病毒-6(HHV-6;玫瑰疹病毒)、人疱疹病毒-7(HHV-7)、及人疱疹病毒-8(HHV-8;卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV))。疱疹病毒疱疹病毒属分为三个基因属:α-疱疹病毒(如,HSV1、造成生殖器疱疹的2型单纯性疱疹病毒、及造成水痘和带状疱疹的水痘带状疱疹病毒);β-疱疹病毒(如,造成第六病的HHV-6、及造成玫瑰疹的HHV-7);和γ-疱疹病毒(如,造成单核细胞增多症及其它疾病的爱泼斯坦-巴尔病毒、及造成卡波济氏肉瘤的HHV-8)。α-疱疹病毒不仅具有相似的生命周期,而且在多数病毒蛋白中具有病毒复制和再活化所必需的同源DNA序列。1型单纯性疱疹病毒(HSV1)是带衣壳的双链153千碱基(kB)DNA病毒,是一种几乎普遍存在的人类病原体。高达60%的美国人在其40岁年龄段时均已经感染HSV1。初次感染典型出现在幼儿期,且以发热及口腔和齿龈粘膜的损伤为特征,但亚临床感染频繁出现。初次HSV1感染也可在性接触过程中出现,且HSV1作为生殖器疱疹肇因的发现越来越多。尽管初次感染的症状典型是相当温和的,但可能出现威胁生命的感染,特别是如果该感染是新生儿期招致的或如果HSV1被免疫缺陷个体接触。初次感染后,HSV1基因组可在感觉神经元内长期潜伏。在病毒生命周期的这阶段,HSV1基因组以超螺旋的游离基因状态存在于被潜伏性感染的神经元的细胞核内。这状态下,不产生病毒蛋白,且仅产生一种病毒转录本即潜伏相关转录本(LAT)。一定量的刺激,包括应力和UV光,可导致来自潜伏性感染的神经元的病毒再活化。再活化可在初始感染后的多年内反复出现。HSV1再活化造成的症状随初次感染位点和再活化程度而变。HSV1再活化的最常见的识别形式为唇疱疹。这些典型在多种刺激包括UV光辐射后出现在口腔的唇红缘上。存在于支配生殖器的背根神经节神经元中的病毒的再活化造成生殖器疱疹的再次出现。HSV1再活化的口面及肛门与生殖器临床表现的标志为该区域的最初的前突刺痛,之后是含有纯然小病毒的疼痛水疱的出现,产生溃疡并最终愈合。其它,HSV1再活化的较不常见的临床表现包括贝尔氏麻痹、耳部手术后的延迟性面瘫、及前庭神经炎。HSV1再活化可具有破坏性更大的临床表现,如疱疹性脑炎及播散性疱疹。初次感染过程中,出现了所定义序列的蛋白质表达(图1)。初次感染过程中,在病毒进入细胞内之后,病毒衣壳被释放入细胞质中,且宿主蛋白质合成被外皮蛋白VHS/UL41停止。第二外皮蛋白VP16与宿主蛋白Oct1和HCF形成复合体,以诱发最早期HSV1转录。这些最早期基因诱发了病毒DNA复制所需的HSV1编码酶的表达,这些酶包括胸苷激酶(TK)和病毒DNA聚合酶(UL30)。随着病毒DNA产生的继续进行,产生了病毒进入细胞内所必需的晚期病毒蛋白,包括衣壳蛋白、外皮蛋白、及糖蛋白。病毒颗粒组装体和病毒DNA被封装在衣壳内。最终,产生了传染性病毒颗粒,导致周围细胞的感染并传播至其他人。在再活化的后期,在HSV1于潜伏性感染的神经元中再活化过程中,病毒再活化的初始步骤的顺序被认为是重复的。裂解性感染中扮演关键角色的蛋白质如VP16,被认为在再活化中扮演类似的关键角色。随着HSV1再活化进程的进展,出现了最早期基因表达,接着是早期蛋白质的产生,随后是晚期蛋白质的产生。最终,出现了感染性病毒颗粒的产生,导致感染传播至相邻细胞及未感染的个体。近年来,已经研发出了以内源性基因为靶向的若干系统,包括采用位点特异性双链DNA断裂(DSB)介导的DNA修复机制的归位内切酶(HE)或大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)及最近的规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)相关系统9(Cas9)蛋白。这些酶通过DSB介导的DNA修复机制诱发精确、有效的基因组切割。这些DSB介导的基因组编辑技术令靶标基因删除、插入、或修改成为可能。过去几年中,ZFN和TALEN已经彻底改变了基因组编辑。ZFNs和TALEN的主要缺点是不可控的脱靶效应以及用于每一靶标位点的定制DNA结合融合蛋白的工程繁冗且昂贵,这限制了其普遍应用和临床安全性。RNA引导的Cas9生物技术诱发基因组编辑而没有可检测的脱靶效应。这技术利用细菌体内的基因组防御机制的优点,该机制为,CRISPR/Cas基因座编码RNA引导的对抗可移动的基因因素(病毒、转位因子和接合质粒)的适应性免疫系统。三种类型(I至III)的CRISPR系统已经得以确认。CRISPR簇含有间区序列,即,与前期移动要素互补的序列。CRISPR簇被转录并发展为成熟的CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)RNA(crRNA)。Cas9属于II型CRISPR/Cas系统,且具有切割靶标DNA的强内切酶活性。Cas9由成熟crRNA和小RNA(tracrRNA)引导,其中,该成熟crRNA含有约20个碱基对(bp)的独特靶标序列(称为间区序列),而该tracrRNA引导pre-crRNA的核糖核酸酶III辅助处理的反式激活。经由该crRNA上的间区序列与该靶标DNA(tDNA)上的互补序列(称为前间区序列)之间的互补性碱基配对,crRNA:tracrRNA双链将Cas9导向至靶标DNA。Cas9识别出三核苷酸(NGG)前间区序列邻近基序(PAM),以特异化切割位点(从PAM起的第三个核苷酸)。该crRNA和tracrRNA可独立表达,或经由合成性茎环(AGAAAU)处理为人工融合小引导性RNA(gRNA),以模拟天然的crRNA/tracrRNA双链。这gRNA,如shRNA,可被合成或体外转录而用于直接RNA转染或从RNA表达载体(如,U6或H1启动子驱动的载体)表达。因此,Cas9gRNA技术需要Cas9蛋白和gRNA的表达,这表达随后在靶标基因组中的特异靶标DNA结合位点处形成基因编辑复合体,并造成该靶标DNA的裂解/成熟。然而,本发明并不限于Cas9介导的基因编辑的使用。毋宁说,本发明涵盖其它CRISPR相关肽的使用,这些肽可作为使用gRNA的靶向序列的靶标,且可编辑并因而以感兴趣的位点为靶向。例如,一种具体实施例中,本发明使用Cpf1来编辑感兴趣的靶标位点。如本文中揭示,一种具体实施例中,本发明采用了使用新颖的RNA引导的CRISPR技术的基因策略,该技术以HSV1基因组为靶标,且通过编辑HSV1最早期基因的特定结构域,废除被感染细胞蛋白0(ICP0)的表达。然而,本发明并不限于HSV1的预防或治疗。毋宁说,本发明可用来治疗或预防其它疱疹病毒。例如,由于HSV2基因组与HSV1基因组相似,本文中揭示的策略在治疗或预防HSV2方面有效。组合物本发明提供用于治疗或预防有此需要的受试者的疱疹病毒感染的组合物。在某些方面,该组合物包含CRISPR/Cas基因编辑系统的一种或多种构成及/或一种或多种编码该系统的分离的核酸。引导性核酸分子一种具体实施例中,该组合物包含至少一种分离的引导性核酸分子、或其片段,其中,该引导性核酸分子包含与疱疹病毒基因组中一个或多个靶标序列互补的核苷酸序列。一种具体实施例中,该引导性核酸分子是引导性RNA(gRNA)。一种具体实施例中,该gRNA包含crRNA:tracrRNA双链。一种具体实施例中,该gRNA包含模拟天然的crRNA与tracrRNA间双螺旋的茎环。一种具体实施例中,该茎环包含一核苷酸序列,该核苷酸序列包含AGAAAU。例如,一种具体实施例中,该组合物包含合成的或嵌合的包含crRNA、茎、及tracrRNA的引导性RNA。某些具体实施例中,该组合物包含分离的crRNA及/或分离的tracrRNA,两者杂交以形成天然双螺旋。例如,一种具体实施例中,该gRNA包含具有靶向序列的crRNA或crRNA前体(pre-crRNA)。一种具体实施例中,该gRNA包含与疱疹病毒基因组中的靶标序列实质互补的核苷酸序列。疱疹病毒基因组中的该靶标序列可以是任何编码或非编码区域内的任何序列,于该区域内,CRISPR/Cas介导的基因编辑将会导致该基因组的突变和对病毒感染性的抑制。某些具体实施例中,该gRNA与之实质互补的靶标序列位于ICP0基因、ICP4基因、或ICP27基因内。某些具体实施例中,与该靶标实质互补的gRNA序列的长度为约10个至30个核苷酸。某些具体实施例中,该gRNA包含结合至HSV基因组的靶标序列的核苷酸序列。例如,某些具体实施例中,该gRNA包含与该靶标序列实质互补的核苷酸序列,并因此结合至该靶标序列。例如,可用以令该gRNA以基因组中靶标序列为靶标的例示性核苷酸序列提供于图3、图7、实施例1和实施例2中。例如,某些具体实施例中,该gRNA与选自下列组成群组的HSV基因组的靶标序列实质互补:TCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGC(SEQIDNO:1,“2A”);GGACAGCACGGACACGGAACTGTTCGAGACG(SEQIDNO:2,“2B”);GCATCCCGTGCATGAAAACC(SEQIDNO:3,“2C”);TGTGCAACGCCAAGCTGGTGTACCTGATAG-3’(SEQIDNO:4,“2D”);GCGAGTACCCGCCGGCCTGA(SEQIDNO:5,“1”);GCGAGCCGCGGCGCCGCGGG(SEQIDNO:6,“3”);TTCTACGCGCGCTATCGCGA(SEQIDNO:7,“ICP4m1”);GGAGTGTTCCTCGTCGGACG(SEQIDNO:8,“ICP27m1”)。某些具体具体实施例中,该靶标序列先于PAM序列。例如,一种具体实施例中,该靶标序列先于NGGPAM序列。例示性靶标序列+PAM序列(下划线者为PAM序列)如下:TCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGCCGG(SEQIDNO:9,“2A”);GGACAGCACGGACACGGAACTGTTCGAGACGGGG(SEQIDNO:10,“2B”);GCATCCCGTGCATGAAAACCTGG(SEQIDNO:11,“2C”);TGTGCAACGCCAAGCTGGTGTACCTGATAGTGG(SEQIDNO:12,“2D”);GCGAGTACCCGCCGGCCTGAGGG(SEQIDNO:13,“1”);GCGAGCCGCGGCGCCGCGGGGGG(SEQIDNO:14,“3”);TTCTACGCGCGCTATCGCGACGG(SEQIDNO:15,“ICP4m1”);GGAGTGTTCCTCGTCGGACGAGG(SEQIDNO:16,“ICP27m1”)。再者,本发明涵盖分离的核酸(如,gRNA),该分离的核酸与本文中揭露的核酸具有实质同源性。某些具体实施例中,该分离的核酸与本文中别处揭示的gRNA的核苷酸序列的序列同源性为至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%。该引导性RNA序列可以是正义序列或反义序列。在源自酿脓链球菌(S.pyogenes)的CRISPR-Cas系统中,该靶标DNA典型为紧邻且先于5’-NGG前间区序列邻近基序(PAM)。其它Cas9同原序列可具有不同的PAM特异性。例如,来自嗜热链球菌(S.thermophilus)的Cas9对于CRISPR1需要5’-NNAGAA,而对于CRISPR3则需要5’-NGGNG;且脑膜炎双球菌(Neisseriameningiditis)需要5’-NNNNGATT。该引导性RNA的特异性序列可变,但无论该序列如何改变,有用的引导性RNA序列将是脱靶效应最小且同时实现疱疹病毒靶标序列的高效突变的那些。该引导性RNA的特异性序列可变,但无论该序列如何改变,有用的引导性RNA序列将是脱靶效应最小且同时实现HSV基因组的高效编辑的那些。该引导性RNA序列的长度可从约20至约60或更多个核苷酸可变,例如,约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约45、约50、约55、约60或更多个核苷酸。可用的选择方法确认了外来病毒基因组与宿主细胞基因组之间具有极低同源性的区域,包括使用靶标序列+NGG靶标选择准则以排除脱靶人转录组或(甚至罕见的)未转译基因组位点的生物信息学筛选,以及WGS、桑格(Sanger)定序和SURVEYOR试验,以确认并排除潜在的脱靶效应。算法如CRISPR设计工具(CRISPRGenomeEngineeringResources;BroadInstitute)可用来确认具有或近乎必需由所使用的Cas肽类型(即,Cas9、Cas9变体、Cpf1)定义的PAM序列的靶标序列。某些具体实施例中,该组合物包含多种不同的gRNA分子,各自以不同的靶标序列为靶标。某些具体实施例中,提供这多工性策略来增加效能。某些具体实施例中,该RNA分子(如,crRNA、tracrRNA、gRNA)可经工程化以包含一个或多个修饰核酸碱基。例如,已知的对RNA分子的修饰可在例如李维斯(Lewis)编撰的《基因VI》第9章(GenesVI,Chapter9(“InterpretingtheGeneticCode”),Lewis,ed.(1997,OxfordUniversityPress,NewYork))及格罗让(Grosjean)和本尼(Benne)编撰的《RNA的修饰和编辑》(ModificationandEditingofRNA,GrosjeanandBenne,eds.(1998,ASMPress,WashingtonDC))中找到。修饰的RNA组分包括下列:2'-O-甲基胞苷;N4-甲基胞苷;N4-2'-O-二甲基胞苷;N4-乙酰基胞苷;5-甲基胞苷;5,2'-O-二甲基胞苷;5-羟甲基胞苷;5-甲酰基胞苷;2'-O-甲基-5-甲酰基胞苷;3-甲基胞苷;2-硫代胞苷;赖胞苷(lysidine);2'-O-甲基尿苷;2-硫代尿苷;2-硫代-2'-O-甲基尿苷;3,2'-O-二甲基尿苷;3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷;4-硫代尿苷;胸腺嘧啶核糖核苷;5,2'-O-二甲基尿苷;5-甲基-2-硫代尿苷;5-羟基尿苷;5-甲氧基尿苷;尿苷-5-氧乙酸;尿苷-5-氧乙酸甲酯;5-羧甲基尿苷;5-甲氧羰基甲基尿苷;5-甲氧羰基甲基-2'-O-甲基尿苷;5-甲氧羰基甲基-2'-硫代尿苷;5-氨基甲酰基甲基尿苷;5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷;5-(羧基羟甲基)尿苷;5-(羧基羟基甲基)尿苷甲酯;5-氨基甲基-2-硫尿核苷;5-甲基氨基甲基尿苷;5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷;5-甲基氨基甲基-2-硒尿苷;5-羧甲基氨基甲基尿苷;5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷;5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷;二氢尿苷;二氢胸腺嘧啶核糖核苷;2'-甲基腺苷;2-甲基腺苷;N6N-甲基腺苷;N6,N6-二甲基腺苷;N6,2'-O-三甲基腺苷;2-甲硫基-N6N-异戊烯基腺苷;N6-(顺-羟基异戊烯基)-腺苷;2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)-腺苷;N6-环氧丙基氨基甲酰基)腺苷;N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷;N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷;2-甲硫基-N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷;N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷;2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷;2'-O-腺嘌呤核糖核苷(磷酸酯);肌苷;2'O-甲基肌苷;1-甲基肌苷;1;2'-O-二甲基肌苷;2'-O-甲基鸟苷;1-甲基鸟苷;N2-甲基鸟苷;N2,N2-二甲基鸟苷;N2,2'-O-二甲基鸟苷;N2,N2,2'-O-三甲基鸟苷;2'-O-鸟嘌呤核糖核苷(磷酸酯);7-甲基鸟苷;N2,7-二甲基鸟苷;N2,N2,7-三甲基鸟苷;怀俄苷(wyosine);甲基怀俄苷;修饰不足的羟基怀丁苷(under-modifiedhydroxywybutosine);怀丁苷(wybutosine);羟基怀丁苷;过氧怀丁苷;辫苷(queuosine);环氧辫苷;半乳糖基-辫苷;甘露糖基-辫苷;7-氰基-7-脱氮鸟苷;古嘌苷[也称为7-甲酰胺基-7-脱氮鸟苷];及7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷。本发明的方法或该领域中的其它方法可用来确认另外的修饰RNA分子。本发明的分离的核酸分子,包括RNA分子(如,crRNA、tracrRNA、gRNA)或编码该RNA分子的核酸,可通过标准技术产生。例如,聚合酶链反应(PCR)技术可用来获得含有本文中揭示的核苷酸序列的分离的核酸,包括本文中揭示的编码多肽的核苷酸序列。PCR可用来从DNA以及RNA扩增特定序列,包括来自全基因组DNA或总细胞RNA的序列。多种PCR方法揭示在例如迪芬巴赫(Dieffenbach)和德威克斯勒(Dveksler)编撰的《PCR引物:实验指南(第二版)》(PCRPrimer:ALaboratoryManual,2ndedition,DieffenbachandDveksler,eds.,冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress),2003)。通常,采用来自感兴趣的区域末端或超出该区域的序列信息来设计寡核苷酸引物,该引物与待扩增的模板的相反链相同或相似的序列。多种PCR策略也是可应用的,通过这些策略,可将位点特异性核苷酸序列修饰引入模板核酸中。该分离的核酸也可或作为单一核酸分子(如,使用亚磷酰胺技术进行3’至5’方向的自动化DNA合成)或作为一系列寡核苷酸而化学合成。本发明的分离的核酸也可通过突变发生而获得,如,天然出现的crRNA部分、tracrRNA、编码RNA的DNA、或编码Cas9的DNA的突变。某些具体实施例中,该分离的RNA分子是从编码该RNA分子的表达载体中合成的,如本文中别处详细揭示的。Cas肽一种具体实施例中,该组合物包含CRISPR相关(Cas)肽,或其功能性片段或衍生物。某些具体实施例中,该Cas肽是核酸内切酶,其包括,但不限于,Cas9核酸酶。一种具体实施例中,该Cas9肽包含与野生型酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)Cas9氨基酸序列一致的氨基酸序列。一些具体实施例中,该Cas肽可包含来自其它品种如其它链球菌种如嗜热链球菌、绿脓假单胞菌(Psuedomonasaeruginosa)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、或其它定序的细菌基因组和古生菌、或其它原核微生物的Cas蛋白质的氨基酸序列。可用于本发明的其它Cas肽是已知的,或可使用该领域已知方法确认(见,如,Esveltetal.,2013,NatureMethods,10:1116-1121)。某些具体实施例中,该Cas肽可包含相对于其天然来源修饰的氨基酸序列。例如,一种具体实施例中,野生型酿脓链球菌Cas9序列可被修饰。某些具体实施例中,该氨基酸序列可以是经优化的用于在人细胞内(即,“人源化”)或感兴趣的品种内表达的密码子。人源化Cas9核酸酶序列可以是,例如,基因银行登录号KM099231.1GL669193757、KM099232.1GL669193761、或KM099233.1GL669193765中列举的任何表达载体编码的Cas9核酸酶序列。或者,该Cas9核酸酶序列可以是,例如,可商购的载体如来自Addgene(Cambridge,MA)的PX330或PX260中所含有的序列。一些具体实施例中,该Cas9核酸内切酶可具有一氨基酸序列,该序列是基因银行登录号为KM099231.1GL669193757、KM099232.1GL669193761、或KM099233.1GL669193765的任何Cas9核酸内切酶序列或PX330或PX260(Addgene,Cambridge,MA)的Cas9氨基酸序列的变体或片段。该Cas9核苷酸序列可经修饰,以编码Cas9的生物学活性变体,这些变体可具有或可包括,例如,凭借含有一个或多个突变(如,加成突变、删除突变、或置换突变、或这些突变的组合)而不同于野生型Cas9的氨基酸序列。一个或多个置换突变可以是置换(如,保守氨基酸置换)。某些具体实施例中,该Cas肽是突变Cas9,其中,与野生型Cas9相比,该突变Cas9降低了脱靶效应。一种具体实施例中,该突变Cas9是酿脓链球菌Cas9(SpCas9)变体。一种具体实施例中,SpCas9变体包含一个或多个点突变,其包括,但不限于,R780A、K810A、K848A、K855A、H982A、K1003A、及R1060A(Slaymakeretal.,2016,Science,351(6268):84-88)。一种具体实施例中,SpCas9变体包含D1135E点突变(Kleinstiveretal.,2015,Nature,523(7561):481-485)。一种具体实施例中,SpCas9变体包含一个或多个点突变,其包括,但不限于,N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、L169A、及Y450A(Kleinstiveretal.,2016,Nature,doi:10.1038/nature16526)。一种具体实施例中,SpCas9突变包含一个或多个点突变,其包括,但不限于,M495A、M694A、及M698A。Y450牵涉疏水性碱基对堆积。N497、R661、Q695、Q926牵涉有助于脱靶效应的碱基残基的氢键结合。N497通过肽骨架氢键结合。L169A牵涉疏水性碱基对堆积。M495A、M694A、及H698A牵涉疏水性碱基对堆积。一种具体实施例中,SpCas9变体包含位于一种或多种下述残基处的一个或多个点突变:R780、K810、K848、K855、H982、K1003、R1060、D1135、N497、R661、Q695、Q926、L169、Y450、M495、M694、及M698。一种具体实施例中,SpCas9变体包含选自下列所组成群组的一个或多个点突变:R780A、K810A、K848A、K855A、H982A、K1003A、R1060A、D1135E、N497A、R661A、Q695A、Q926A、L169A、Y450A、M495A、M694A、及M698A。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、及Q926A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9突变包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、及D1135E处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、及L169A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、及Y450A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、及M495A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、及M694A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、及H698A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及L169A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及Y450A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及M495A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及M694A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于N497A、R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及M698A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、及Q926A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、及D1135E处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、及L169A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、及Y450A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、及M495A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、及M694A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、及H698A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及L169A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及Y450A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及M495A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及M694A处的点突变。一种具体实施例中,该SpCas9变体包含相对于野生型SpCas9的位于R661A、Q695A、Q926A、D1135E、及M698A处的点突变。一种具体实施例中,该突变的Cas9包含改变PAM特异性的一个或多个突变(Kleinstiveretal.,2015,Nature,523(7561):481-485;Kleinstiveretal.,2015,NatBiotechnol,33(12):1293-1298)。一种具体实施例中,该突变的Cas9包含改变Cas9的催化活性的一个或多个突变,其包括,但不限于,RuvC中的D10A和HNH中的H840A(Congetal.,2013,Science339:919-823;Gasiubasetal.,2012,PNAS109:E2579-2586;Jineketal,2012,Science337:816-821)。但是,本发明并不限于Cas9介导的基因编辑的使用。毋宁说,本发明涵盖其它CRISPR相关肽的使用,该肽可使用gRNA而以靶标序列为靶标且可编辑而以感兴趣的位点为靶标。例如,一种具体实施例中,本发明使用Cpf1来编辑感兴趣的靶标。Cpf1是单一crRNA引导的2类CRISPR效应子蛋白质,其可有效编辑人细胞内的靶标DNA序列。例示性Cpf1包括,但不限于,氨基酸球菌属(Acidaminococcussp.)Cpf1(AsCpf1)及毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)Cpf1(LbCpf1)。本发明应解释为包括任何形式的具有与本文中揭露的Cas肽(如,Cas9)的实质同源性的肽。较佳地,“实质同源的”肽与本文中揭露的Cas肽的氨基酸序列为约50%同源,更优选约70%同源,甚至更优选约80%同源,更优选约90%同源,甚至更优选约95%同源,且甚至更优选约99%同源。或者,该肽可通过重组手段或通过从较长的多肽裂解而作成。该肽的组成可通过氨基酸分析或定序予以证实。根据本发明的肽的变体可以是(i)一个或多个氨基酸残基被置换为保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)的一者,且如此置换的氨基酸残基可以通过或不通过该遗传密码编码;(ii)存在一个或多个修饰氨基酸残基,如,通过取代基的连接而修饰的残基的一者;(iii)该肽是本发明的肽的变体的变位剪接变体的一者;(iv)肽的片段;及/或(v)该肽与另一肽融合所得者,该另一肽为诸如前导序列或分泌序列或用于纯化(例如,His标记)或检测(例如,Sv5表位标记)的序列。该片段包括经由原始序列的蛋白水解性裂解(包括多位点蛋白质水解)而生成。变体可以经转译后修饰或化学修饰。这些变体被认为是在该领域技术人员自本文所教导而获知的范畴内。如该领域中所知,两个肽之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替代物与第二个多肽的序列比较而确定的。变体定义为包括不同于原始序列的肽序列,与该原始序列的不同之处优选每一感兴趣的节段内少于40%的残基,更优选每一感兴趣的节段内少于25%的残基,更优选每一感兴趣的节段内少于10%的残基,最优选每一感兴趣的节段内仅有几个不同于该原始序列的残基且同时其与该原始序列的同源性足以令其保有原始序列的功能性。本发明包括与原始氨基酸序列相似度为至少60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%、或95%或相同的氨基酸序列。使用计算机算法和该领域技术人员广泛认知的方法确定两个肽之间的一致性程度。优选使用BLASTP算法来确定两个氨基酸序列之间的一致性[BLASTManual,Altschul,S.,etal.,NCBINLMNIHBethesda,Md.20894,Altschul,S.,etal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]。本发明的肽可经转译后修饰。例如,落入本发明范畴内的转译后修饰包括单一肽裂解、糖基化、乙酰化、异戊二烯化、蛋白质水解、豆蔻酰化、蛋白质折叠和蛋白水解处理等。一些修饰或处理事件需要引入额外的生物机械。例如,处理事件如单一肽裂解和芯糖基化,是通过将犬类微粒体膜或非洲爪蟾蜍卵提取物(US6,103,489)加入标准转译反应而检查的。本发明的肽可通过转译后修饰形成或通过在转译过程中引入非天然氨基酸而包括非天然氨基酸。大量途径可用于在蛋白质转译过程中引入非天然氨基酸。本发明的肽或蛋白质可与另一分子如蛋白质缀合,以制备融合蛋白。这可通过例如N端或C端融合蛋白的合成而实施,条件是所得融合蛋白保持该Cas肽的功能性。本发明的肽或蛋白可使用传统方法如Reedijk等人揭示的方法(TheEMBOJournal11(4):1365,1992)进行磷酸化。本发明的肽的环状衍生物也是本发明的一部分。环化可令该肽获取更有利于与其它分子关联的构造。环化可使用该领域已知技术实现。例如,可在两个具有有利巯基的适当间隔的组分之间形成二硫键,或可在一个组分的氨基与另一组分的羧基之间形成酰胺键。环化也可使用含有偶氮苯的氨基酸实现,如Ulysse,L.等人在J.Am.Chem.Soc.1995,117,8466-8467中所揭示。形成这些键的组分可以是氨基酸的侧链、非氨基酸组分、或两者的组合。本发明的一种具体实施例中,环状肽可在右侧位置包含β-转(beta-turn)。可通过在右侧位置加入氨基酸Pro-Gly而将β-转引入该肽中。所希望的可能是产生比含有上述肽键链接的环状肽挠性更大的环状肽。可通过在肽的右侧和左侧位置引入半胱氨酸并在两个半胱氨酸之间形成二硫桥而制备挠性更大的肽。两个半胱氨酸以不令β-折叠和β-转变形的方式安排。作为该二硫链接的长度和β-折叠部位中较小的氢键数的结果,该肽的挠性更大。可通过分子动力学模拟确定环状肽的相对挠性。本发明也涉及包含Cas肽的肽,该Cas肽融合至、或合并入能将嵌合蛋白导向至所希望的细胞组分或细胞类型或组织的靶标蛋白及/或靶向结构域。该嵌合蛋白也可含有另外的氨基酸序列或结构域。就多种组分来自不同来源且自然界未见如此结合在一起而言(即,是异源的),该嵌合蛋白是重组的。一种具体实施例中,该靶向结构域可以是跨膜结构域、膜结合结构域、或将该蛋白质导向至与例如囊泡或细胞核关联的序列。一种具体实施例中,该靶向结构域可令该肽以特定细胞类型或组织为靶标。例如,该靶向结构域可以是细胞表面配体或对抗靶标组织(如,癌组织)细胞表面抗原的抗体。靶向结构域可令本发明的肽以细胞组分为靶标。某些具体实施例中,该靶向结构域以肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为靶标。包含本发明的接合至其它分子的肽或嵌合肽的N端或C端融合蛋白,可通过使用重组技术将该肽或嵌合蛋白的N端或C端融合至具有所希望的生物功能的所选蛋白或可选标记物而制备。所得融合蛋白含有融合至本文中揭示的所选蛋白或标记蛋白的Cas肽或嵌合蛋白。可用来制备融合蛋白的蛋白质的实例包括免疫球蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血细胞凝集素(HA)、及截断的myc。本发明的肽可通过传统技术合成。例如,本发明的肽可通过化学合成使用固相肽合成技术合成。这些方法或采用固相合成方法或采用液相合成方法(见,例如,J.M.Stewart,andJ.D.Young,SolidPhasePeptideSynthesis,2ndEd.,PierceChemicalCo.,RockfordIll.(1984)和G.BaranyandR.B.Merrifield,ThePeptides:AnalysisSynthesis,BiologyeditorsE.GrossandJ.MeienhoferVol.2AcademicPress,NewYork,1980,pp.3-254的固相合成技术;以及MBodansky,PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-Verlag,Berlin1984,andE.GrossandJ.Meienhofer,Eds.,ThePeptides:Analysis,Synthesis,Biology,suprs,Vol1的经典溶液合成)。本发明的肽可通过肽合成的标准化学或生物学手段制备。生物学方法包括,而不限于,在宿主细胞内或体外转译系统中表达编码肽的核酸。本发明的肽的生物制备包括编码所希望的肽的核酸的表达。包含此编码序列的表达组件可用来产生所希望的肽。例如,可使用传统用于亚克隆基因片段的分子遗传学操作来产生编码本发明的肽的核酸的亚克隆体,如Sambrook等人在《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsLaboratory,ColdSpringsHarbor,NewYork(2012))和Ausubel等人编撰的《分子生物学现代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(NewYork,NY)(1999及先前版本))中所揭示的,上述文献各自通过引用而以其整体并入本文。亚克隆体随后在细菌细胞内进行体内外表达,以获取能被用来测试特定活性的较小的蛋白质或多肽。在表达载体的情况下,该载体可通过该领域任何方法轻易引入宿主细胞如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。本发明的所希望的肽的编码序列可以是经过优化的密码子,该优化是为了改善表达效能而如本文所示基于所中意的宿主细胞的密码子使用进行的。密码子使用模式可在文献中找到(Nakamuraetal.,2000,NucAcidsRes.28:292)。适当宿主的代表性实例包括细菌细胞,如链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、链霉菌和枯草杆菌细胞;真菌细胞,如酵母细胞和曲霉属真菌细胞;昆虫细胞,如果蝇(Drosophila)S2细胞和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞;动物细胞,如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293及人黑色素瘤细胞;及植物细胞。大量载体是该领域已知的,其包括,但不限于,线性多核苷酸、与离子性或两性化合物相关的多核苷酸、质粒、及病毒。因此,术语“载体”包括自主复制质粒和病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移入细胞内的非质粒化合物和非病毒化合物如,举例而言,聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括,但不限于,腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。该表达载体可通过本文中别处详细讨论的物理、生物或化学手段转移至宿主细胞内。为了确保从化学或生物学合成技术获得的肽是所希望的肽,可进行对该肽的组成的分析,这氨基酸组成分析可使用高分辨质谱进行,以确定该肽的分子量。或者或另外,可通过在酸水溶液中水解该肽并使用HPLC或氨基酸分析仪分离、鉴定和定量该混合物的组分而证实该肽的氨基酸含量。连续降解该肽并依次鉴定氨基酸的蛋白质测序仪,可用来明确地确定该肽的序列。可通过与无机酸如盐酸、硫酸、氢溴酸、磷酸等或有机酸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、水杨酸、苯磺酸、及甲苯磺酸反应而将本发明的肽和嵌合蛋白转化为药学的盐。核酸和载体一种具体实施例中,本发明的组合物包含编码本文中揭示的CRISPR相关系统的一种或多种要素的分离的核酸。例如,一种具体实施例中,该组合物包含编码至少一种引导性核酸分子(如,gRNA)的分离的核酸。一种具体实施例中,该组合物包含编码Cas肽的分离的核酸、或其功能性片段或衍生物。一种具体实施例中,该组合物包含编码至少一种引导性核酸分子(如,gRNA)且编码Cas肽的分离的核酸、或其功能性片段或衍生物。一种具体实施例中,该组合物包含编码至少一种引导性核酸分子(如,gRNA)的分离的核酸,且进一步包含编码Cas肽的分离的核酸、或其功能性片段或衍生物。一种具体实施例中,该组合物包含至少一种编码gRNA的分离的核酸,且该gRNA与本文中别处所揭示的HSV基因组的靶标序列实质互补。一种具体实施例中,该组合物包含至少一种编码gRNA的分离的核酸,且该gRNA与靶标序列互补,该靶标序列与本文中揭示的靶标序列的序列同源性为至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%。一种具体实施例中,该组合物包含至少一种编码本文中别处所揭示的Cas肽的分离的核酸、或其功能性片段或衍生物。一种具体实施例中,该组合物包含至少一种编码Cas肽的分离的核酸,该Cas肽与本文中别处所揭示的Cas肽的氨基酸序列同源性为至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%。该分离的核酸可包含任何类型的核酸,其包括,但不限于,DNA和RNA。例如,一种具体实施例中,该组合物包含分离的DNA分子,包括,例如,分离的cDNA分子,其编码本发明的gRNA或肽、或其官能性片段。一种具体实施例中,该组合物包含编码本发明的肽的分离的RNA分子,或其功能性片段。该分离的核酸可使用该领域任何已知方法合成。本发明也包括载体,且本发明的分离的核酸插入该载体中。该领域充斥着可用于本发明中的适当的载体。载体包括,例如,病毒载体(如,腺病毒(“Ad”)、腺相关病毒(AAV)、及水疱性口炎病毒(VSV)和逆转录病毒)、脂质体和其它含有脂质的络合物、及能介导多核苷酸至宿主细胞的输送的其它大分子络合物。载体也可包含进一步调节基因输送及/或基因表达或反而向靶标细胞提供有益性质的其它组分或功能性。这些其它组分包括,例如,影响接合至细胞或以细胞为靶向的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分);影响该细胞摄取载体核酸的组分;影响多核苷酸在被摄取后在该细胞内定位的组分(如,介导细胞核定位的试剂);以及,影响该多核苷酸表达的组分。这些组分也可以包括标记物,如可用来检测或选择已经摄取且正在表达通过该载体输送的核酸的细胞的可检测及/或可选择标记物。这些组分可提供为该载体的天然特征(如,使用某些具有介导结合和摄取的组分或功能性的病毒载体),或载体可经修饰以提供这些功能性。其它载体包括Chen等人在BioTechniques,34:167-171(2003)中揭示的那些。大部分此类载体是该领域中已知且常用的。总而言之,典型通过将编码RNA及/或肽的核酸或其一部分可操作地链接至启动子,并将该构造并入表达载体中,从而实现编码该RNA及/或肽的天然或合成核酸的表达。待使用的载体适用于复制,且任选是否整合在真核细胞中。典型的载体含有可用于令所希望的核酸序列的表达规律化的转录和转译终止剂、起始序列、及启动子。本发明的载体也可用于使用标准基因输送方案的核酸免疫和基因治疗。用于基因输送的方法是该领域中已知的。见,如,US5,399,346、US5,580,859、US5,589,466,上述专利通过引用而以其整体并入本文。另一具体实施例中,本发明提供基因治疗载体。本发明的分离的核酸可克隆进多种类型的载体中。例如,该核酸可克隆进包括但不限于质粒、噬菌体衍生物、动物病毒、及粘粒的载体中。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针生成载体、及定序载体。此外,该载体可以病毒载体的形式提供至细胞。病毒载体技术是该领域中广为人知的,且揭示于例如Sambrooketal.(2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)及其它病毒性和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括,但不限于,逆转录病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、及慢病毒。通常,适当的载体含有在至少一种有机体中具有功能的复制起点、启动子序列、便利的限制核酸内切酶位点、及一种或多种可选择的标记物(如,WO01/96584;WO01/29058;和US6,326,193)。已经研发出一些基于病毒的系统,用于将基因转移至哺乳动物细胞内。例如,逆转录病毒向基因输送系统提供便利的平台。使用该领域中已知的技术,可将所选择的基因插入载体中并封装在逆转录病毒颗粒中。重组的病毒可随后被分离并输送至体内外的受试者细胞中。大量逆转录病毒系统是该领域中已知的。一些具体实施例中,使用腺病毒载体。大量腺病毒载体是该领域中已知的。一种具体实施例中,使用慢病毒载体。例如,源自逆转录病毒如慢病毒的载体是实现长期基因转移的适当工具,这是因为这些病毒载体允许长期、稳定的转基因整合及其在子代细胞中的传播。就可转导非增殖性细胞如肝细胞而言,慢病毒载体具有比源自肿瘤逆转录病毒如鼠白血病病毒更大的优势。它们也具有低免疫原性的额外优势。一种具体实施例中,该组合物包括源自腺相关病毒(AAV)的载体。腺相关病毒(AAV)载体已经成为用于治疗多种病变的强有力的基因输送工具。AAV载体具备多种令它们理想地适用于基因治疗的特征,包括缺乏致病性、极小的免疫原性、及以稳定且有效的方式转导有丝分裂后的细胞的能力。通过选择AAV血清型、启动子、及输送方法的适合组合,AAV载体内所含有的特定基因的表达可特异性地以一种或多种类型的细胞为靶标。痘病毒载体将基因引入细胞的细胞质中。禽痘(Avipox)病毒载体仅导致该核酸的短期表达。腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯性疱疹病毒(HSV)载体可以是用于以下发明实施方式的指示。腺病毒载体导致比腺相关病毒更短期的表达(如,少于约一个月),一些具体实施例中,可展现长得多的表达。所选择的特定载体将取决于靶标细胞和待治疗的症状。某些具体实施例中,该载体也包括传统的控制要素,该要素以容许其在使用质粒载体转染的细胞或未使用本发明所产病毒转染的细胞内转录、转译及/或表达的方式可操作地链接至该转基因。本文中,“可操作地链接的”序列包括与感兴趣的基因接续的表达控制序列和反向动作或在远离该感兴趣的基因处动作的表达控制序列。表达控制序列包括适宜的转录起始、终止、启动子和增强子序列;有效的RNA处理信号如拼接和聚腺苷酸化(polyA)信号;令细胞质mRNA稳定的序列;增强转译效能的序列(即,科扎克共有序列(Kozakconsensussequence));增强蛋白质稳定性的序列;以及,若需要,增强所编码产物的分泌的序列。大量的表达控制序列,包括原生的、构建的、可引导的及/或组织特异性的启动子,是该领域中已知且可用的。另外的启动子要素,如增强子,调节转录起始的频率。典型地,这些要素位于开始位点上游的30至110bp区域,但最近发现,大量启动子也含有该开始位点下游的功能性要素。启动子要素之间的间隔经常是柔性的,因此,当要素被相对于彼此反转或移动时,启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中,启动子要素之间的间隔可增加至50bp,此后活性开始衰落。依据该启动子,个体要素似乎可合作或独立起到活化转录的功能。可轻易实施对适宜启动子的选择。在某些方面,可使用高表达启动子。适当启动子的一个实例是最早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这启动子序列是强大的组成型启动子序列,它能驱动任何可操作地链接至该启动子序列的多核苷酸序列的高水平表达。也可使用劳斯氏肉瘤病毒(RSV)和MMT启动子。某些蛋白质可使用其原生启动子表达。也可包括其它可增强表达的要素,如导致诸如tat基因和tar要素的高水平表达的增强子或系统。随后,这包括例如大肠杆菌复制起点的异种基因包可插入载体如质粒载体如pUC19、pUC118、pBR322或其它已知质粒载体中。适当启动子的另一实例是伸长生长因子1α(EF-1α)。但是,也可使用其它组成型启动子序列,其包括,但不限于,猿猴病毒40(SV40)早期启动子、鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒最早期启动子、劳斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子如,但不限于,肌动蛋白启动子、肌浆球蛋白启动子、血红蛋白启动子、及肌酸酐激酶启动子。再者,本发明不应限于组成型启动子的使用。引导型启动子也预期为本发明的一部分。引导型启动子的使用提供了一种分子开关,其能在希望进行表达时发动可操作地链接的多核苷酸序列的表达或当不希望表达时终止该表达。引导型启动子的实例包括,但不限于,金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、黄体酮启动子、及四环素启动子。在载体上发现的增强子序列也调节该载体内含有的基因的表达。典型地,增强子与蛋白因子键结以增强基因的转录。增强子可位于该基因的上游或下游。增强子也可以是组织特异性的,以增强特定细胞或组织类型中的转录。一种具体实施例中,本发明的载体包含一种或多种增强子,以推动该载体内存在的基因的转录。为了评估核酸及/或肽的表达,待引入细胞内的表达载体也可含有可选择的标记基因或报告基因或两者,以促进表达细胞从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群落中的鉴别和选择。在其它方面,该可选择的标记物可携带于独立的DNA部分上并用于共转染过程中。可选择的标记基因和报告基因两者的侧翼可具有适宜的调控序列,以令在宿主细胞内表达成为可能。可用的可选择的标记物包括,例如,抗生素耐药性基因如neo等。报告基因被用于鉴别潜伏性感染的细胞,以及用于评估调控序列的功能性。通常,报告基因不存在于受体生物或组织内或不由受体生物或组织表达,且编码其表达被证明具有一些容易检测的性质如酶促活性的多肽。在DNA已经被引入该受体细胞内之后的适当时间试验报告基因的表达。适当的报告基因可包括编码荧光素酶、β半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌的碱性磷酸酶、或绿色荧光蛋白基因的基因(如,Ui-Teietal.,2000FEBSLetters479:79-82)。适当的表达系统是众所周知的,且可使用已知技术制备或商业性获得。通常,具有最小5'侧翼区且显示最高水平的报告基因表达的构成被认为是启动子。这些启动子区域可链接至报告基因,并用来评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。将基因引入细胞内并表达的方法是该领域中已知的。在表达载体的语境中,可通过该领域中的任何方法容易地将该载体引入宿主细胞,如哺乳动物、细菌、酵母、或昆虫细胞中。例如,可通过物理、化学或生物学手段将该表达载体转移至宿主细胞内。将多核苷酸引入宿主细胞内的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、颗粒轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体及/或外源性核酸的细胞的方法是该领域中众所周知的。见,例如,Sambrooketal.(2012,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork)。将多核苷酸引入宿主细胞内的方法优选磷酸钙转染。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括DNA和RNA载体的使用。病毒载体,尤其是逆转录病毒载体,已经变为最广泛使用的将基因插入哺乳动物如人细胞内的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯性疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。见,例如,US5,350,674和US5,585,362。将多核苷酸引入宿主细胞内的化学方法包括胶体分散系统如大分子络合物、纳米胶囊、微球、微珠、及基于脂质的系统,包括水包油乳液、胶束、混合胶束、及脂质体。用作体内外输送运载剂的例示性胶体系统是脂质体(如,人工膜运载剂)。在使用非病毒输送系统的情况下,例示性输送运载剂是脂质体。脂质配方的使用被预期用于将核酸引入宿主细胞中(体外、间接体外或体内)。另一方面,该核酸可能与脂质关联。可将与脂质关联的核酸密封在脂质体的水性内腔中、散置于脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸两者相关联的链接分子粘附至该脂质体、入陷于脂质体内、与脂质体络合、分散于含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮物包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束络合、或反而与脂质关联。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物并不限于溶液中的任何特定结构。例如,它们可以双层结构存在,作为胶束存在,或具有“崩塌”结构。它们也可简单地散置于溶液中,可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是天然出现的脂肪物质或合成性脂质。例如,脂质包括细胞质中天然出现的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物的一类化合物,如脂肪酸、醇、氨、氨基醇、和醛。适用的脂质可在从商业来源获得。例如,二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得;磷酸二鲸酯(“DCP”)可从K&K实验室(Plainview,NY)获得;胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring获得;二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可从AvantiPolarLipids,Inc.(Birmingham,AL)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的原料溶液可在约-20℃储存。由于氯仿比甲醇更容易挥发,因此使用氯仿作为唯一的溶剂。“脂质体”是遗传术语,涵盖大量通过密闭双层或聚集体的生成而形成的单层和多层脂质运载剂。脂质体可特征可能在于,含有具磷脂双层膜的多孔结构及内部的水性介质。多层脂质体具有被水性介质分隔开的多个脂质层。当将磷脂悬浮在过量的水性溶液中时,它们自发形成。该脂质组分再形成闭合结构前进行自重排,并将水和被溶解的溶质入陷于脂质双层之间(Ghoshetal.,1991Glycobiology5:505-10)。但是,也可涵盖在溶液中具有不同于正常多孔结构的组成。例如,脂质可获取胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体而存在。还预期lipofectamine-核酸络合物。不考虑用来将外源性核酸引入宿主细胞的方法,为了证实该宿主细胞中存在重组核酸序列,可实施大量试验。这些试验包括,例如,该领域技术人员周知的“分子生物学”试验,如南方印迹和北方印迹、RT-PCR和PCR;“生物学”试验,如通过免疫学手段(ELISA和西方印迹)或通过本文中揭示的试验方法来检测特定肽的存在或不存在,以确认试剂落入本发明的范畴内。某些具体实施例中,该组合物包含经基因改造以表达一种或多种本文中揭示的分离的核酸及/或肽的细胞。例如,可使用一种或多种包含编码gRNA及/或Cas肽的分离的核酸序列的载体来转染或转变该细胞。该细胞可以是受试者的细胞,或它们可以是单体型匹配细胞或细胞系。可辐射该细胞以防止复制。一些具体实施例中,该细胞是人白细胞抗原(HLA)匹配的细胞、自体细胞、细胞系、或其组合。其它具体实施例中,该细胞可以是干细胞。例如,胚胎干细胞或人工多能干细胞(引导多能干细胞(iPScell))。胚胎干细胞(ES细胞)和人工多能干细胞(引导多能干细胞,iPS细胞)已经自多种动物物种包括人构建。通过对这些类型的多能干细胞的分化进行适宜的引导,且保留其主动分裂的能力同时维持其多能性,这些细胞能分化为几乎全部器官,因此它们将会是最有用的再生医学细胞来源。特别是iPS细胞,与通过摧毁胚胎而产生的ES相比,iPS细胞可从自源体细胞构建,并因此不大可能造成伦理和社会学问题。再者,iPS是自源细胞,这令其可能避免排异反应,而排异反应是再生医学和移植疗法的最大障碍。医药组合物本文中揭示的组合物适用于上述多种药物输送系统中。此外,为了增强所给药化合物的体内血清半衰期,该组合物可经密封、引入脂质体的内腔中、制备为胶体,或者可采用对该组合物提供延长的血清半衰期的其它传统技术。多种方法可用于制备脂质体,如Szoka等人的US4,235,871、US501,728和US4,837,028中所揭示的方法,前述专利各自通过引用而并入本文。此外,可在靶向药物输送系统中给药,例如,在涂覆有组织特异性抗体的脂质体中给药。该脂质体将以器官为靶向并被该器官选择性地吸收。本发明还提供包含一种或多种本文中揭示的组合物的医药组合物。可采用与传统赋形剂混合的配方,该赋形剂即为适用于给药至伤口或治疗位点的药学可接受的有机或无极载剂物质。该医药组合物可经消毒,且若需要,与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压缓冲剂的盐、着色剂、及/或芳香物质等混合。若需要,它们也可与其它活性剂如其它止痛剂组合。例如,可通过肠道外注射、静脉注射、肿瘤内注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜注射或通过输液或任何其它可接受的系统下方法而进行本发明的组合物的给药。该组合物的用于给药的剂型包括适用于直肠给药、鼻腔给药、口服、外用(包括口腔和舌下给药)、阴道给药或肠道外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)给药的那些剂型。该剂型可便利地以单元剂量如片剂和缓释胶囊的形式存在,且可通过药学领域众所周知的任何方法制备。本文中,“额外成分”包括,但不限于,下述的一种或多种:赋形剂;表面活性剂;分散剂;惰性稀释剂;粒化剂和崩解剂;粘合剂;润滑剂;着色剂;防腐剂;生理学可降解的组分如明胶;水性运载剂和溶剂;油性运载剂和溶剂;悬浮剂;分散剂和润湿剂;乳化剂;缓和剂;缓冲剂;盐;增稠剂;填料;乳化剂;抗氧化剂;抗生素;抗真菌剂;稳定剂;和药学可接受的聚合性材料或疏水性材料。可包括于本发明的医药组合物中的其它“额外成分”是该领域中已知的,且揭示在例如Genaro,ed.(1985,Remington’sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.,Easton,PA)中,该文献通过引用而并入本文。本发明的组合物可包含,以该组合物的总重为基准,约0.005%至2.0%的防腐剂。使用来防腐剂来预防在暴露于环境中的污染物时的腐败。根据本发明,可用的防腐剂的实例包括但不限于,选自由苯甲醇、山梨酸、对羟基苯甲酸酯、咪脲及其组合所组成群组的那些。特别优选的防腐剂是约0.5%至2.0%苯甲醇与0.05%至0.5%山梨酸的组合。一种具体实施例中,该组合物包含抑制该组合物的一种或多种组分降解的抗氧化剂和螯合剂。用于一些化合物的抗氧剂优选BHT、BHA、α-生育酚和抗坏血酸,以该组合物的总重为基准且以重量计,其含量的优选范围是约0.01%至0.3%,且更优选BHT的范围是0.03%至0.1%。以该组合物的总重为基准且以重量计,该螯合剂存在的量优选从0.01%至0.5%。特别优选的螯合剂包括乙二胺四乙酸盐(如,EDTA二钠)和柠檬酸,以该组合物的总重为基准且以重量计,其量为约0.01%至0.20%,更优选0.02%至0.10%的范围。该螯合剂可用于螯合该组合物中的可能不利于该配方保存期限的金属离子。尽管BHT和EDTA二钠分别是用于一些化合物的特优选抗氧化剂和螯合剂,但其它适合且等效的抗氧化剂和螯合剂也可替代,且因此终将为该领域技术人员所知。可使用传统方法制备脂质悬浮液,以实现本发明组合物在水性或油性运载剂中的悬浮。水性运载剂包括,例如,水和等渗盐水。油性运载剂包括,例如,杏仁油;油性酯类;乙醇;植物油,如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油;分馏植物油;以及矿物油,如液体石蜡。悬浮液可进一步包含一种或多种额外成分,其包括,但不限于,悬浮剂、分散剂和润湿剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐类、芳香剂、着色剂、和甜味剂。油性悬浮液可进一步包含增稠剂。已知的增稠剂包括,但不限于,山梨醇糖浆、氢化食用脂、海藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄芪胶、阿拉伯树胶、及纤维素衍生物如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。已知的分散剂和润湿剂包括,但不限于,天然出现的磷脂类如卵磷脂;环氧烷与脂肪酸、长链脂肪醇、源自脂肪酸和己糖醇的半酯、或源自脂肪酸与己糖醇和酐的半酯的缩合产物(分别如,聚氧乙烯硬脂酸酯、十七乙烯氧十六醇、聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、及聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯)。已知的乳化剂包括但不限于,卵磷脂和阿拉伯树胶。已知的防腐剂包括但不限于,对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸正丙酯基、抗坏血酸、及山梨酸。治疗方法本发明提供治疗或预防疱疹病毒介导的感染的方法。一种具体实施例中,该方法包含向有此需要的受试者给药有效量的组合物,该组合物包含引导性核酸分子和Cas肽的至少一种,或其功能性片段或衍生物。一种具体实施例中,该方法包含给药一种组合物,该组合物包含编码下述至少一种的分离的核酸:该引导性核酸分子和Cas肽,或其功能性片段或衍生物。某些具体实施例中,该方法包含向被诊断患有疱疹病毒感染、处于发展出疱疹病毒感染的风险下、患有潜伏性疱疹病毒感染等的受试者给药本文中揭示的组合物。一种具体实施例中,使用该方法来治疗或预防疱疹病毒感染,该病毒包括,但不限于,I型单纯性疱疹病毒(HSV1)、单纯性疱疹病毒2(HSV2)、人疱疹病毒-3(HHV-3;水痘带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒-4(HHV-4;爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV))、人疱疹病毒-5(HHV-5;巨细胞病毒(CMV))、人疱疹病毒-6(HHV-6;玫瑰疹病毒)、人疱疹病毒-7(HHV-7)、和人疱疹病毒-8(HHV-8;卡波济氏肉瘤相关的疱疹病毒(KSHV))。本发明的方法也用于治疗或预防与疱疹病毒感染相关的疾病和病变,其包括,但不限于,唇疱疹、生殖器疱疹、疱疹性脑炎、水痘、带状疱疹、贝尔氏麻痹、前庭神经炎、及疱疹性神经痛。给药本发明的医药组合物的受试者预期包括,但不限于,人和其它灵长类;哺乳动物,包括商业相关的哺乳动物如非人灵长类、牛、猪、马、羊、猫和狗。这些治疗剂可以节律性方案给药。本文中,“节律性”疗法指连续低剂量治疗剂的给药。该组合物可与一种或多种疗法(如,之前、同步或之后)联合给药。例如,某些具体实施例中,该方法包含与另外的抗疱疹治疗剂联合给药,该另外的抗疱疹治疗剂包括,但不限于,TK抑制剂、UL30抑制剂、阿昔洛韦、膦甲酸、西多福韦及其衍生物。可使用标准药学过程在细胞培养物或实验动物体内确定本发明组合物的剂量、毒性和疗效,如,用于确定LD50(将群体的50%致死的剂量)和ED50(对群体的50%可有效治疗的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比是治疗指数,且其可表达为LD50/ED50比。优选展现高治疗指数的Cas9/gRNA组合物。虽然可使用展现毒副作用的Cas9/gRNA组合物,但应注意设计令此类组合物以被影响的组织为靶标的输送系统,以最小化对于未感染细胞的潜在性损伤,从而降低副作用。从细胞培养物试验和动物研究获得的数据可用于制订用于人类的剂量范围。这些组合物的剂量优选在循环浓度范围内,而该范围包括具有低毒性或无毒性的ED50。依据所采用的剂型和所使用的给药途径,该剂量可在这范围内变动。对于在本发明方法中使用的任何组合物,从细胞培养物试验可预估治疗有效剂量。可在动物模型体内制订剂量,以实现包括在细胞培养物中确定的IC50(即,测试化合物实现对症状的半最大抑制)的循环血浆浓度范围。这信息可用来更准确地确定可用于人体内的剂量。例如,可通过高效液相色谱测量血浆中的水平。如本文中定义,治疗有效量的组合物(即,有效剂量)意为最易产生治疗(如,临床)上所希望结果的量。该组合物可每天给药一次或多次至每周给药一次或多次;包括每两天给药一次。该领域技术人员可认识到,某些因素可影响治疗治疗实验动物所需的剂量和时机,该因素包括,但不限于,疾病或病毒的严重性、先前治疗、健康状况及/或受试者的年龄、及存在的其它疾病。此外,使用治疗有效量的本发明组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。可通过该领域已知方法将该gRNA表达组件输送至实验动物。在一些方面,Cas可以是包括该Cas分子的活性结构域的片段,从而削减该分子的尺寸。因此,Cas/gRNA分子可临床试用,与当前基因疗法所取途径相似。一种具体实施例中,该方法包含对细胞进行基因修饰,以表达引导性核酸分子及/或Cas肽。例如,一种具体实施例中,该方法包含令细胞与编码该引导性核酸及/或Cas肽的分离的核酸接触。一种具体实施例中,该细胞是在待进行该疗法的受试者的进行基因修饰的。在某些方面,对于体内输送,将该核酸直接注射入实验动物体内。例如,一种具体实施例中,该核酸在需要组合物的位点处输送。体内核酸转移技术包括,但不限于,使用病毒载体(如腺病毒、I型单纯性疱疹病毒、腺相关病毒)、基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂质是,例如,DOTMA、DOPE和DC-Chol)、裸DNA、及基于转位子的表达系统进行转染。例示性基因治疗方案参见Andersonetal.,Science256:808-813(1992)。也参见WO93/25673及其引用的参考文献。某些具体实施例中,该方法包含直接将RNA如mRNA给药至实验动物体内(见,例如,Zangietal.,2013NatureBiotechnology,31:898-907)。对于间接体外治疗,在间接体外或体外环境中对分离的细胞进行修饰。一种具体实施例中,该细胞是待进行治疗的受试者的自体同源细胞。或者,该细胞可以与该受试者同种异体的、同基因的、或异种的。随后,经修饰的细胞可直接给药至该受试者。该领域技术人员认识到,可使用不同的输送方法将分离的核酸给药至细胞内。实例包括:(1)使用物理手段的方法,如电穿孔(电力)、基因枪(物理力)或施加大体积的液体(压力);及(2)其中核酸或载体被络合至另一整体如脂质体、凝集蛋白或运输分子的方法。待加至每一细胞内的载体的量将可能随着插入该载体内的治疗基因的长度和稳定性以及该序列的天然属性而变动,该量尤其是待需要以经验确定的参数,且可由于并非本发明方法所固有的因素(例如,与合成相关的成本)而变动。该领域技术人员可根据特定情况的紧急状态而轻易做出任何必要调整。经基因修饰的细胞也可含有自杀基因,即,编码可用来摧毁该细胞的产物的基因。在很多基因治疗情境中,希望不仅能在宿主细胞内表达用于治疗性目标的基因而且具有随意摧毁该宿主细胞的能力。该治疗剂可链接至自杀基因,在活化子化合物的缺失下,该自杀基因的表达并不被活化。当已经引入该药剂和自杀基因两者的细胞死亡是所希望的事件时,将该活化子化合物给药至该细胞,从而活化该自杀基因的表达并杀死该细胞。可使用的自杀基因/前药组合的实例是单纯性疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦(ganciclovir)、阿昔洛韦;氧化还原酶和环己酰亚胺;胞嘧啶脱氨酶和5氟胞嘧啶;胸苷激酶和胸苷酸激酶(thymidilatekinase)(Tdk::Tmk)及AZT;以及脱氧胞苷激酶和阿糖胞苷。[实施例]通过参考下述实验实施例进一步详细揭示本发明。除非明确说明,这些实施例仅提供用于例示性说明的目的而并非限制。因此,本发明绝不应解释为限制于下述实施例,而应解释为涵盖作为本文中提供的指导的结果而显而易见的任何及全部变更。无需进一步说明,据信,该领域技术人员可使用前述说明及下述例示性实施例而作成并使用本发明以及实践所主张的方法。因此,下述工作实施例特别指出了本发明的优选具体实施例,且不应解释为以任何方式限制本公开的剩余部分。实施例1:Cas9-gRNA能裂解HSV1DNA进行实验来检查CRISPR系统是否能用来裂解HSV1DNA。方法和结果记录在本文中。Cas9/ICP0gRNA构造的设计由于HSV1基因组的ICP0基因在较低(更天然的)MOI溶菌性感染中扮演的重要角色、其在从HSV1潜伏期再活化的早期步骤中的关键角色、以及可用于其功能的多种试验,而被选择作为初始靶标。最初选择5种不同的gRNA,并对ICP0序列的外显子1至3内的保守靶标进行测试(图3)。将正反向位置中的对应于每一gRNA序列的寡核苷酸对退火并随后使用PCR进行扩增,适当地切割并插入pX458或pX260Cas9载体(Addgene质粒48138和42229)中。Cas9/ICP0gRNA构造裂解ICP0序列使用Cas9/抗ICP0gRNA构造对稳定地含有ICP0DNA(L7或F06)的Vero细胞进行共转染(图3)。收集来自被抗Cas9gRNA稳定转染的F06细胞的克隆体的基因组DNA,并使用surveyor试验来分析由该构造造成的In/Del。图4中显示对于使用Cas9/抗HSV1ICP0gRNA2A(缩写为Cas9/2A)转染的F06细胞的surveyor试验结果,显示产生了180个碱基对的基因组DNA片段(图4)。使用多种Cas9/抗ICP0gRNA构造特异性移除较大块的HSV1基因组DNA揭示了Cas9/ICP0gRNA构造的串联使用,以修剪出HSV1基因组DNA的片段。当以串联形式用于瞬时转染的细胞中时,所发展出的两种抗HSV1ICP0gRNA(2A和2C)能删除ICP0序列的335个碱基对(bp),留下一个217bp的节段。这删除导致具有提前结束密码子的ICP0蛋白的截断(图5)。图5的上图显示ICP0外显子2序列的图示,包括通过抗ICP0gRNA2A和2C为靶标的特异性靶标DNA(tDNA)(图5,上)。紧接这序列下方的是L7细胞的10种克隆体的经克隆且定序的HSV1DNA,其中,该L7细胞使用Cas9/抗ICP0gRNA2A和Cas9/抗ICP0gRNA2C瞬时转染。由这两种构造介导的DNA裂解导致HSV1ICP0DNA的335个碱基对节段的删除。10个经定序的克隆体中的8个显示了单碱基对删除(显示为在图式化野生型ICP0序列下方的DNA对准地图)。10个经定序的克隆体中的2个显示位于该位点的单碱基对插入(图5,下左)。图5插图(下左)显示了表明ICP0中所切除的217个碱基对片段的琼脂糖胶电泳结果(图5,下左)。因此,如早前所述,本文中研发的CRISP-Cas9构造可裂解病毒基因组内的两个gRNA导向的区域,且剩余的基因序列通过非同源性末端接合(NHEJ)而再次接合。Cas9-gRNA以HSV1ICP0功能为靶标且压制细胞内的HSV1感染正常情况下,HSV1以相对低的病毒浓度感染所许可的Vero细胞系(图6,图示左侧的第一栏,标记为wtVerowt)。使用缺失ICP0基因的突变HSV1病毒感染相同的Vero细胞系,则需要至少100x量的突变病毒来感染这些细胞(图6,左起第二栏,标记为wtVeroΔICP0)。当将ICP0补充至该细胞系中时(例如,在表达ICP0的F06细胞中),则那些细胞可使用缺失HSV1的ICP0以显着低于预期的浓度进行感染(图6,图示中左起第四栏,标记为F06ΔICP0)。使用Cas9/抗HSV1ICP0gRNA2D对正常的Vero细胞进行稳定转染后,细胞对抗野生型HSV1感染的抗性显着变大,且不能使用低浓度的病毒感染(图6,图示的第五栏,标记为VeroCas9/2D)。这些结果与当尝试使用完全缺失ICP0的突变HSV1病毒感染正常Vero细胞时所见者(图6,图示中的第二道,标记为wtVeroΔICP0)等同。图6中所示的结果表明,抗ICP0gRNA的表达大幅度地压制了病毒复制,由需要增加病毒量来感染使用Cas9/抗HSV1ICP0gRNA2D转染的Vero细胞所证实。总而言之,这些观察结果强调了本发明中揭示可摧毁HSV1DNA整体性的新颖基因编辑系统的能力。实施例2:通过基因编辑策略进行的HSV-1复制的消融1型单纯性疱疹病毒(HSV-1)是普遍存在且具有高度传染性的人类视神经病毒,影响全世界超过85%的成年人。初次感染后,HSV-1以潜伏状态留存在神经系统神经节内,在该处,该病毒可偶尔被再活化,并在轴突输送至皮肤后复制,造成皮肤疼痛或粘膜损伤。HSV-1渗透入脑实质中并在额叶和颞叶内复制,可造成致命性脑炎。幸存者长期苦于严重的神经性并发症,包括癫痫、运动障碍和心理健康缺陷。对于HSV-1诱发的疾病,目前尚无治愈性疗法,且可再活化病毒的留存令被感染的个体一直处于其并发症的风险下。对于单细胞生物包括酿脓链球菌对抗噬菌体和可换位DNA要素的保护性反应的研究,导致了CRISPR/Cas9系统的发现(Garneauetal.,2010,Nature,468,67-71)。由于CRISPRRNA(crRNA)序列与反式激活RNA(trRNA)序列的联合可触发以外来DNA序列为靶标的通过DNA内切酶Cas9进行的双链裂解,这些微生物中的内源性II型CRISPR系统明显防御外来DNA。通过crRNA与靶标DNA上的序列之间的互补性碱基配对来确定这裂解的特异性(Gasiunasetal.,2014,ProcNatlAcadSciUSA,109:15539-15540)。利用这情况,最近,Cas9系统已经被修饰以允许在哺乳动物细胞内进行特定的基因组编辑。当进入真核细胞的细胞核内并使用该引导性RNA(gRNA)时,Cas9将插入/删除(InDel)突变引入靶标基因内(Malietal.,2013,Science,339:823-826)。RISPR/Cas9已经用来修饰若干真核基因,且已经开发了若干组的抗病毒潜能(Congetal.,2013,Science,339:819-823;Ebinaetal.,2013,SciRep,3:2150;Huetal.,2014,ProcNatlAcadSciUSA,111:11464-11466;Malietal.,2013,Science,339:823-826;Wangetal.,2014,ProcNatalAcadSciUSA,111:13157-13162;Wolleboetal.,2011,JNeuroimmunol,223:46-53;Yuenetal.,2015,JGenVirol,96:626-636)。为了评估其用以治疗和消除HSV-1感染的转译潜能,使用本文中提出的实验来检查CRISPR/Cas9压制HSV-1复制的能力,该压制以病毒感染/再活化早期和晚期过程中病毒蛋白表达必不可上的特定DNA序列为靶标。HSV-1初次感染过程中,一个界定类别的依序表达的病毒蛋白导向了成功的产生性感染循环。病毒进入细胞后,病毒衣壳蛋白被释放入细胞质中,造成宿主蛋白合成的终止。另外,在病毒感染的这最早期过程中,与衣壳蛋白相关的被感染的细胞蛋白0(ICP0)的100至200个复本被运输至外皮内部,并有助于衣壳蛋白至病毒复制出现位点的核酸酶介导的进入。同时,编码ICP0的病毒基因被激活,且新和成的ICP0促进裂解性感染的进展,这比高剂量模型更接近真实的感染。因此,ICP0对低剂量病毒感染过程中的病毒幸存和复制产生更有力的贡献。ICP0在HSV-1再活化中也是重要的,且在裂解性感染中扮演关键角色,包括破坏PML体和避免先天下免疫反应(BoutellandEverett,2013,JGenVirol,94:465-481;Samaniegoetal,1997,JVirol,71:4614-4625;HagglundandRoizman,2004,JVirol,78:2169-2178)。因此,通过以ICP0基因的DNA序列为靶标且通过研发引导性RNA以与Cas9组合而实施实验,以测试它们压制病毒基因表达的能力。发现,这策略将特定的InDel突变引入ICP0序列中,不产生脱靶效应或对宿主细胞的毒性,且从通过ICP0进行的崩解中救援出抗病毒PML体,支持本模型路径用于研发能消除潜伏性感染的抗HSV-1疗法的允诺。为了测试从宿主细胞去除潜伏性HSV的可行性,使用RNA引导的CRISPR/Cas9基因编辑,以HSV-1基因组的跨越ICP0直接表达区域的DNA序列为靶标而删除该序列,该区域是刺激HSV-1基因表达和复制的关键病毒蛋白。发现,CRISPR/Cas9将InDel突变引入ICP0基因的外显子2中,降低了ICP0刺激允许人细胞培养模型中HSV-1感染性的能力。再者,Cas9与ICP0靶向引导性RNA的共表达保护允许细胞对抗HSV-1感染。Cas9与gRNA2A的留存的共表达防止了HSV-1引导的原单核白血病(promonocyticleukemia)(PML)核体的崩解,对于通过ICP0N端与PML相互作用启动的产生性HSV-1感染,该崩解是关键的细胞内事件。SURVEYOR试验的结果排除了可能已经将突变引入宿主基因中的任何脱靶效应,其中,该宿主基因具有生物信息学上类似但不同于ICP0的DNA序列。另外,未观察到CRISPR/Cas9引导的细胞凋亡或在宿主细胞存活力或细胞循环进展上的不良副作用,支持这HSV-1基因编辑策略的特异性和预期安全性。因此,本文中提出的数据表明,RNA引导的CRISPR/Cas9可用以研发新颖的、特定的且有效的以病毒基因组去除为靶标的治疗性和预防性平台,以治疗HSV-1疾病。现在揭示这些实验中采用的材料和方法。细胞培养令ICP0补充细胞系L7(Samaniegoetal,1997,JVirol,71:4614-4625)在使用10%胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺和400μg/ml遗传霉素(LifeTechnologies,NY)补偿的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)(DMEM)(LifeTechnologies,NY)中生长。令Vero细胞在不具有遗传霉素的相同培养基中生长。将人少突神经胶质瘤细胞细胞系TC620维持在如先前揭示的使用10%FBS补偿的DMEM中(Wolleboetal.,2015,PLoSOne,10,e0136046)。将细胞在嘌呤霉素(Lifetechnologies)的存在下以0.5细胞每孔置于96孔板上,使用适当的载体转染细胞,并使用含有3μg嘌呤霉素的上述培养基选择5天进行筛选。为了产生表达Cas9和gRNA的TC620细胞的克隆性衍生物,使用表达本文中别处揭示的各gRNA的pX260或pX260衍生质粒转染该细胞。使用3μg/ml嘌呤霉素和通过稀释克隆分离的克隆体进行选择。使用Lipofectamine2000(Lifetechnologies)根据厂商实验说明(protocol)实施全部转染。使用生存/死亡细胞存活力试验试剂盒(Molecularprobes,NY),根据厂商实验说明,在使用不同的抗ICP0gRNA转染3天后的Vero细胞或L7细胞上实施细胞存活力试验。抗体下述抗体用于西方印迹分析。鼠α-ICP0(1:1000,SantaCruz,TX)、鼠单克隆[11E2]ICP8(1:1000,Abcam)、鼠单克隆[3G9]α-gC(1:1000,Abcam)、鼠抗-FlagM2(1:1000,SigmaAldrich)、抗-α-微管蛋白克隆B512形(1:5000,SigmaAldrich)。细胞凋亡试验根据制造商的建议实施细胞凋亡试验(GuavaTechnologies)。简而言之,将对照细胞和Cas9稳定表达细胞以200,000个细胞/ml的密度在6孔板中放置48小时。收获细胞前,将每一样品的上清液收集在15ml离心管中,细胞以PBS洗涤并以0.25%胰蛋白酶进行胰蛋白酶化,随后使用上述收集的每一样品的上清液将胰蛋白酶灭活。样品以2000rpm离心5分钟。抽出上清液,固体物质以PBS洗涤一次,再次悬浮细胞并计数,再以PBS稀释至密度为100,000细胞/ml。将100μl的室温AnnexinV-PE染色试剂与100μl的细胞悬浮液混合,并在室温于黑暗中孵化25分钟。使用GuavaEasyCyte微流式细胞仪分析样品。细胞循环分析将对照细胞和cas9稳定表达细胞以150,000细胞/ml的密度在孔板上放置48小时。通过离心收集并收获细胞。固体物质以PBS洗涤一次,再次悬浮于1mlPBS中,并在冰冷乙醇中固定化(最终浓度为70%)。细胞在-20℃培养24小时。离心该细胞,固体物质以含有1%BSA的PBS洗涤一次,使用碘化丙啶(10μg/ml)在含有250μg/mlRNase的PBS中染色,并在37℃于黑暗中孵化45分钟。使用GuavaEasyCyte微系统使用Guavasoft细胞循环成像进行细胞循环分析。存活力试验对于存活力试验,将对照细胞和Cas9稳定表达细胞以12000细胞/200μl的密度以三重复的方式在96孔板上放置24小时。在MTT试验前两小时,移除旧的培养基,替换为新的培养基。使用20μl的MTT溶液(5mg/mlMTT在PBS中的溶液)在37℃处理细胞2小时。2小时后,移除培养基,替换为200μl的MTT溶剂(4mMHCl,0.1%NondetP-40(NP40)在异丙醇中的溶液),将细胞在振荡器上震荡10分钟。在590nm和620nm频道读出MTT活性。HSV-1ICP0gRNA从NCBI数据库获得HSV-1ICP0的基因组序列(NC_0018061),并使用已公开的ICP0蛋白质序列和NCBI数据库确定ICP0外显子2开放阅读框。使用可获得的在线工具(http://crispr.mit.edu/)设计并选择三种gRNA。使用CRISPRCas9脱靶发现工具来确定脱靶序列。基于已公开和被推荐的用于PX458和PX260载体的侧翼序列(分别为Addgene质粒48138和42229),以正反取向设计来自每一靶标序列的一对DNA寡核苷酸。在热循环仪中退火每一对,使用5μl的浓度为100nM的每一寡核苷酸在95℃退火7分钟,在20μl总反应中,在2μlT4DNA连接酶缓冲剂和9μl水的存在下,以3%的速率从95℃匀速降温至25℃。随后,经退火的寡核苷酸对被克隆至BbsI线性化的PX458和PX260载体中。使用定序证实了gRNA的插入。使用PlasmidMidi试剂盒(Qiagen)制备质粒制剂。InDel突变分析通过在L7细胞中的单一感染或共感染实验证实核苷酸在HSV-1ICP0的外显子2中的删除及/或插入。2μg的PX260构造(携带抗嘌呤霉素基因和ICP0gRNA2A或2B)和PX458构造(携带EGFP-Cas9和ICP0gRNA2C,以消除转染效能)共转染过夜。使用空载体转染L7细胞,并将其用作对照。使用倒置荧光显微镜通过检查多个领域并计数GFP阳性细胞vs.总细胞数而评估转染效能。3天后,使用ArchivePureDNA提取试剂盒(5Prime,MD)实施基因组DNA提取。使用Q5HotStartHigh-FidelityDNA聚合物(NEB,MA)和从ICP0序列设计的两种引物实施基因组DNA扩增,以使用下述条件扩增552bp或470bp大小(显示于表1中)的片段:98℃(30s),随后在98℃(10s)、62℃(30s)、72℃(30s)、及随后72℃(5分钟)的35次循环。在3%琼脂糖胶上分析PCR产物。感兴趣的条带经凝胶纯化,并克隆入pCRIIT-A载体(Lifetechnologies)中,通过在Genewiz定序而确定个体克隆体的核苷酸序列。RT-PCR为了确定gRNA2A在L7和TC620稳定细胞系中的表达,实质上如先前所述实施RT-PCR(Shekarabietal.,2008,JClinInvest,118:2496-2505),但使用基于PX260的反向引物(PX260-crRNA-3',表1)作为引物来产生cDNA。为了扩增crRNA,将相同的引物与gRNA2A正向寡核苷酸配对。ICP0558-Ds-Red构造为了产生ICP0558-Ds-Red,两种引物被设计为再每一端具有AgeI限制性位点,并用以使用Q5HotStart(NEB)且使用ICP0-AgeI-F(3086-3103,NC_0018061)和ICP0-AgeI-R(3626-3643,NC_0018061)(显示在表1中)从HSV-1ICP0基因组的外显子2扩增558bp的片段。以AgeI消解pDs-Red-C1和所扩增的片段,并使用T4DNA连接酶(NEB)结扎,导致最终的框架内的Ds-Red蛋白序列。选择之后,将细胞以0.5细胞/孔的密度置于96孔板上,以增加每孔一个细胞种植的概率。随后,当使用Lipofectamine2000以EGFP构造和ICP0558-Ds-Red构造转染细胞时,令该细胞生长为60%至70%的融合。转染48小时后,在倒置荧光显微镜下检查细胞,并选择不具红色信号的孔进行进一步分析。制备基因组DNA,并使用跨越由2A靶标序列组成的372bp片段的P3和P4引物进行PCR扩增(表1)。使用QiaexII凝胶提取试剂盒(Qiagen)对所扩增的片段进行凝胶纯化,并定序以核实InDel序列。表1:引物表2:引物(细胞基因)表3:gRNA的序列引物序列ICP02A5'-TCTGGGTGTTTCCCTGCGACCGAGACCTGC-3'(SEQIDNO:1)ICP02B5'-GCATCCCGTGCATGAAAACCTGG-3'(SEQIDNO:2)ICP02C5’-GCATCCCGTGCATGAAAACC-3’(SEQIDNO:3)ICP02D5’-tgtgcaacgccaagctggtgtacctgatag-3’(SEQIDNO:4)ICP015’-GCGAGTACCCGCCGGCCTGA-3’(SEQIDNO:5)ICP035-GCGAGCCGCGGCGCCGCGGG-3’(SEQIDNO:6)ICP4m15'-TTCTACGCGCGCTATCGCGACGG-3'(SEQIDNO:7)ICP27m15'-GGAGTGTTCCTCGTCGGACGAGG-3'(SEQIDNO:8)免疫细胞化学和西方印迹选取两种L7克隆体,并以6000细胞每孔置于8孔室玻片上。随后,使用5MOI的HSV-1(Patton株)GFP-Us11转染细胞2小时。感染6小时后,以冷评估盐水溶液(HBSS,Invitrogen)快速冲洗细胞,之后使用4%多聚甲醛固定细胞。实质上如别处所述对该细胞进行免疫染色(ShekarabiandKennedy,2002,MolCellNeurosci,19:1-17)。鼠α-ICP0(0.4μg/mL,SantaCruz,TX)和鼠抗PMLC7(2μg/mL,Abcam,MA)抗体用于在4℃免疫染色过夜。使用AlexaFluor555二次抗鼠抗体(分子探针;Invitrogen)(1:1,000)来想象鼠初级抗体。使用0.5μg/mlHoechst33258(Sigma,MO)在PBS中标记细胞核30分钟。使用Imagingwascarriedoutusinga配备用于最佳光束分离的AOBS(声光束分离)的LeicaTCSSP5宽频共聚焦显微镜实施成像。对于蛋白质分析,使用1MOI的HSV-1在感染后的不同时间点感染多个孔内的经瞬时转染的Vero细胞或经嘌呤霉素选择的L7克隆体,使用冷HBSS洗涤两次,使用裂解缓冲液收集蛋白质样品(8M脲、0.5%SDS、200mMβ-巯基乙醇)。来自每一条件下的总蛋白样品(20μg)在8%丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶上跑电泳。将凝胶转移至硝基纤维素膜(LI-CORBiosciences;Lincoln,NE)上,在室温(RT)使用2.5%脱脂奶粉(LabScientific;Highlands,NJ)在PBS-Tween(0.1%,Amresco,OH)中的溶液阻断2小时。膜与鼠α-ICP0、α-ICP8、α-糖蛋白C或α-FLAG表位抗体(1μg/mL)于4℃杂交过夜。使用鼠α-微管蛋白抗体(1μg/mL:Abcam;Cambridge,MA)确定当量载荷。随后,膜与α-鼠第二抗体或α-兔第二抗体(两者均为1:8000,LI-COR)在室温杂交1小时。使用OdysseyCLX(LI-COR)扫描膜。使用ImageStudio2.0版(LI-COR)处理影像。对于TC620细胞的蛋白分析,在含有哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物的TNN缓冲液(sigmaAldrich)中制备全细胞提取物。通过10%SDS-PAGE分离出50μg蛋白质,转移至硝基纤维素。于5%牛奶在1XPBST中的溶液中阻断印迹,并使用第一抗体(1:1000)在室温免疫印迹2小时。洗涤之后,印迹使用第二抗体羊抗鼠(1:5000)LI-cor染料孵化,并使用OdysseyCLx成像系统(LI-COR,INC,Lincoln,NE)和LI-COROdyssey软件可视化。病毒滴度为了检验HSV-1对于gRNA2A克隆细胞的感染效能,首先以1MOI的野生型或ICP0突变HSV-1株(7134,CaiandSchaffer,1992,JVirol,66:2904-2915)在37℃于MEM介质(LifeTechnologies)之感染经模拟转染的L7细胞或G9或H5克隆体2小时。随后,收集含有新生成的病毒颗粒的上清液,并通过使用系列稀释感染正常Vero细胞而确定滴度。24小时或48小时后,将细胞在10%三氯乙酸(Sigma)中固定化10分子,并以0.05%结晶紫(Sigma)染色。计数斑块并绘图。以HSV-1感染TC620细胞感染前一天,使用以10%FBS补偿的DMEM以45,000细胞每孔将TC620细胞置于48孔板内。感染当天,抽出来自前一天放置的TC620细胞的旧培养基,向每孔中加入100μL的稀释的病毒培养基。在37℃孵化2小时后,抽出含有病毒的培养基,再回加新鲜的TC620培养基。最终,将板在37℃保持2天。用于gRNA的慢病毒载体的产生和稳定表达Cas9的TC620细胞的转导为了构建用于两个靶标中每一个的gRNA慢病毒表达质粒,使用引物(5’-tatgggcccacgcgtgagggcctatttcccatgattcc-3’(SEQIDNO:32)和5’-tgtggatcctcgaggcgggccatttaccgtaagttatg-3’(SEQIDNO:33))通过PCR扩增上文揭示的来自两种pX330gRNA质粒中每一种的U6表达组件。使用MluI和BamH1切割PCR产物,随后克隆入已经使用MluI和BamH1切割的pKLV-U6gRNA(BbsI)-PGKpuro2ABFP中。该pCRTM4-TA载体来自LifeTechnologies,Inc.,(Carlsbad,CA)。为了产生用于转导两种gRNA的慢病毒载体,通过与封装质粒pCMV-VSV-G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev一起进行氯化钙沉淀,将如上文所述从pKLV-U6gRNA(BbsI)-PGKpuro2ABFP构建的两种gRNA慢病毒表达质粒衍生物各自转染入293T细胞内。48小时后,从上清液收获慢病毒,通过离心清除,通过0.45μm过滤器,在6μg/ml聚凝胺的存在下加至稳定表达Cas9的TC620细胞,再进行选择。48小时后,收获细胞,通过西方印迹分析ICP0表达并通过斑块试验分析病毒滴度。SURVEYOR试验使用SURVEYOR突变检测试剂盒(Transgenomic),根据制造商实验说明,检查源自稳定表达Cas9并通过用于gRNA的慢病毒载体转导的TC620细胞的脱靶基因的PCR产物中突变的存在。将异质PCR产物在95℃变性10,随后通过逐步冷却使用热循环仪杂交。使用0.25μl的SURVEYOR核酸酶加上0.25μlSURVEYOR增强子S和15mMMgCl2将300ng的杂交DNA(9μl)在42℃消解4小时,该核酸酶是用来扫描异源双链DNA中的突变的错配特异性DNA内切酶。加入停止溶液,将样品与等量的对照样品在2%一起在琼脂糖胶上解析,该对照样品经平行处理且源自稳定表达Cas9但未经用于gRNA的慢病毒载体转导的TC620细胞。现在揭示实验结果。gRNA在Vero细胞中的靶向、构建和测试HSV-1基因组的生物信息学筛选鉴定了ICP0基因的外显子II中的三个特定区域,跨越核苷酸(nt)序列1011至1040(2A)、1127至1156(2B)和1136至1375(2C),用于创建用于通过CRISPR/Cas9编辑的引导性RNA(gRNA)(图7A)。首先在表达载体PX260中独立克隆对应于每一基序的小DNA片段(Congetal.,2013,Science,339:819-823),通过PCR扩增和Sanger定于评估当该片段以单一形式表达时的诱发InDel突变的能力,或当该片段合用时切除跨越裂解位点之间的DNA片段的能力。最初,使用ICP0补充L7细胞系(Samaniegoetal,1997,JVirol,71:4614-4625),本文中称为L7,其含有ICP0基因的完整副本。当使用HSV-1感染该细胞用于以Cas9连同gRNA2A表达质粒和gRNA2C表达质粒一起进行转染时,该细胞表达低水平的所编码蛋白。除了所预想的552bp扩增子之外,在表达gRNA2A和2C两者的细胞中还检测到了217bp的较小DNA片段(图7B)。通过Sanger定序证实了跨越2A位点与2C位点之间的335bpDNA片段的切除,且使用通过将外显子II的剩余DNA再接合而创建的模板证实了较小(217bp)DNA片段的扩增。在克隆细胞系中的进一步分析显示,在小群体的细胞(8%)中,217bp片段的移除伴随有单一A或G核苷酸在裂解位点和再接合位点的插入(图11A)。同样,gRNA2B和2C的多重表达造成了2B与2C之间219bpDNA片段的切除和251bpDNA片段的扩增(图11B)。在单一gRNA表达构型中,通过基于Cel1核酸酶的异源双链特异性SURVEYOR试验检测到,对gRNA2A的表达产生了若干InDel突变(图11C)。通过若干克隆细胞的DNA定序而对InDel突变的表征透露了单个或多个核苷酸的插入,以及大的191bpDNA克隆体插入至邻近裂解位点处(图7D和图7E)。如标注,这些突变各自造成了ICP0DNA编码序列的移码(图7E)。将ICP0在对照L7细胞中的表达与在使用隐匿GFP基因的HSV-1感染后的克隆体InDel3中的表达比较。如图7F(下图)所示,使用HSV-1/GFP感染对照细胞诱发了ICP0在存在新复制病毒处的细胞核积累。与此相反,Cas9/gRNA2A防止了可检测的ICP0出现在被感染细胞的细胞核内,表明被引入ICP0的外显子II中的移码突变完全阻断了该蛋白质的表达及其亚细胞定位(图7F,上图)。ICP0(红色)被共定位在细胞质区域内,暗示Cas9/gRNA也已经造成所输入的HSV-1DNA中的InDel突变,因此从引入的病毒中根除了ICP0的表达。通过将这些克隆体(InDel2和InDel3)中ΔICP0HSV-1的复制水平与表达野生型蛋白质的对照细胞中所见相比较,评估这些突变对ICP0刺激HSV-1复制的能力的冲击。在使用ΔICP0HSV-1感染细胞48小时后,收集每一被感染的细胞培养物的上清液,通过斑块试验确定病毒滴度。克隆体InDel2和InDel3显示支持ΔICP0HSV-1复制的能力的标示下降(分别为58.9%和80%),表明ICP0在L7细胞中的Cas9/gRNA2A介导的功能性活化(图7G)。根本通过RT-PCR和西方印迹分析证实gRNA和Cas9的产生(图12)。Cas9/gRNA对于PML核体结构的冲击前髓细胞性白血病(PML)核体是位于多种控制细胞生长和变形的真核细胞的细胞核内的点状结构(Sahinetal.,2014,JPathol,234:289-291),还抑制多种病毒包括HSV-1对细胞的感染(Wangetal.,2012,ProteinCell,3:372-382)。通过崩解PML结构,具有HSV-1的ICP0经由其N端与PML的相互作用明显压制PML介导的抗病毒活性(Cuchet-Lourencoetal.,2012,JVirol,86:11209-11222;Everettetal,2006,JVirol,80:7995-8005)。通过荧光显微镜证实,PML相关的核体孔状结构存在于未感染HSV-1的仅表达Cas9的L7细胞的细胞核内(图8),而使用HSV-1/GFP感染这些细胞则完全改变了PML孔状结构,该改变与HSV-1定位一致。与之相比,Cas9及gRNA两者在被感染的L7细胞中的共表达将类PML控状结构恢复至类似于在未感染细胞中所见到的模样。也在细胞质中检测到了低水平的GFP,可能代表了病毒基因组在其产生性感染循环不存在下编码的GFP的表达(图8)。这观察结果暗示,Cas9/gRNA诱发的ICP0的突变干扰其中断PML体的康丙酮活性。Cas9/gRNA的表达压制人细胞系的HSV-1感染寻找一种便于在其内进一步探索现有CRISPR/Cas9系统的抗HSV-1活性的人类细胞系,发现,人少突神经胶质瘤细胞细胞系TC620(MerrillandMatsushima,1988,JBiolRegulHomeostAgents,2:77-86)强有力地支持HSV-1以低感染复数和高感染复数复制,如通过ICP0的表达所证实的,早期病毒蛋白ICP8牵涉入病毒DNA复制和晚期基因反式激活中(Challberg1986,ProcNatlAcadSciUSA,83:9094-9098;GaoandKnipe,1991,JVirol65,2666-2675;TanguyLeGacetal.,1998,JBiolChem,273:13801-13807),而晚期薄膜蛋白,即糖蛋白C,增强该病毒的感染性(Friedmanetal.1984,Nature,309:633-635)(图13A至图13D)。创建若干稳定地表达Cas9或Cas9加上gRNA2A的克隆TC620亚细胞系。使用这些亚细胞系来测试Cas9/gRNA2A压制HSV-1感染的能力。产生Cas9及gRNA两者的克隆系6和10显示了ICP0生成水平的实质性下降,见于西方印迹;而仅表达Cas9的细胞并未显示在ICP0产生水平上的任何效果(图9A)。使用对于HSV-1/GFP的荧光显微镜证实,Cas9/gRNA2A表达压制了TC620细胞的HSV-1感染。在HSV-1感染后,从仅表达Cas9的对照细胞及克隆体6和10收集上清液,并使用斑块试验将其以1/10和1/100稀释与Vero细胞比较(图9C)。发现,Cas9/gRNA2A以1/10稀释分别将克隆体6和10中的斑块形成压制了85%和72%,且当以1/100稀释时,该数值分别为95%和90%(图9C和图9D)。以更高倍稀释时增强的压制与先前发现的ICP0的抑制效果在较低MOI感染时更显着相一致(ChenandSilverstein,1992,JVirol,66:2916-2927)。这些数据表明,在未感染的细胞中,通过抑制ICP0产生,Cas9/gRNA2A保护细胞不被HSV-1感染,因此,其压制宿主抗病毒防御而有助于裂解性感染。也评估了Cas9/gRNA2A对于若干细胞健康状态指数的潜在效果。Cas9无论单独表达或与gRNA2A一起表达,在TC620细胞的细胞循环进展上均无显着效果(图14A)。同样,使用膜联蛋白对细胞进行免疫荧光染色指出,Cas9或Cas9/gRNA2A对于细胞凋亡并无重要冲击(图14B)。据此,观察到该基因编辑系统对于细胞存活力没有负面影响(图14C)。使用SURVEYOR试验来评估gRNA2A的特异性,并确定该基因编辑策略是否诱发任何脱靶效应或危害宿主基因组整体性。通过使用对应于HSV-1的2A序列的较短(13nt)种子序列的生物信息学筛选证实,结果未显示InDel突变在若干代表性人类基因中任何潜在外显子脱靶位点中的证据(图15,也见表4)。再者,如上文所见,来自潜在细胞脱靶基因的基因扩增及之后的DNA定序结果证实,以HSV-1为目标的基因编辑系统不产生脱靶效应(图15B)。慢病毒介导的Cas9和gRNA输送压制HSV-1感染并保护细胞不被感染为了进一步改善输送效率并评估所揭示的基因编辑分子的抗HSV-1活性,使用HSV-1感染表达Cas9的TC62细胞,36小时后,使用以单链或双链构型表达gRNA2A或2B的慢病毒(LV)转染被HSV-1感染的细胞中。结果显示,ICP0、ICP8、及晚期糖蛋白C的表达被显着压制(图10A),表明有慢病毒带入的gRNA压制了表达Cas9的细胞内HSV-1蛋白质的产生。使用LVgRNA2A和LVgRNA2B处理细胞,大幅度地压制了被感染细胞中的病毒产生(分别压制97%和82%),如通过感染性病毒在培养物上清液中的斑块试验所测量的(图10B和图10C)。贯穿这些研究,注意到,在编辑ICP0基因及压制HSV-1复制中,gRNA2A比gRNA2B的效率略高。为了评估Cas9和gRNAs2A、2B或两者在保护细胞不被HSV-1感染的能力,使用表达Cas9的慢病毒(LVCas9)与表达gRNA2A、2B或两者的慢病毒(LVgRNA)转化转染正常的TC260细胞。发现,通过来自荧光显微镜的结果证实,LVCas9/LVgRNA2A显着降低了病毒蛋白表达(图10D),显示对GFP染色细胞的极大压制(图10E),以及如通过斑块试验评估的病毒丰度的剧烈下降(图10F)。ICP4和ICP27是另外两种最早期(IE)调节蛋白,分别对病毒基因转录从IE至早期的转变、以及调节性病毒和细胞mRNA处理事件及后期基因的活化负主要责任(Knipeetal.,2008,NatureRev.,6:211-221)。在下一系列实验中,在进行ICP4基因和ICP27基因的生物信息学筛选后,选择未预报脱靶效应的gRNA,并评估这些gRNA协作压制TC260的HSV-1感染的能力。如图16所示,慢病毒介导的ICP0gRNA2A和ICP4gRNAm1、或ICP0gRNA2A和ICP27gRNAm1的输送,完全废除了TC260细胞的HSV-1感染。有趣的是,在对这些细胞进行联合处理时,未检测到在经ICP0gRNA处理的细胞中频繁可见的残留的被感染细胞(将图16D和图16E与图16C比较)。表4:预计的ICP0gRNA及其脱靶数目(100%匹配)以ICP0为靶向以永久压制HSV-1感染的CRISPR/Cas9系统用以压制HSV-1复制的当前疗法包括以病毒胸苷激酶(TK)为靶标的核苷酸类似物,包括阿昔洛韦及其衍生物。这些药剂有助于控制HSV-1初次感染的症状,但并不消除潜伏性HSV-1感染。再者,由于TK基因中的突变,具有TK抑制剂抗药性的HSV-1株的发展,在治疗HSV-1相关疾病的治疗中仍存在临床医学挑战。本文中提出的实验测试了CRISPR/Cas9系统通过改变作为最早期感染循环肇因的病毒基因而永久压制HSV-1感染的能力。由于ICP0控制HSV-1潜伏与复制间的平衡并在阻断包括PML核体的若干细胞介导的抗病毒活性中扮演重要角色,故将其选作编辑的靶标(Cheeetal.,2003,JVirol77:7101-7105)。此外,HSV-1的ICP0对于有干扰素α和β造成的抑制高度敏感,且引出对抗野生型HSV-1的强烈的免疫反应(Halfordetal,2006,VirolJ,3:44)。因此,废除ICP0表达可间接打断HSV-1新感染的复制。这些发现指明,使用CRISPR/Cas9以ICP0基因为靶标诱发了ICP0的外显子II中的多个InDel突变,中止了内源性抗病毒PML组件的瓦解,且完全废除了被感染细胞内的病毒生命循环。本文中设计并提出的用于被CRISPR/Cas9作为靶标的ICP0基因的三种gRNA中,gRNA2A在单一构型中显示最大潜能,以通过引入导致在ICP0开放阅读框中产生移码的InDel突变而危害ICP0基因组的外显子II的结构。外显子II中的这突变也干扰了ICP0与PML的相互作用以及核体的形成。因此,Cas9/gRNA2A通过抑制多个HSV-1基因表达而发挥其抗病毒活性,其中,该表达产物是感染循环及中止源于宿主的抗病毒事件所需的,包括PML体的组件。病毒感染过程中,Cas9和gRNA的慢病毒介导的输送显着降低了被感染细胞所产生的病毒负载。本文中提出的使用ICP0gRNA加上ICP4gRNA或ICP27gRNA的联合实验的结果显示,被感染细胞中的HSV1复制被完全消除。这观察结果暗示,在潜伏期和产生期消除HSV-1,可能需要编辑多种病毒基因,鉴于该CRISPR/Cas9策略的简单性和灵活性,这途径是可实现的。该组合策略还减轻了与一次击中(onehit)的修复或可能的重组相关的问题,应使用基于HSV的输送系统。还发现,当通过慢病毒将gRNA引入细胞内时,该细胞内Cas9在感染之前的表达压制了HSV-1复制,暗示Cas9策略可用来保护细胞对抗HSV感染。在这方面,可预想研发一种新颖的治疗策略,该策略中,Cas9基因仅通过HSV-1最早期蛋白如ICP4而被活化,因此令Cas9在不存在HSV-1时保持沉默且仅当病毒开始进入感染的裂解期时被再活化。将基于Cas9/CRISPR的病毒靶向转化为人类临床疗法的前景,不仅取决于有效输送系统的发展,而且取决于其特异性。作为在体外HSV靶向系统中评估这关键问题的第一步,调查其在关键细胞功能、细胞健康指数、及潜在基因组靶标上的效果。发现,Cas9/gRNA系统缺乏对于细胞存活力及包括细胞循环的多种过程的负面效应,并不诱发细胞凋亡,且并不危及细胞存活力。为了实现这水平的安全性、避免对于人转译基因组位点的影响以及排除DNA基序的任何转录,采用基于最严格的12bp加上PAM靶标选择准则的生物信息学筛选。最有效的gRNA(2A)是30nt长度加上NGG。通过使用对应于靶标AofICP0外显子II的较短(12nt)种子序列的生物信息学筛选证实,没有证据显示在一系列5种代表性脱靶宿主基因的任一者中存在InDel突变。这些结果也显示,CRISPR/Cas9系统可经精炼并用于保护细胞不被HSV-1感染。Cas9加上gRNAs2A在强有力地支持HSV-1复制的人细胞内的预先存在,防止了引入的HSV-1的有效复制。这观察结果令人联想到一种策略,通过该策略,原核细胞保护其自身不受外来DNA要素如转位因子和噬菌体所害(HorvathandBarrangou,2010,Science,327:167-170)。考虑到CRISPR/Cas9基因编辑系统的灵活性和快速性以及HSV-1裂解性感染循环的复杂性,可研发一种联合疗法,该联合疗法包括以牵涉入HSV-1感染的最早期、早期和晚期调控的重要病毒蛋白为靶标的gRNA混合物。对于输送Cas9/gRNA,存在若干可使用的基于病毒的系统,包括慢病毒、AAV、修饰的HSV-1载体。也可使用非病毒输送系统,包括纳米颗粒和细胞外囊泡。此外,可通过多种引导型表达系统调节Cas9的表达,以控制Cas9表达并加快Cas9周转,这有助于限制脱靶效应。本文中记录的数据表明,本发明的以ICP0为靶标的Cas9/gRNA编辑系统以高度特异性将突变引入HSV-1的这最早期基因中,延缓HSV-1裂解性感染循环,并保护未感染的细胞不被HSV-1感染。结果显示,通过这基因编辑策略将单个核苷酸错配引入ICP0编码序列中,对于阻断病毒复制是高度有效的。因此,这些研究表明,可将CRISPR/Cas9发展为新的用于治疗HSV-1感染的工具,以及用于从潜伏性感染的细胞消除HSV-1DNA的潜在的永久性策略。本文中引用的各及每一专利、专利申请案、及出版物通过引用而以其整体并入本文。尽管本发明已经参照具体实施例予以揭露,但显然,该领域技术人员可设计本发明的其它具体实施例和变更而不悖离本发明的精神和范畴。倾向于将所附权利要求书解释为包括全部这些具体实施例和等效变更。序列表<110>天普大学-联邦高等教育系统(TEMPLEUNIVERSITY-OFTHECOMMONWEALTHSYSTEMOFHIGHEREDUCATION)帕梅拉·C·勒姆(Roehm,PamelaC)卡迈勒·哈利利(Khalili,Kamel)赛义德·马苏德·谢卡拉比(Shekarabi,SeyedMasoud)哈桑·威尔伯(Wollebo,Hassen)<120>RNA引导的I型单纯性疱疹病毒和其它相关的人疱疹病毒的根治<130>206017-0041-00-WO.605043<150>US62/103,354<151>2015-01-14<150>US62/238,288<151>2015-10-07<160>56<170>PatentIn3.5版<210>1<211>30<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>1tctgggtgtttccctgcgaccgagacctgc30<210>2<211>31<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>2ggacagcacggacacggaactgttcgagacg31<210>3<211>20<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>3gcatcccgtgcatgaaaacc20<210>4<211>30<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>4tgtgcaacgccaagctggtgtacctgatag30<210>5<211>20<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>5gcgagtacccgccggcctga20<210>6<211>20<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>6gcgagccgcggcgccgcggg20<210>7<211>20<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>7ttctacgcgcgctatcgcga20<210>8<211>20<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>8ggagtgttcctcgtcggacg20<210>9<211>33<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>9tctgggtgtttccctgcgaccgagacctgccgg33<210>10<211>34<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>10ggacagcacggacacggaactgttcgagacgggg34<210>11<211>23<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>11gcatcccgtgcatgaaaacctgg23<210>12<211>33<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>12tgtgcaacgccaagctggtgtacctgatagtgg33<210>13<211>23<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>13gcgagtacccgccggcctgaggg23<210>14<211>23<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>14gcgagccgcggcgccgcgggggg23<210>15<211>23<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>15ttctacgcgcgctatcgcgacgg23<210>16<211>23<212>DNA<213>单纯性疱疹病毒<400>16ggagtgttcctcgtcggacgagg23<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>17gatgtctgggtgtttccct19<210>18<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>18cacgatcgggatggtgctgaacgacc26<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>19tgctgattgacgcgggaaatc21<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>20cgatctcatccgtgcacacg20<210>21<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>21ccatccacgccctgcggccccagc24<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>22cacgtctgtgggtgttcaga20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>23aaagctcctagggctgttgg20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>24ggaaccccctcgctttcttt20<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>化学合成<400>25cgtatgtgtcccatcggcat20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220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