用以治疗移植排斥的分子构建体的制作方法

本揭示内容是关于药学领域；更明确地说，是关于多功能的分子构建体，譬如具有标的组件与效应组件以将效应组件(如治疗药物)递送至标的部位的分子构建体。

2.

背景技术：

近年来，本领域发展出多种筛检与选择以抗原为标的之单株抗体(monoclonal antibodies，mAbs)的方法，进而带动许多治疗用抗体的研发，替一些不久前还被认为是不治之症的疾病带来曙光。根据治疗性抗体数据库(Therapeutic Antibody Database)的统计，有多达2,800种左右的抗体已经或即将投入人体临床试验，而经政府药物管理机构核准可用于临床治疗的抗体则约有80种。从与抗体疗效相关的大量数据可以得知抗体是基于何种药理机制而发其挥疗效。

以抗体作为治疗药剂时，其主要的药理机制是利用抗体来中和或诱捕造成疾病的介质；所述介质可能是存在于血液循环、间质空间(interstitial space)或淋巴结中的细胞介素或免疫成分。中和所述介质的活性可抑制造成疾病的介质和其受体之间的互动。此外，可将细胞介素的可溶性受体或受体的细胞外部分和免疫球蛋白IgG的Fc部分制成融合蛋白，此种融合蛋白可利用类似中和抗体的机制来中和上述细胞介素或免疫因子；因此目前也开发出多种融合蛋白治疗剂。

另外，某些取得临床使用许可或正在进行临床研究的治疗性抗体则是采用了与上述主要抗体机制不同的机制，来发挥其药理作用，譬如可藉由和受体结合以阻断这些受体和其配体之间的互动。对此类抗体药物来说，其主要的药理机制并非由Fc-介导的机制(如抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或是补体介导的细胞溶解(complement-mediated cytolysis，CMC)等)。

另一些治疗性抗体可和目标细胞上的某些表面抗原结合，并藉此在目标细胞上发挥Fc介导的功能以及其他机制。最重要的Fc介导的机制为抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导的细胞溶解(CMC)，这两种机制都会将与抗体结合的目标细胞溶解。这些抗体和特定的细胞表面抗原结合后，可使得与其结合的目标细胞发生细胞凋亡。

制备具有双重专一性的抗体的概念与方法，早在三十年前就已萌芽。近年来，随着重组抗体工程方法的进步、以及对于更好药物的需求驱使下，发展出多种具有不同结构构形的双专一性抗体。

举例来说，双价或多价抗体可能带有二或更多种抗原结合位。已知有多种方法可用以制备多价抗体，这些方法通常利用连接结构将三或四种抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)共价连接在一起。举例来说，已透过重组工程制备出能表现三或四个串联(tandem)的Fab重复片段的抗体。

此外，利用合成的交联物(crosslinker)，透过化学方法将不同的抗体或结合部位连接在一起，以制造出多价抗体的方法也是本领域公知的技术。其中一种方式是利用不同的接合物(linker)，将三、四或更多个分离的Fab片段，透过化学交联的方式彼此接合。另一种方式是先制备一个具有多个Fab的构建体，将这些Fab组装成一维的DNA支架(one-dimensional DNA scaffold)。这些经设计可和目标分子结合的各种多价抗体构建体彼此的尺寸、半衰期、构形弹性以及调节免疫系统的能力各不相同。基于以上说明，已有部分研究着眼于制备效应组件数目固定的分子构建体或具有二或更多种不同功能性组件(譬如至少一标的组件与至少一效应组件)的分子构建体。然而，通常很难利用化学合成或重组技术等方法，来建立具有特定标的与效应组件组合的分子构建体。因此，本领域亟需一种新颖的分子平台，其可用以建构适用于多种疾病的各种分子。

技术实现要素：

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

<I>用以治疗移植排斥反应移植排斥反应含胜肽核的多臂接合物及其用途

本揭示内容的第一种态样是关于一种用以治疗移植排斥反应的接合单元及其用途。具体来说，所述接合单元上连接了至少两种不同的功能性组件。举例来说，所述接合单元可连接有：两种不同的效应组件、一种标的组件与一种效应组件、或一种效应组件与可延长接合单元生命周期的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链。本发明接合单元经设计成带有至少两种不同的官能基，使得这些功能性组件能够和各别的官能基反应而与接合单元相连接。因此，本发明接合单元可作为用以制备带有二或更多种功能性组件的分子构建体的平台。当可想见，运用此种接合单元来治疗移植患者的方法亦属于本揭示内容之一态样。

根据本揭示内容多种实施方式所，述接合单元包含一中心核、复数个连接臂、复数个第一组件以及视需要而采用的一耦合臂与一第二组件。

根据本揭示内容多种实施方式，所述中心核可以是多肽核，在接上连接臂之前，多肽核具有预定数目的氨基(-NH2)。举例来说，多肽核可包含2或更多个在侧链上带有氨基的赖氨酸(lysine，K)残基。

在某些实施方式中，多肽核可包含2至15个K残基，以及一或更多个填充序列，其中每一个K残基和次一个K残基之间由一填充序列所隔开。每一填充序列包含甘氨酸(glycine，G)与丝氨酸(serine，S)残基。在视需要而实施的实施方式中，填充序列是由2至20个氨基酸残基所组成。于多种实施方式中，填充序列可具有任一种以下序列：GS、GGS、GSG或SEQ ID NO:1-16所示序列。在本揭示内容某些实施方式中，多肽核中至少一填充序列和该多肽核中其他填充序列不同。根据本揭示内容某些实施方式，多肽核包含2至15个单元的G1-5SK序列；在较佳的情形中，多肽核的序列为(GSK)2-15。

根据其他实施方式，所述多肽核的序列为(Xaa-K)n，其中Xaa是具有2至12个乙二醇(ethylene glycol，EG)重复单元的聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)，且n为2至15的整数。

每一连接臂藉由和中心核的氨基形成酰胺键，而连接于中心核的氨基。当可想见，当使用多肽核时，连接臂是藉由和K残基侧链的氨基反应而连接至中心核。此外，连接臂的自由端有一顺丁烯二酰亚胺基(maleimide group)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基、叠氮基(azide group)、炔基(alkyne group)、四嗪基(tetrazine group)、环辛烯基(cyclooctene group)或环辛炔基(cyclooctyne group)。

另一方面，在多肽核中，，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基有一叠氮基或炔基；或者是或额外地，令位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸(C)残基。

根据本揭示内容某些实施方式，当中心核为多肽核，且带有一末端，且有一末端半胱氨酸残基时，此处提出的接合单元包括上文所述的耦合臂。对于末段有半胱氨酸残基的多肽核，耦合臂的一端是透过与此半胱氨酸残基的硫氢基反应而与其连接。

带有叠氮基的氨基酸残基实例包括：L-叠氮高丙氨酸(azidohomoalanine，AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸(4-azido-L-phenylalanine)、4-叠氮-D-苯丙氨酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-叠氮-L-丙氨酸(3-azido-L-alanine)、3-叠氮-D-丙氨酸(3-azido-D-alanine)、4-叠氮-L-高丙氨酸(4-azido-L-homoalanine)、4-叠氮-D-高丙氨酸(4-azido-D-homoalanine)、5-叠氮-L-鸟氨酸(5-azido-L-ornithine)、5-叠氮-D-鸟氨酸(5-azido-D-ornithine)、6-叠氮-L-赖氨酸(6-azido-L-lysine)以及6-叠氮-D-赖氨酸(6-azido-D-lysine)。例示性的带有炔基氨基酸残基包括：L-高炔丙基甘氨酸(L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-homopropargylglycine，D-HPG)以及β-高炔丙基甘氨酸(beta-homopropargylglycine、β-HPG)。

当位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基时，位于耦合臂自由端的环辛烯基可以是反式-环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基，而位于耦合臂自由端的环辛炔基则可以是二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化环辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)或二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基。另一方面，位于耦合臂自由端的四嗪基包括，但不限于：1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基，以及其衍生物，譬如6-甲基四嗪基。

在某些实施方式中，所述连接臂为PEG链，较佳具有2至20个EG重复单元。在其他实施方式中，所述耦合臂连接臂为PEG链，较佳具有2至12个EG重复单元。

根据本揭示内容多种视需要而实施的实施方式，第一组件是可在个体体内发挥欲求效果(如，治疗效果)的效应组件。或者是，第一组件是能够将接合单元导引至目标部位的标的组件。在较佳实施方式中，当第一组件是效应组件时，第二组件是标的组件，反之亦然。

具体来说，根据本揭示内容多种实施方式的标的组件可以是对仅存在于供体移植物(donor transplant)细胞上但不存在于受体细胞上的人类白血球抗原(human leukocyte antigen，简称HLA)异型专一的抗体片段，譬如HLA-A、HLA-B与HLA-C异型。此外，效应组件是免疫抑制物、免疫检查点蛋白或对CD25专一的抗体片段。例式性的免疫抑制物包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，简称mTOR)抑制物，如西罗莫司(sirolimus)与依维莫司(everolimus)。另一类免疫抑制物为钙调磷酸酶(calcineurin)抑制物,如他克莫司(tacrolimus)。芬戈莫德(fingolimod)及其衍生物(如，芬戈莫德磷酸盐)也是一种适当的免疫抑制物。免疫检查点蛋白系指与免疫检查点有关的蛋白，譬如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，简称CTLA-4，亦称为CD151)的胞外域以及程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1，简称PD-L1，亦称为CD274)的胞外域。

于某些实施方式中，藉由在连接臂和第一组件之间形成酰胺键，而将每一第一组件连接至连接臂。在其他实施方式中，透过发生在连接臂与第一组件之间的硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应、铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)、应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反应或逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反应，而将每一第一组件连接至连接臂。

根据本揭示内容某些实施方式，当该些第一组件是透过CuAAC或SPAAC反应而分别连接至该些连接臂时，则位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端是四嗪基或环辛烯基。根据本揭示内容其他实施方式，当该些第一组件是透过iEDDA反应而分别连接至该些连接臂时，则位于中心核N-或C-端的氨基酸残基有该叠氮基或炔基；或位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端为叠氮基、炔基或环辛炔基。

在某些实施方式中，第二组件带有叠氮基或炔基，使得其可和中心核或耦合臂的对应炔基或叠氮基进行CuAAC反应，进而与中心核或耦合臂耦接。或者是，在其他实施方式中，第二组件带有叠氮基或环辛炔基，使得其可和中心核或耦合臂的对应环辛炔基或叠氮基进行SPAAC反应，进而与中心核或耦合臂耦接。又或者是，于一些实施方式中，第二组件带有四嗪基或环辛烯基，而使得其可和中心核或耦合臂的对应环辛烯基或四嗪基进行iEDDA反应，进而与中心核或耦合臂耦接。

于一些实施方式中，所述接合单元更包含视需要而加入的第三组件，此种第三组件和第一、第二组件不同。在第二组件直接与中心核连接的情形中，所述中心核的另一端(即，未与第二组件连接的自由端)可视需要而为半胱氨酸残基，此一残基可用以引入非必要的第三组件。具体来说，半胱氨酸残基的硫氢基可和一PEG链上的顺丁烯二酰亚胺基反应，而此一与中心核连接的PEG链在此称为“耦合臂”；上述耦合臂的自由端带有四嗪基或环辛烯基。如此一来，第三组件即可透过iEDDA反应而与耦合臂连接。在较佳的情形中，第三组件是能够改善接合单元药动学性质的组件。分子量为20,000至50,000道耳顿(daltons)的长PEG链就是一种能改善接合单元药动学性质的组件。

在临床医学领域中，根据本揭示内容此一态样的接合单元可用于治疗移植排斥。因此，本揭示内容亦有关于抑制接受一供体移植物(器官、组织或细胞)的个体体内移植排斥的方法或用以制备可供上述方法使用的药物之用途。根据本揭示内容多种实施方式，用以治疗一特定个体移植排斥的方法包含以下步骤：对有需要的个体投予治疗有效量的接合单元，所述接合单元可以是根据本揭示内容上述态样与实施方式的任一种接合单元。当可理解，可将所述接合单元以药学配方的形式施用，此种药学配方除了包含本发明接合单元外，还包含适用于所欲给药方式的药学上可接受的赋型剂。

<II>用以治疗移植排斥反应的Fc型分子构建体及其用途

本揭示内容的此一态样是关于以可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)为基础的分子构建体(下文称为Fc型分子构建体)，其具有直接或间接连接到免疫球蛋白CH2-CH3区域的至少一标的组件与至少一效应组件。藉由审慎选择所述Fc型分子构建体的标的与效应组件，所得到的Fc型分子构建体可用以抑制接受器官、组织或细胞移植的个体(或接受者)体内的移植排斥，或可用以制备用于上述用途的药物。当可想见，利用此种Fc型分子构建体来治疗移植排斥的方法亦属于本揭示内容的一种态样。

根据本揭示内容某些实施方式，Fc型分子构建体包含一对IgG.Fc的CH2-CH3区段、一对效应组件及一对标的组件。

根据本揭示内容多种实施方式，成对的标的组件是对仅存在于供体移植物(donor transplant)细胞上但不存在于受体细胞上的人类白血球抗原(human leukocyte antigen，简称HLA)异型专一的抗体片段，譬如HLA-A、HLA-B与HLA-C异型。此外，成对的效应组件是免疫检查点蛋白、对CD25专一的抗体片段或包含免疫抑制物的载药束。免疫检查点蛋白系指与免疫检查点有关的蛋白，譬如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T lymphocyte associated protein 4，简称CTLA-4，亦称为CD151)的胞外域以及程序性死亡配体1(programmed death-ligand 1，简称PD-L1，亦称为CD274)的胞外域。例式性的免疫抑制物包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，简称mTOR)抑制物，如西罗莫司(sirolimus)与依维莫司(everolimus)。另一类免疫抑制物为钙调磷酸酶(calcineurin)抑制物,如他克莫司(tacrolimus)。芬戈莫德(fingolimod)及其衍生物(如，芬戈莫德磷酸盐)也是一种适当的免疫抑制物。

当成对效应组件是免疫检查点蛋白时，此一成对的效应组件连接于成对CH2-CH3区段的N-端，而成对的标的组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然。或者是，当成对的效应组件是载药束时，则成对的效应组件连接于成对CH2-CH3区段的C-端，而成对的标的组件则连接到成对CH2-CH3区段的N-端。又或者是，当效应组件是抗体片段时，成对的效应组件则分别连接于成对CH2-CH3区段的N-端，而标的组件则分别连接到于成对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然。

根据某些实施方式，当成对的效应组件与成对的标的组件都是单链可变片段(single-chain variable fragments，简称scFvs)时，则成对的标的组件可以用串联(tandem)或双抗体(diabody)的形式连接到成对效应组件的N-端，进而形成连接在成对CH2-CH3区段N-端的双专一性scFv。

在某些例子中，成对的标的组件形成抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)的构形(即，由VH-CH1区域以及VL-Cκ区域所组成)；此种Fab片段连接于第一与第二重链的N-端，而使得Fc型分子构建体形成IgG构形。在这些情形中，成对的效应组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端。

根据本揭示内容某些实施方式，当成对效应组件形成抗原结合片段(Fab)的构形，且成对的标的组件为scFvs时(反之亦然)，所述Fab与scFvs分别连接于CH2-CH3区段的N-端与C-端，而使得所述分子构建体形成延伸型IgG构形。

于一些实施方式中，该对CH2-CH3区段衍生自人类IgG重链γ4或人类IgG重链γ1。

根据某些视需要而实施的实施方式，效应组件为以接合单元为基础的载药束。此种载药束的优点在于可在将载药束和抗体分子耦接之前先单独制备此种载药束，因而能够避免在严苛的化学条件下将药物分子直接与抗体分子接合的问题。根据本揭示内容的多种实施方式，载药束包括复数个免疫抑制物分子。作为例示而非限制，这些Fc-型分子构建体可用于治疗移植排斥。

根据某些实施方式，此处提出的Fc-型分子构建体更包含一多肽延伸段及一耦合臂。具体来说，多肽延伸段的序列为(G2-4S)2-8C，且连接于成对CH2-CH3区段其中之一的C-端。在这种情形中，耦合臂透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于多肽延伸段的C-端。此外，在和载药束耦接之前，耦合臂的自由端(即，未连接于多肽延伸段的半胱氨酸残基的一端)经修饰带有炔基、叠氮基、高应力炔基或四嗪基，而使得载药束可透过逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反应、应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反应或铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反应而与耦合臂耦接。

根据某些视需要而采用的实施方式，载药束是根据本揭示内容第一态样与相关实施方式的接合单元式分子构建体。根据某些视需要而实施的实施方式，所述载药束包含一中心核、复数个连接臂。

简言之，根据本揭示内容多种实施方式，中心核可以是包含复数个赖氨酸(K)残基的多肽核。每一连接臂的一端藉由和多肽核K残基侧链的氨基反应，而与中心核连接。此外，上述连接臂在其自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，而每一药物分子(譬如免疫抑制物分子)则藉由和顺丁烯二酰亚胺基反应，进而透过第一连接臂而与中心核连接。

在中心核是多肽核的情形中，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基。

当多肽中心核的末端氨基酸残基带有叠氮基或炔基时，载药束可以透过发生于上述末端残基与耦合臂C-端之间的CuAAC反应而和耦合臂连接。

用以对有需要的个体抑制移植排斥的方法包含以下步骤：对所述个体投予有效量的本态样之分子构建体。

【附图说明】

为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，兹将所附图式简单说明如下。

第1A图至第1K图为根据本揭示内容某些实施方式的接合单元的示意图。

第2A图至2C为根据本揭示内容多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。

第3图为根据本揭示内容多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。

第4A至4C图为根据本揭示内容多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。

第5A与5B图为根据本揭示内容多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。

第6A图与第6B图分别显示根据本揭示内容一实验例，西罗莫司-甘氨酸与西罗莫司-二甘氨酸的质谱分析结果.

第7A图与第7B图分别显示根据本揭示内容一实验例，叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物与叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-二甘氨酸的MALDI-TOF析结果。

第8图显示NHS-PEG5-芬戈莫德复合物的MALDI-TOF分析结果。

第9图显示根据本揭示内容一实验例，叠氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物的质谱分析结果。

第10A图与第10B图分别显示根据本揭示内容一实验例，NHS-PEG4-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物与NHS-PEG4-PEG3-S-S-西罗莫司-二甘氨酸复合物的质谱分析结果。

第11图显示根据本揭示内容一实验例，NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物的质谱分析结果。

第12A至12D图分别显示根据本揭示内容一实验例，由带有一个自由TCO官能基与一组五个西罗莫司-甘氨酸、五个芬戈莫德、十个芬戈莫德与五个芬戈莫德磷酸盐分子之接合单元组成的载药束之MALDI-TOF分析结果。

第13A至13C图分别显示根据本揭示内容一实验例，纯化人类HLA-A1-IgG1.Fc、HLA-A2-IgG1.Fc与PD-1-IgG1.F融合蛋白的SDS-PAGE分析结果。

第14A与14B图分别显示根据本揭示内容一实验例，纯化人类CTLA-4与PD-L1蛋白的SDS-PAGE分析结果；第14C图显示纯化人类CTLA-4的西方墨点分析结果；且第14D图显示纯化人类PD-L1蛋白的ELISA分析结果。

第15A至15C图分别显示根据本揭示内容一实验例，人类HLA-A1单抗(mAb)的纯化scFv之SDS-PAGE、质谱与ELISA分析结果。

第16A与16B图分别显示根据本揭示内容一实验例，呈现对人类HLA-A2专一scFvs的噬菌体的效价分析与对人类HLA-A2专一的噬菌体-呈现scFvs的单一菌落ELISA分析结果。

第17A图与第17B图分别显示根据本揭示内容一实验例，四嗪-对人类HLA-A1专一scFv复合物的质谱与ELISA分析结果。

第18图显示根据本揭示内容一实验例，一效应单元的10％SDS-PAGE分析结果，所述效应单元是由带有一个自由TCO官能基与一组三个作为效应组件的PDL-1分子所组成之接合单元所组成。

第19图显示根据本揭示内容一实验例，一单一接合单元分子构建体的10％SDS-PAGE分析结果，其带有一个对HLA-A1专一的scFv作为标的组件与三个PD-L1分子作为效应组件。

第20A图与第20B图分别显示根据本揭示内容一实验例，西罗莫司与西罗莫司衍生化合物的mTOR抑制与T-细胞增生分析结果。

第21A图显示根据本揭示内容一实验例，表现S1P1受体之人类B细胞的染色分析结果；第21B图显示芬戈莫德透过连接臂与多肽核复合后的转移井迁移分析(transwell migration assay)结果。

第22A图显示根据本揭示内容一实验例，纯化重组双链(CTLA-4)-IgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；第22B图与第22C图分别显示纯化重组双链(CTLA-4)-IgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白与对CTLA-4与人类HLA-A1专一的scFv的ELISA分析结果。

第23A图显示纯化重组双链(PD-L1)-IgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；第23B至23D图分别显示纯化重组双链(PD-L1)-IgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白和对PD-L1、人类PD-1与人类HLA-A1专一的mAb的ELISA分析结果。

根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。此外，在不同图式间，尽可能以相同或相似的组件符号来指称相似的组件/部件。

【具体实施方式】

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

为了便于说明，此处整理了说明书、实施例与附随申请专利范围中所用的某些词汇。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。

在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。此外，在本说明书与申请专利范围中，“至少一”与“一或更多”等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本说明书与申请专利范围中，“A、B及C其中至少一者”、“A、B或C其中至少一者”以及“A、B和/或C其中至少一者”系指涵盖了仅有A、仅有B、仅有C、A与B两者、B与C两者、A与C两者、以及A、B与C三者。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。当可理解，除了实验例之外，或除非另有明确的说明，此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一端点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。

本揭示内容一般系关于多种分子构建体，其中每一分子构建体包含一标的组件(T)与一效应组件(E)，在本说明书中有时将这些分子构建体称为“T-E分子”、“T-E药物”或“T-E药品”。

在此处，“标的组件(targeting element)”一词系指分子构建体能够直接或间接结合到一目标标的(如，一细胞表面上的受体或一组织中的蛋白质)的部分，因而能够协助将本发明分子构建体递送到目标标的。在某些例子中，标的组件可将所述分子构建体导引至邻近目标细胞处。在其他情形中，标的组件可专一地结合到目标细胞表面上的分子；或标的组件可和第二分子专一地结合，而此一第二分子能够专一地结合到目标细胞表面上的分子。在某些例子中，一旦标的组件与目标标的接合之后，标的组件可将本发明分子构建体内化，而使其移动到目标细胞的细胞质内。标的组件可以是细胞表面受体的抗体或配体；或者是可和上述抗体或配体结合的分子，因而能够间接地将本发明分子构建体标的到目标部位(譬如所选定的细胞表面)。相较于没有标的功能的治疗药物，利用本发明分子构建体能够加强或有利于效应组件(治疗药剂)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一种程度或相对的比例，而不是让效应组件在疾病部位绝对或完全的局部化。

根据本发明，“效应组件(effector element)”一词系指一旦分子构建体到达目标部位后，所述分子构建体中能够发挥生物活性(譬如，诱发免疫反应、发挥细胞毒性及与其相似者)或其他功能活性(譬如招募其他经半抗原标记的治疗用分子)的部分。“效应”可指治疗性或诊断性的效果。效应组件包含能够和细胞和/或细胞外免疫调节因子结合的组件。上述效应组件包含如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、糖蛋白、药物部分(包含小分子药与生物制剂)、化合物、元素及同位素等物质，也包含上述物质的片段。

虽然在此处利用“第一”、“第二、“第三”等词汇来描述多种组件、部件、区域和/或区段，这些组件(以及部件、区域和/或区段)不受上述修饰词的限制。此外，除非上下文有明示的说明，使用这些序数并未隐含序列或顺序。反之，这些词汇仅是用来区分各组件。因此，亦可将下文所述的第一组件命名为第二组件，而不会悖离例示性实施方式所揭示的内容。

在此处，“连接(link)”、“耦接(couple)”以及“复合(conjugate)”等词可互换使用，且都是用来指称透过直接或间接的连接关系，将两个组件连接在一起。

“多肽(polypeptide)”一词在此系指具有至少两个氨基酸残基的聚合物。一般来说，多肽包含2到200个氨基酸残基；在较佳的情形中，是2到50个残基。在本说明书中所提及的氨基酸序列涵盖了此种序列的L-、D-或β-氨基酸等形式。多肽亦包括氨基酸聚合物，其中有一或多个氨基酸残基是与一天然氨基酸相应的人工化学类似物，当然也包括天然产生的氨基酸聚合物。此外，此一词汇亦涵盖以多肽链或其他方式连接的氨基酸，上述其他方式如经修饰的连接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫酰胺(thioamide)、磷酰胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羟基酯(hydroxylate)键、以及与其相似者来取代多肽键。

于一些实施方式中，本发明范围亦涵盖了其他相较于所述序列具有保守性置换的蛋白。于多种实施方式中，有一、二、三、四或五个不同的残基经过置换。在此处，“保守性置换(conservative substitution)”一词是指所述氨基酸置换不会明显地改变分子活性(譬如生物或功能活性和/或专一性)。一般来说，保守性氨基酸置换是利用另一种具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸来取代某一氨基酸。某些保守性置换包括“类似物置换”，亦即以非标准(如罕见或合成等)氨基酸来取代标准氨基酸，而上述非标准氨基酸和被取代的原有氨基酸之间的差异极小。可由标准氨基酸经人工修饰而在不会大幅改变原有氨基酸结构的前提下，得到所述的氨基酸类似物，譬如异构物或代谢前驱物等皆属之。

于一些实施方式中，本案的范围亦涵盖和任何所述序列具有至少80％序列相似度的任何序列，上述序列相似度较佳为至少85％或90％、更佳为至少95％或98％。

此处针对多肽序列所述的“氨基酸序列相似度百分比(Percentage(％)amino acid sequence identity)”系指候选序列的氨基酸残基与参考多肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比；于进行上述比对时，可将所述的候选多肽片段与所述的特定多肽片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在计算相似度时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基。相关领域已有多种方法可用以进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二多肽序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析数据库Blastp来进行。候选多肽序列A相较于参考多肽序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为多肽序列A与多肽序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下：

其中X是利用BLAST序列并排程序对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。

“聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)”一词在此系指带有一个胺基(amino group)与一个羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链。一般来说，聚乙二醇化氨基酸的结构式为NH2-(CH2CH2O)n-COOH。在本揭示内容中，n值介于1到20之间；较佳是介于2至12。

在此处一多肽的“端”系指位于该多肽N-或C-端点的氨基酸残基。在描述一聚合物(譬如此处所述的聚乙二醇)的组成单元时时，“端”则是指在聚合物骨架末端的部分。在本说明书与申请专利范围中，“自由端”一词是用来指称并未与另一个分子形成化学键结的末端氨基酸残基或构成单元。

“抗原(antigen或Ag)”一词系指能够导致免疫反应的分子。此种免疫反应可能涉及分泌性(secretory)、荷尔蒙性(humoral)和/或细胞级(cellular)的抗原专一反应。在本揭示内容中，“抗原”一词系指蛋白质、多肽(包括其突变株或具有生物活性的片段)、多糖、糖蛋白、糖脂质、核酸或上述之组合。

在本说明书与申请专利范围中，“抗体(antibody)”一词应以广义方式解释，且包含完整组装的抗体、可和抗原结合的抗体片段，譬如抗原结合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2片段(具有彼此以双硫键连接的两个Fab部分)、可变片段(variable fragment，Fv)、单链可变片段(scFv)、双专一性单链可变片段(bi-scFv)、纳米抗体(nanobodies)、单抗体(unibodies)以及双体抗体(diabodies)。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，较佳为包括完整抗体的抗原结合区域或可变区域。在典型的例子中，“抗体”系指实质上由免疫球蛋白基因或其片段所编码的一或多种多肽所组成的蛋白质。习知的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(gamma)、ε(epsilon)与μ(mu)等恒定区基因(constant region gene)、以及无数的免疫球蛋白可变区基因(variable region genes)。轻链通常归类为κ(kappa)或λ(lambda)。重链通常归类为γ(gamma)、μ(mu)、α(alpha)、δ(gamma)或ε(epsilon)，基于这些结构，定义出了以下类型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗体结构是一种四聚物(tetramer)。每一个四聚物是由两条相同的多肽链所组成，且每一对分别有一“轻”链(约25kDa)与一“重”链(约50-70kDa)。每一链的N-端界定了一个可变区域，包含约100至110个或更多的氨基酸，其主要负责抗原辨识。可变轻链(variable light chain，VL)与可变重链(variable heavu chain，VH)等词就是分别指上述的轻链与重链。根据本揭示内容的实施方式，可藉由改变天然抗体或利用重组DNA方式重新合成上述抗体片段。于本揭示内容一些实施方式中，上述抗体和/或抗体片段可具有双专一性，且可有多种不同的构形。举例来说，双专一性抗体可包含二个不同的抗原结合部位(可变区域)。于多种实施方式中，可利用融合瘤技术或重组DNA技术来制备双专一性抗体。于一些实施方式中，双专一性抗体对至少两种不同的表位(epitope)有结合专一性。

“专一地结合(specifically bind)”一词在此处系指抗体或其抗原结合片段能够和抗原结合的能力，上述结合的解离常数(dissociation constant，Kd)小于约1×10^-6M、1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^-9M、1×10^-10M、1×10^-11M或1×10^-12M；或者是或额外地，相较于其对于非专一性抗原的结合亲和力，上述抗体或其抗原结合片段与抗原结合的亲和力为两倍以上。

“治疗(treatment)”一词系指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；而治疗的行为在此包括上述预防性、疗愈性或缓和性的处置。具体来说，治疗在此系指对于可能患有一医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常、或易于罹患一疾患的个体施用或投予本发明分子构建体或包含此分子构建体的药学组合物，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或是延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对尚未表出现疾病、异常和/或病症征兆的个体和/或出现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关的病理变化的风险。

在此处，“有效量(effective amount)”一词系指本发明分子构建体的用量足以招致所欲的治疗反应。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一、二或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，譬如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，譬如表示为每公斤体重多少毫克(mg/kg)。

所述“施用(application)”与“投予(administration)”等词在此可交替使用，其系指将本发明之分子构建体或药学组合物提供给需要治疗的个体。

“个体(subject)”或“患者(patient)”等词在此可交互使用，且是指可接受本揭示内容之分子构建体、药学组合物和/或方法处置的动物(包含人类)。除非另有指明，“个体”或“患者”一般包含雄性与雌性。“个体”或“患者”包含任何可因本揭示内容的处置而获益的哺乳类动物。所述“个体”或“患者”的例示包含，但不限于：人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。所述哺乳类动物涵盖哺乳动物纲的所有成员，包括人类、灵长类动物、家畜和农畜(如兔子、猪、绵羊和牛)、动物园动物或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。“非人类哺乳动物”一词则涵盖除了人类以外的所有哺乳动物纲成员。

在本揭示内容中，“移植排斥(transplant rejection)”一词系指对来自胰岛、干细胞、骨髓、皮肤、肌肉、角膜组织、神经组织、心、肺、心肺综合、肾、肝、肠、胰、气管或食道的细胞、组织或固体器官的同种异体移植物(allografts)或异种移植物(xenografts)的急性或慢性排斥作用、或移植物抗宿主疾病(graft-versus-host diseases，简称GvHD)。

在此处，“供体移植物(donor transplant)”系指为了取代接受者之受损或缺失的组织或器官，而欲由一个体移动至另一个体或由一个体的供体部位(donor site)移动到体内另一位置的一群细胞或组织或器官。

本揭示内容至少部分是基于建构出了T–E药物，此种T-E药物可被递送至目标细胞、目标组织或器官，且其在这些部位的比例相对高于在血液循环、淋巴系统以及其他细胞、组织和器官中的比例。当实现上述情境时，即可提升T-E药物的疗效，且其副作用与毒性的数目和严重性都会降低。相较于不含标的组件的药物，以T-E分子的形式来投递药物时，发挥疗效的效应物所用的浓度可能较低。因此，可在较低的剂量下施用治疗用的效应物而不会减损其有效性，但却能同时降低其副作用与毒性。

可因较佳药物标的而获益的疾病

若是可将药物标的到疾病部位，亦即若是可使药物在疾病部位(相对于在正常组织或器官)局部化或有较优势的浓度，就能够改善用以治疗许多疾病的药物，使其具备较佳的疗效与安全性。某些抗体药物是以感染性微生物或其毒素产物为标的，若使这些抗体药物具备招募免疫细胞的能力，以吞噬或清除与抗体结合的粒子，就能够提升其疗效。下文提出一些主要的例示性疾病，若是能使得这些疾病所用药物在疾病部位或细胞有较佳的分布比例或能够招募可吞噬细胞的免疫细胞，就可以改善这些药物。

与移植相关的疾病/症状的例子包括，但不限于：器官排斥(包括慢性、急性、亚急性与超急性排斥)以及移植物抗宿主疾病。

移植系指将细胞、组织或器官由一个体移至另一个体或由一个体的供体部位移动到其体内另一位置。利用来自供体的器官进行移植，可以矫正器官系统的异常。然而，供体移植物(例所移植的器官、组织或细胞)，特别是在同种异体移植或异种移植的情形中，常会被受体的免疫系统认定为外来物，因而导致对于所植入的器官、组织或细胞的排斥。

对于遗传组成相异的组织的排斥作用虽然涉及了许多抗原，其中以主要组织兼容性复合体(major histocompatibility complex，简称MHC)主要负责最激烈的同种异体移植排斥反应。人类的MHC称为人类白血球抗原(HLA)系统，其位于第6号染色体的短臂上靠近互补基因(complement genes)的位置。相关研究最多的HLA基因是九种典型的MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA以及HLA-DRB1。人类的MHC基因簇(gene cluster)可分为三个区域，分别是第I型、第II型与第III型。A、B与C基因属于MHC第I型，而上述六种D基因则属于第II型。

MHC表现属于共显性，亦即所遗传到的两组对偶基因会均等地表现于细胞表面上。更有甚者，一组的MHC对偶基因是以单倍体(haplotypes)的形式遗传；因此，一个异型合子个体会有两组MHC单倍体基因型，一组来自父系染色体，另一组则来自母系染色体。每一个体会携带来自三种第I型基因(即HLA-A、HLA-B与HLA-C)的两个对偶基因，故因此可表现六种不同的MHC-I类型。在第II型基因座中，每一个体会遗传到一对HLA-DP基因(DPA1与DPB1)、数个HLA-DQ基因(DQA1与DQB1)、一个HLA-DRα基因(DRA1)以及一或更多个HLA-DRβ基因(DRB1与DRB3、DRB4或DRB5)；因此，一个异型合子个体可遗传到六或八个具有功能的第II型对偶基因，其中三或更多个分别来自父母一方。MHC基因是高度多型性状的基因；在一族群中，不同个体间存有许多不同的对偶基因。

MHC第I型与MHC第II型但败在移植排斥中都扮演了关键的角色。MHC第I型表现于所有有核细胞上；且这些第I型分子负责向带有CD8受体的T细胞(例如同种异体反应性杀手T细胞(亦称为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，简称CTLs))呈现来自细胞内的抗原性胜肽(如，自体抗原、来自细胞内病毒的抗原以及肿瘤相关抗原)。一旦CTL的T细胞受体(T cell receptors，简称TCRs)辨识出移植组织的MHC第I型分子，CTL会启动目标细胞的程序性细胞死亡使其进行细胞凋亡(apoptosis)。另一方面，MHC第II型通常仅会发生在专门的抗原呈现细胞(antigen-presenting cells，简称APCs)上，例如树突细胞、活化的巨噬细胞与B细胞。MHC第II型可对CD4T细胞呈现细胞外抗原。当记忆辅助T细胞的CD4受体与在移植组织的目标细胞表面上表现的MHC第II型分子结合时，记忆辅助T细胞的TCR会辨识其目标抗原，且之后会产生作为效应细胞的复制体，以分泌免疫信号分子(细胞介素)，使其达到接近先前记忆辅助T细胞用以记忆该抗原的致敏程序中的细胞介素平衡(cytokine balance)状态。由于在这种情况下的致敏程序通常发生于发炎反应中，此种免疫记忆程序会促进发炎反应。

移植物抗宿主疾病(GvHD)是在接受了来自遗传组成相异个体的供体组织后，所产生的并发症。GvHD通常发生于干细胞或骨髓移植，但也可能发生在其他组织移植中。捐赠组织(即，移植物)中的免疫细胞(白血球)将受体(即，宿主)视为外来物，而使得移入的免疫细胞攻击宿主的体细胞。

本案提出的T-E分子设计可用以制备能够防止对供体移植物排斥的分子构建体。

在此处提出的分子构建体中，标的组件为对由供体移植物表现但接收该移植物的个体细胞不会表现的HLA A、B或C异型专一的scFV。由于HLA A、B与C的单倍体基因型中共有六个基因，不难在供体与受体间找出具有不同异型的一个基因。已有许多抗HLA异型的抗体。举例来说，对HLA A2与B27专一的抗体已为本领域所熟知。此外，也已制备出对Cw1抗原(对应对偶基因：C*01:02)专一的抗体。某些抗体可和数种异型通用的决定位(determinants)结合；举例来说，有一抗体可和A11与A24结合，还有另一种抗体可和A11、A25、A26,与A66结合。可从接受移植患者A的周边血中分离对HLA A、B与C异型专一的B细胞，并利用RT-PCR选殖这些B细胞的VH与VL序列，以建构可和不同HLA异型结合的抗体群。类似技术已用于建构对多种病毒抗原专一的抗原专一人类单株抗体。可针对接受有特定单倍体基因型的患者，选择带有对该HLA异型专一的之scFv的分子构建体。

效应组件可选自：(1)免疫检查点蛋白(例如CTLA-4与PD-L1)的胞外结构域(ectodomain)或胞外域(extracellular domain)，所述免疫检查点蛋白可抑制发生中的免疫活化作用；(2)对CD25专一抗体scFv，CD25系由经活化T细胞所表现；以及(3)小分子免疫抑制药物，如西罗莫司(又称雷帕霉素(rapamycin))、依维莫司与他克莫司(FK-506)，这些免疫抑制药物已广泛用于防止移植排斥。西罗莫司与依维莫司可抑制mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶蛋白)，而他克莫司则可抑制钙调磷酸酶；这些药物均可有效抑制T细胞活性。芬戈莫德及其衍生物(如，芬戈莫德磷酸盐)也是适当的免疫抑制物。但由于抗-CD25、芬戈莫德、西罗莫司、依维莫司与他克莫司具有免疫抑制的效果，这些药物都各自有严重的副作用。因此，相关领域希望能够将较多比例的此类药物运送至移植物，并降低其他身体其他部位的比例，特别是在血液与淋巴系统中。

西罗莫司(分子量914.172道耳顿)与他克莫司(分子量804.018道耳顿)皆可用于本发明，这是因为在大多数的应用中，西罗莫司或依维莫司的用量约为每日2到10毫克，而他克莫司的用量约为每日5至15毫克。目前亦用于预防移植排斥的某些免疫抑制药物，如环胞素(cyclosporine，分子量1,202.61道耳顿)与霉酚酸(mycophenolic acid，分子量320.34道耳顿)较不适用本发明，因为环胞素的用量约为每日150至1,000毫克，而霉酚酸的用量则为每日约800至1,500毫克。以带有两个scFvs作为标的组件以及十个西罗莫司分子作为效应组件的分子构建体为例，scFv的分子量(约25,000道耳顿)约莫是西罗莫司分子量的六倍。因此，要投予5毫克的西罗莫司时，需要约30毫克的scFv，此种给药剂量是可接受的。此外，根据本揭示内容，由于所投予的西罗莫司会被携带到移植物，相较于除统上未进行标的的给药方式，可给予较低剂量的西罗莫司。

由于西罗莫司、依维莫司与他克莫司是作用在T细胞的细胞间标的，可透过一可裂解键结将这些药物连接到多臂接合单元，可透过水解作用或由位于标的组织部位的组织蛋白质酶将这些药物由接合物切下。由于本揭示内容提出的分子构建体可透过静脉内给药，其可透过快速药物动力学而到达目标部位，因此中途水解不会是个重大的问题。已可在有机化学实验室中重新合成西罗莫司、依维莫司与他克莫司分子。可将各种用于复合的官能基(如硫氢基与氨基)引入不会影响分子抑制其标的之侧链中。更有甚者，将这些分子连接到接合单元中，不会妨碍芬戈莫德、西罗莫司、依维莫司与他克莫司的活性。当释出免疫抑制物，这些分子即可重新拥有其抑制活性。根据本揭示内容的实施方式，某些采用单一接合单元或联合接合物构型的T-E分子采用对同种异体HLA A、B或C抗原(不存在于受治疗患者体内)专一的scFv作为标的组件，并使用西罗莫司、依维莫司、他克莫司或对CD25专一之scFv作为效应组件。

芬戈莫德与芬戈莫德磷酸盐可作为抑制移植排斥反应的候选药物。在以芬戈莫德治疗肾脏移植临床试验中，并未发现其相较于其他已采用的标准疗法有较佳的效果。然而，若可提高芬戈莫德到达所植入器官的浓度，应该可以在植入器官处达到有效的免疫抑制效果。

将免疫抑制药物标的至植入器官的策略亦可运用于移植物抗宿主疾病(GvHD)。在接受干细胞、骨髓移植物甚至是组织或输血的患者体内，来自移植物的免疫细胞将宿主细胞认定为外来物，并对宿主细胞发动免疫反应，进而对接受者的肝、皮肤、黏膜、肠胃道以及其他组织与器官带来严重的伤害。可将免疫抑制剂(如西罗莫司、依维莫司、他克莫司、芬戈莫德或芬戈莫德磷酸盐)携带至表现出仅表现于植入物白血球上之HLA对偶基因的细胞。这些被标的的细胞包括主要负责GvHD中细胞溶解活性的T细胞。当来自移植物的T细胞受到抑制时，即可有效改善GvHD。

第一节用以治疗特定疾病的多臂接合物

在多种实施方式中，本揭示内容提出一种多臂接合单元，其可用以治疗一个体之移植排斥。根据本揭示内容多种实施方式，所述接合单元包含一中心核、复数个连接臂、复数个第一组件以及视需要而的一耦合臂与一第二组件。

所述中心核可以是一多肽核，在接上连接臂之前，多肽核具有预定数目的氨基(-NH2)。举例来说，多肽核可具有二或更多个赖氨酸(K)残基，其侧链带有氨基。

下列段落揭示了适用于此处所示之多肽核的结构，接着描述适用于建构所述多臂接合物的功能性组件，以及此种多臂接合物的用途。

本揭示内容的第一态样是关于一种接合单元，其包含：(1)一中心核，其包含2-15个赖氨酸(K)残基；以及(2)2-15个连接臂，分别连接于中心核的各K残基。本发明中心核的特征在于其N-或C-端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。

在制备本发明接合单元时，将一端带有N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimydil，NHS)基且另一端带有一官能基(如，NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)的PEG链连接到K残基上；具体来说，利用上述NHS基和K残基上的氨基形成酰胺键，进而将PEG链连接到中心核上。在本揭示内容中，将连接到K残基之后的PEG链称为连接臂，此连接臂的自由端带有官能基。

根据本揭示内容的实施方式，上述中心核是多肽核，其长度为8-120个氨基酸残基，且包含2至15个赖氨酸(K)残基，其中每一个K残基和下一个K残基之间以一填充序列隔开。

根据本揭示内容的实施方式，填充序列包含甘氨酸(glycine，G)与与丝氨酸(serine，S)残基；在较佳的情形中，填充序列是由选自G、S及其组合的2-15个残基所组成。举例来说，填充序列可以是：

GS、

GGS、

GSG、

GGGS(SEQ ID NO:1)、

GSGS(SEQ ID NO:2)、

GGSG(SEQ ID NO:3)、

GSGGS(SEQ ID NO:4)、

SGGSG(SEQ ID NO:5)、

GGGGS(SEQ ID NO:6)、

GGSGGS(SEQ ID NO:7)、

GGSGGSG(SEQ ID NO:8)、

SGSGGSGS(SEQ ID NO:9)、

GSGGSGSGS(SEQ ID NO:10)、

SGGSGGSGSG(SEQ ID NO:11)、

GGSGGSGGSGS(SEQ ID NO:12)、

SGGSGGSGSGGS(SEQ ID NO:13)、

GGGGSGGSGGGGS(SEQ ID NO:14)、

GGGSGSGSGSGGGS(SEQ ID NO:15)或

SGSGGGGGSGGSGSG(SEQ ID NO:16)。

两个赖氨酸残基之间的填充序列可以由各种长度和组合的甘氨酸与丝氨酸残基所组成。在赖氨酸残基数目较少的多肽核中，可使用较长的填充序列；在赖氨酸残基数目较多的多肽核中，则可使用较短的填充序列。除了甘氨酸与丝氨酸之外，可在填充序列中加入亲水性氨基酸残基，如天冬胺酸与组胺酸。除了由甘氨酸与丝氨酸残基组成的填充序列之外，也可使用其他填充序列，譬如可使用常见人类血清蛋白(如白蛋白与免疫球蛋白)中的可挠性、可溶性环。

基本上，赖氨酸残基之间的填充序列可包含甘氨酸与丝氨酸残基。然而，所述填充序列也可以是由任何侧链不带有氨基的氨基酸残基所组成。这些氨基酸残基主要可以是亲水性残基，但不需要全部都是亲水性残基。所述氨基酸残基也不必然是天然存在的。

根据本揭示内容某些较佳的实施方式，中心核包含2-15个单元的G1-5SK序列。或者是，此多肽核的序列为(GSK)2-15；即，多肽包含至少两个连续的GSK单元。举例来说，本发明中心核可包含下列氨基酸序列：

Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK(SEQ ID NO:17)、

Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK(SEQ ID NO:18)或

Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK(SEQ ID NO:19)，

其中Ac代表乙酰基。

根据本揭示内容某些实施方式，中心核是序列为(Xaa-K)n的多肽核，其中Xaa是聚乙二醇化氨基酸，其具有2至12个乙二醇(EG)重复单元，且n是2至15的整数。

当可理解，本案所述中心核的赖氨酸残基也可置换任何侧链带有氨基的氨基酸残基；譬如：带有(CH2-)nNH2侧链(n＝1-3或5)的α-氨基酸、带有(CH(OH)-)nCH2-NH2侧链(n＝1-5)的α-氨基酸、带有(CH2-CH(OH)-)nCH2-NH2侧链(n＝1-3)的α-氨基酸以及带有(CH2-CH2-O-)nCH2-NH2侧链(n＝1-2)的α-氨基酸。这些氨基酸不必然是天然存在的氨基酸。

如上文所述，本发明中心核的特征在于其N-或C-端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。根据本揭示内容某些实施方式，本发明中心核的N-或C-端氨基酸残基带有叠氮基或炔基。带有叠氮基的氨基酸残基可以是：L-叠氮高丙氨酸(AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸。举例来说，本发明中心核可具有以下序列：

Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-A^AH、

Ac-A^AH-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、

Ac-A^AH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、

Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-A^AH、

Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-A^AH、

Ac-A^AH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、

Ac-A^AH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或

Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-A^AH，

其中Xaa是带有所述数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，Ac代表乙酰基，而A^AH代表AHA残基。

带有炔基的氨基酸的例子包括，但不限于：L-高炔丙基甘氨酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)、或β-高炔丙基甘氨酸(β-HPG)。在本例中，本发明中心核可具有以下序列：

Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-G^HP、

Ac-G^HP-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、

Ac-G^HP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、

Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-G^HP、

Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-G^HP、

Ac-G^HP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、

Ac-G^HP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或

Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-G^HP，

其中Xaa是带有所述数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，Ac代表乙酰基，而G^HP代表HPG残基。

当可理解，目前已可透过商业管道取得多种侧链带有叠氮基或炔基的氨基酸与聚乙二醇化氨基酸，这些氨基酸可以带有保护基团，如叔-丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl，t-boc)或茀甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)，故可轻易用于固态多肽合成。

根据本揭示内容某些实验例，所用的中心核可包含以下序列：

Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSK(SEQ ID NO:20)、

Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSKGSK(SEQ ID NO:21)、

Ac-A^AHGGSGGSGGSKGSGSKGSK(SEQ ID NO:22)、

Ac-G^HPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC(SEQ ID NO:23)、

Ac-C-Xaa2-K-Xaa2-K-Xaa2-K(SEQ ID NO:24)或

Ac-C-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K(SEQ ID NO:25)，

其中Xaa为带有指定数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸、Ac代表乙酰基、A^AH代表AHA残基且G^HP代表HPG残基。

或者是，本发明中心核可和耦合臂连接，此耦合臂的自由端(即，未和中心核连接的一端)带有一官能基(如，叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)。在这些情形中，本发明中心核的N-或C-端为半胱氨酸残基。在制备与耦合臂连接的接合单元时，将一端带有顺丁烯二酰亚胺基且另一端带有上述官能基的PEG链与上述半胱氨酸残基连接；具体来说，可透过PEG链的顺丁烯二酰亚胺基和半胱氨酸残基的硫氢基之间的硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将两者连接在一起。在本揭示内容中，连接到中心核末端半胱氨酸残基上的PEG链称为耦合臂，且其自由端带有上述官能基。

当可理解，本案所述中心核的半胱氨酸残基可取代成任何侧链带有硫氢基的氨基酸残基；譬如：带有(CH(OH)-)nCH2-SH侧链(n＝1-5)的α-氨基酸、带有(CH2-CH(OH)-)nCH2-SH侧链(n＝1-3)的α-氨基酸以及带有(CH2-CH2-O-)nCH2-SH侧链(n＝1-2)的α-氨基酸。这些氨基酸不必然是天然存在的氨基酸。此外，半胱氨酸残基也不必然要设于多肽核的N-或C-端。举例来说，可将半胱氨酸残基设于多肽核中间的位置，而使得赖氨酸残基位于半胱氨酸残基的两侧。

在较佳的情形中，耦合臂的自由端带有四嗪基或高应力炔基(如，环辛烯基或环辛炔基)。这些耦合臂具有2-12个EG单元。根据本揭示内容的实施方式，上述四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪1,2,4,5-四嗪或其衍生物。高应力炔基可以是环辛烯基或环辛炔基。根据本揭示内容的实验例，所述环辛烯基可以是反式-环辛烯(TCO)基；而环辛炔基的实施例包括，但不限于：二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)与二苯并环辛炔(DICO)。根据本揭示内容某些实施方式，四嗪基为6-甲基-四嗪。

根据多种实施例，用以与耦合臂连接的中心核包括，但不限于：

Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、

Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、

Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、

Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、

四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、

高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、

四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4以及

高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4。

或者是，中心核的一端带有叠氮基或炔基，而另一端则接上了带有四嗪基或高应力炔基的耦合臂，兹举例如下：

Ac-A^AH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、

Ac-A^AH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、

四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-A^AH、

高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-A^AH、

Ac-A^AH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、

Ac-A^AH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、

四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-A^AH、

高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-A^AH、

Ac-G^HP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、

Ac-G^HP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、

四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-G^HP、

高应力炔基-Xaa2-12-C(AC)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-G^HP、

Ac-G^HP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、

Ac-G^HP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、

四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-G^HP以及

高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-G^HP。

也可利用重组技术来合成上述多肽，再利用细菌或哺乳类宿主细胞来表现指定的基因区段。如果多肽核的赖氨酸残基数目较多且长度较长，利用重组蛋白技术较佳。这是因为当多肽长度变长时，使用固态合成法发生错误的机率会增加，且其纯度和/或产量会降低。要运用细菌或哺乳类宿主细胞来产生多肽核时，可在两个K残基之间插入长度为2至20个氨基酸残基的填充序列。此外，由于AHA和HPG并非可由遗传密码子编码的天然氨基酸，这些重组多肽的N-端或C-端残基可以是半胱氨酸。在表现出重组蛋白并将其纯化之后，可使末端的半胱氨酸残基和短的双功交联物反应；上述双功交联物的一端带有可和半胱氨酸残基的SH基反应的顺丁烯二酰亚胺基，另一端则带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基。

相较于利用常规氨基酸(如甘氨酸与丝氨酸残基)来合成多肽核，使用聚乙二醇化氨基酸来合成多肽核的步骤较少。此外，可采用不同长度的聚乙二醇化氨基酸(即，带有不同EG重复单元者)，一方面可提供可挠性与水溶性，另一方面亦可在相邻的赖氨酸残基之间提供间隔。除了聚乙二醇化氨基酸之外，中心核也可包含人工氨基酸，如D-构形氨基酸、高氨基酸、N-甲基氨基酸等。在较佳的情形中，可使用带有不同长度聚乙二醇(PEG)的聚乙二醇化氨基酸来建构中心核，因为胺基分子中所含的PEG部分可提供构形上的可挠性，并在用以接合的基团间提供了适当的间隔，还可以提升其水溶性；另外，一般来说，PEG的免疫源性较低。合成带有聚乙二醇化氨基酸的中心核的方法和合成常规多肽相似。

视需要，本发明中心核可更带有一乙酰基，以保护位于N端的氨基酸残基，进而提升其稳定性。

当可理解，连接于中心核的连接臂的数目主要取决于连接于中心核中所含赖氨酸残基的数目。由于本发明中心核包含至少两个赖氨酸残基，所述接合单元可包含复数个连接臂。

参照第1A图。如图所示，接合单元10A包含中心核11a，其带有一个HPG(G^HP)残基以及四个赖氨酸(K)残基，其间分别以填充序列(以下各图式中以“···”表示)隔开。HPG残基和K残基之间或任两个K残基之间的填充序列可以是相同或不同的氨基酸序列。在本实施例中，四个连接臂20a-20d藉由NHS基和赖氨酸残基的氨基间所形成的酰胺键而连接到各个赖氨酸残基。当可理解，本说明书所述的多种接合单元间可能有一些共通的特征，因此针对上述接合单元10A或下述各接合单元所述的某些或全部特征可能也适用于下文提出的实施例，除非其明显有悖于特定实施方式的脉络。为求简洁，下文可能不会重复说明这些共通特征。

第1B图绘示了根据本揭示内容另一种实施方式的接合单元10B。中心核11b有一个半胱氨酸(C)残基以及六个赖氨酸(K)残基，这些残基之间分别以填充序列隔开。在本实施例中，接合单元10B包含连接到各个赖氨酸残基的六个连接臂20a-20f。根据本揭示内容的实施方式，连接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链。

接合单元1B与第1A图的接合单元10A不同之处在于接合单元1B更包含耦合臂60。如上文所述，可利用一端带有顺丁烯二酰亚胺基而另一端带有一特殊官能基的PEG链来形成耦合臂60。如此一来，耦合臂60可透过硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应而连接到中心核11b的半胱氨酸残基。在本实施例中，耦合臂60的自由端带有的特殊官能基是四嗪基72。根据本揭示内容的实施方式，耦合臂是具有2至12个EG重复单元的PEG链。

当需要在标的部位释放效应组件时，可以在连接臂中加入一个可裂解键；上述裂解键可经酸/碱水解、还原/氧化或酵素作用而裂解。举例来说，可利用NHS-PEG2-20-S-S-顺丁烯二酰亚胺作为此处所述的耦合臂，这是一种可裂解PEG链，其中的S-S双硫键会被缓慢的还原，而NHS基可用来和中心核的氨基接合，进而将PEG链连接到中心核上。另外，可利用叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基来取代位在连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基。

根据本发明实施方式，连接到中心核的K残基的连接臂在自由端带有一官能基(即，顺丁烯二酰亚胺基、NHS基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)。在较佳的情形中，当连接臂的自由端是叠氮基、炔基或环辛炔基时，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端是四嗪基或环辛烯基。或者是，当连接臂的自由端是四嗪基或环辛烯基时，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基带有叠氮基或炔基；或者是位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基或环辛炔基。

当可想见，本发明较佳的连接臂为PEG；然而，适合作为所述连接臂与耦合臂的例子则不限于PEG链。亦可使用含有甘氨酸、丝氨酸与其他亲水性氨基酸残基的多肽以及多糖与其他生物兼容的线性高分子，可并将其修饰以带有NHS或顺丁烯二酰亚胺基。

连接臂的长度取决于多种因素。其长度需足以允许所接上的scFv或其他类型的功能性组件具有可挠性而能够接触到位于目标细胞表面上所标的之抗原部位而不受到立体空间限制；但又不能过长，以免导致连接臂与所连接的scFv片段或功能性组件发生分子内或分子间纠缠，或不必要地增加整个分子构建体的大小以影响其组织穿透能力。过长的连接臂也可能无法拉近抗原分子以形成紧密的丛集，有时此种丛集是启动细胞凋亡或其他细胞效应之讯息传导过程所需的。本发明所属技术领域中具有通常知识者可在不经过度实验的前提下，决定不同的标的抗原及其结合物之组合所需的理想连接臂长度。根据本揭示内容多种分子构建体，较佳的连接臂为NHS-(PEG)12-顺丁烯二酰亚胺(约500道耳顿)。完全拉直的(PEG)12之长度约为

随着位于连接臂自由端上官能基(即，顺丁烯二酰亚胺基、NHS基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)的不同，可以设计带有相应官能基的功能性组件(譬如，标的组件、效应组件或用以改善药动学性质的组件)，而使得所述功能性组件可透过任一种下列化学反应而连接到连接臂的自由端：

(1)形成酰胺键：在此情形中，连接臂的自由端有一NHS基，且功能性组件有一氨基；

(2)硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应：在此情形中，连接臂的自由端有一顺丁烯二酰亚胺基，且功能性组件有一硫氢基；

(3)一价铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition；CuAAC，或简称为“炼接”反应)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有炔基；CuAAC反应如反应式1所示；

(4)逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有四嗪基，而另一个则带有环辛烯基；iEDDA反应如反应式2所示；或

(5)应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有环辛炔基；SPAAC反应如反应式3所示。

CuAAC反应会产生1,5-二取代1,2,3-三唑(1,5-disubstituted 1,2,3-triazole)。炔基和叠氮基之间的反应选择性极高，且天然生物分子不含炔基和叠氮基。再者，上述反应快速且对pH值不敏感。已知除了利用一价铜(如溴化铜(I)或碘化铜(I))来催化链接反应之外，较佳可使用二价铜和还原剂(如抗坏血酸钠)的混合物以在反应系统中原位(in situ)产生一价铜。或者是，可利用不含铜的反应，将第二组件连接到中心核的N-或C-端，此反应可利用环戊烷基环戊二烯基氯化钌复合物(pentamethylcyclopentadienyl ruthenium chloride complex)作为催化剂，以催化叠氮基-炔环加成反应。

<<反应式1CuAAC反应>>

<<反应式2iEDDA反应>>

<<反应式3SPAAC反应>>

为了方便说明，和连接臂相连的功能性组件称为第一组件。当可理解，本发明接合单元可携带的第一组件的数目取决于中心核的K残基的数目(且因此，取决于连接臂的数目)。因此，本发明所属技术领域具有通常知识者可调整所述接合单元中第一组件的数目，以达到所欲的标的或治疗效果。

如第1C图所示，例示性的接合单元10C包含第一组件。除了下文所述的特征之外，第1C所示结构与第1B图相似。首先，中心核11d有五个K残基，且因此有五个连接臂20a-20e分别与这些K残基相连。其次，接合单元10C有五个第一组件30a-30e，分别连接于每一连接臂20a-20e。如下文所述，视需要加入的四嗪基72使得所述接合单元可和额外的功能性组件或另一个分子构建体(参见下文第二节或第三节)耦接。

为了要进一步增加所需的效果(如，疗效)，本发明接合单元除了第一组件之外还可以包含第二组件。举例来说，第二组件可以是标的组件或效应组件。在本揭示内容可任选的实施方式中，第一组件是效应组件，而第二组件可以是另一种效应组件，两者可以累加地或加乘地作用，亦可独立作用。在另一种例子中，第一与第二组件可发挥不同的性质；譬如，第一组件是标的组件，而第二组件是效应组件，反之亦然。或者是，第一组件是效应组件，而第二组件则能够改善接合单元的药动学特性，如水溶性、廓清率、半衰期与生物可用率。在选择所述接合单元(或多臂接合物)所含的特定第一组件和/或第二组件时，需考虑所欲的应用。下文第一节第(iii)部分讨论了这些功能性组件的实施例。

在结构上，第二组件可连接到中心核N-或C-端的叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。具体来说，当有需要时，可将第二组件和短PEG链(较佳为具有2至12个EG重复单元)复合，之后再将其连接到位在N-或C-端的带有叠氮基或炔基的氨基酸残基(譬如AHA残基或HPG残基)。或者是，当有需要时，可将第二组件和短PEG链复合，且之后再将其连接于中心核的耦合臂。

根据本揭示内容某些实施方式，中心核的N-或C-端是带有叠氮基(譬如AHA残基)的氨基酸残基；且因此，带有炔基的第二组件就可以透过CuAAC反应而连接到中心核的N-或C-端。根据本揭示内容其他实施方式，上述中心核的N-或C-端是带有炔基(譬如HPG残基)的氨基酸残基；而带有叠氮基的第二组件就可以透过CuAAC反应而连接到中心核的N-或C-端。

第1D图绘示根据本发明实施例的另一种接合单元10D，其携带了复数个第一组件与一个第二组件。在本实施例中，中心核11c包含一个HPG(G^HP)残基以及五个赖氨酸(K)残基。五个连接臂20a-20e分别连接到中心核11c的五个K残基；而五个第一组件30a-30e则透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接到各个连接臂20a-20e。除了第一组件之外，所述接合单元10D更包含一个第二组件50，其系连接于短PEG链62的一端。在和中心核11c复合之前，短PEG链62的另一端带有叠氮基。如此一来，叠氮基可和带有炔基的HPG残基进行CuAAC反应，而使得第二组件50连接至中心核11c。第1D图所示的实心圆点40代表HPG残基和叠氮基间因为CuAAC反应所形成的化学键结。

或者是，第二组件透过耦合臂而和中心核连接。根据本揭示内容某些实施方式，耦合臂带有四嗪基，因此可透过iEDDA反应而有效率地连接到带有TCO的第二组件。根据本揭示内容其他实施方式，耦合臂带有TCO基，而第二组件可带有四嗪基，故两者可透过iEDDA反应而互相连接。相较于位在端点的炔基，iEDDA反应中所采用的高应力环辛烯基的活化能明显较低，且因此iEDDA反应不需使用额外催化剂。

接着参照第1E图，其中接合单元10E的中心核11d包含位于N端的半胱氨酸(C)残基和五个赖氨酸(K)残基。如第1E图所示，这五个连接臂20a-20e分别连接到中心核11d的五个K残基，而五个第一组件30a-30e则透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而分别连接到五个连接臂20a-20e。半胱氨酸残基连接于耦合臂60；在接上第二组件之前，耦合臂60的自由端带有四嗪基或TCO基。在本实施例中，第二组件50可和带有相应TCO或四嗪基的短PEG链62连接，再透过iEDDA反应而连接到耦合臂60。第1E图所示的椭圆点70代表耦合臂60和短PEG链62间进行iEDDA反应所产生的化学键结。

根据本揭示内容其他实施方式，在和第二组件接合之前，耦合臂带有叠氮基；当第二组件和自由端带有高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)的短PEG链连接时，耦合臂和第二组件就可以透过SPAAC反应(参见反应式3)而连接，反之亦然。

接着参照第1F图，其中接合单元10F的结构和第1E图的接合单元10E相近，不同之处在于耦合臂60带有叠氮基或高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)而不是四嗪基或TCO基。因此，第二组件50要和带有相应的高应力炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO)或叠氮基的短PEG链62连接，而使得第二组件50和耦合臂60可透过SPAAC反应而连接。第1F图所示的菱形点90代表耦合臂60与短PEG链62之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。

反应式4为制备本发明接合单元的例示性流程。在步骤1，先制备中心核，其氨基酸序列包含(GSK)3，且C端为L-叠氮高丙氨酸(AHA)残基。在步骤2，透过在NHS基与氨基间形成酰胺键，而将三个连接臂分别连接到中心核的赖氨酸(K)残基，连接到中心核的连接臂在自由端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基。在步骤3，透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将三个抗-A抗原scFv(scFvαA)连接到各连接臂上，此处的scFvαA即为第一组件。同时，在步骤4，将一个抗-B抗原scFv(scFvαB)和自由端带有DBCO基的短PEG链连接，上述短PEG链有4个EG重复单元，此处的tPA类似物即为第二组件。最后，在步骤5，透过SPAAC反应将第二组件连接到中心核的AHA残基。

<<反应式4透过连接臂与C-端氨基酸残基连接两种不同scFv的接合单元的制备方法>>

反应式5绘示制备本发明接合单元的另一种例示性流程。在步骤1，先制备中心核，其氨基酸序列包含(K-Xaa4)3且C-端有一半胱氨酸残基。在步骤2，将一端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基另一端带有四嗪基的PEG链(作为耦合臂)透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接到半胱氨酸残基。之后，在步骤3，将三个连接臂分别连接到中心核的赖氨酸(K)残基。接着，如步骤4所示，透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将三个抗-A抗原scFv(scFvαA)连接到各连接臂上，此处的scFvαA即为第一组件。同时，在步骤5，将一个抗-B抗原scFv(scFvαB)和自由端带有TCO基的短PEG链连接，上述短PEG链有3个EG重复单元，此处的scFvαB即为第二组件。最后，在步骤6，透过iEDDA反应将第二组件连接到耦合臂。

<<反应式5透过连接臂与耦合臂连接两种不同scFv的接合单元的制备方法>>

聚乙二醇化(PEGylation)是将PEG链附接或连接到分子(如，药物或蛋白)的方法。聚乙二醇化可以改善多种重要的药理学特性，譬如提升水溶性、延长生命周期以及减少蛋白质分解降解。根据本揭示内容一实施方式，第二组件是PEG链，其分子量约为20,000到50,000道耳顿。

第1G图绘示了另一种例示性的接合单元10G，其中五个第一组件30分别透过连接臂20连接到赖氨酸残基，且中心核11e的HPG(G^HP)残基透过CuAAC反应与PEG链80连接。第1G图所示的实心圆点40代表HPG残基与PEG链80间因为CuAAC反应所形成的化学键结。

第1H图是本揭示内容的另一种实施例，接合单元10H的中心核11d的N-端是与耦合臂60相连接的半胱氨酸残基。可透过iEDDA反应而有效率地将PEG链80连接到耦合臂60。接合单元10H的椭圆点70代表耦合臂60与PEG链80之间因为iEDDA反应所形成的化学键结。

第1I图是本发明接合单元的另一种实施例，所示的接合单元10I结构与第1G图的接合单元10G相似，不同之处在于PEG链80是透过SPAAC反应连接到耦合臂60。第1I图所绘示的菱形点90代表耦合臂60与PEG链80之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。

根据本揭示内容某些实施方式，除了第一与第二组件之外，本发明接合单元更包含第三组件。在此种实施例中，中心核的N-或C-端是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基，而另一端是半胱氨酸残基。中心核的赖氨酸残基分别和连接臂相连接，且每一条连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基；而中心核的半胱氨酸残基则和自由端带有四嗪基或高应力炔基的耦合臂相连。如此一来，第一组件可透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接于连接臂，而第二组件则可透过iEDDA反应和耦合臂相连接。另外，第三组件则是透过CuAAC反应或SPAAC反应而连接到带有叠氮基或炔基的末端氨基酸残基。

接着参照第1J图的接合单元10J，其中心核11f的N-端为HPG(G^HP)残基，而C-端是半胱氨酸残基。连接臂20和耦合臂60分别连接到中心核11f的赖氨酸(K)残基以及半胱氨酸(C)残基。此外，五个第一组件30分别连接到五个连接臂20，第二组件(即，PEG链)80和耦合臂60连接，而第三组件50则透过短PEG链62连接到HPG残基。实心圆点40代表HPG残基和短PEG链62之间因为CuAAC反应所形成的化学键结；而椭圆点70代表耦合臂60与PEG链80之间因为iEDDA反应所形成的化学键结。

第1K图绘示了本揭示内容的另一种实施方式；接合单元10K的结构与第1J图所示的接合单元10J相似，不同之处在于短PEG链62是透过SPAAC反应而连接到HPG残基，而非透过iEDDA反应。第1K图的菱形点90代表短PEG链62和HPG残基之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。

在本揭示内容较佳的实施方式中，连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，以便和带有硫氢基的第一组件透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接。此外，多肽核的一端可以是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基的氨基酸残基，以供和耦合臂接合，进而连接第二组件。

本发明所属技术领域具有通常知识者当可想见，可对上述结构进行各种修改。举例来说，在连接臂的自由端可采用顺丁烯二酰亚胺基以外的官能基(譬如叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)，以便透过CuAAC、iEDDA或SPAAC反应来连接第一组件。此外，半胱氨酸残基(或带有叠氮基或炔基的氨基酸残基)可以位在多肽核N-或C-端以外的位置。更有甚者，可在多肽核中加入二或更多个上述残基，以供接合多个耦合臂，并进一步连接多个第二组件。

当接合单元(或多臂接合物)仅包含第一组件而不带有第二和/或第三组件时，第一组件是一效应组件，其可于患者体内发挥治疗的效果。另一方面，当此处提出的接合单元包含除了第一组件以外的其他组件时，则这两种组件中应有至少一种是效应组件，而另一者可以是另一效应组件、一标的组件或能够改善接合单元药动学特性(如，溶解度、廓清率、半衰期与生物可用率)的组件。譬如，接合单元可带有两种不同的效应组件、一效应组件与一标的组件或一提升药动学特性的组件、两种不同的标的组件与一种效应组件、两种不同的效应组件与一种标的组件；或是可带有一种标的组件、一种效应组件以及一种可改善接合单元药动学特性的组件。

根据本揭示内容某些实施方式，标的组件是对仅存在于供体移植物细胞表面而不存在于受体细胞表面的人类白血球抗原(HLA)异型(如HLA-A、HLA-B与HLA-C异型)专一的抗体片段。

此外，根据本揭示内容多种实施方式的效应组件可以是免疫抑制物、免疫检查点蛋白或对CD25专一的抗体片段。例示性的免疫抑制物为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制物，如西罗莫司与依维莫司。另一类免疫抑制物为钙调磷酸酶抑制物，如他克莫司。免疫检查点蛋白是涉及免疫检查过程的蛋白，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，亦称为CD151)的胞外域以及程序性死亡配体1(PD-L1,alsoknown as CD274)的胞外域。

本发明也提出利用是当多臂接合物来治疗接受供体移植物或器官或细胞之个体的移植排斥。一般来说，所述方法包含以下步骤：对需要治疗个体投予有效量的根据本揭示内容实施方式的多臂接合物。

相较于既有的治疗性构建体，第一节以上段落所述的多臂接合单元(或接合单元)至少有以下的优点：

(1)可以视需求和/或用途来调整功能性组件的数目。根据不同用途的需求，本发明接合单元可包含二种组件(即，第一与第二组件)或三种组件(即，第一、第二与第三组件)，上述需求包括欲治疗的疾病、接合单元的给药方法、接合单元所携抗体的结合力与亲和力等等。举例来说，当要将接合单元直接投递到特定组织/器官时，可以只使用一种组件作为效应组件，而不需加入标的组件。然而，当透过周边给药途径来投递接合单元时，譬如经口服、肠胃道、鼻腔、局部或黏膜给药、或以肌肉内、静脉内或腹膜内注射，本发明接合单元就需要包含标的组件，以便将接合单元专一地标的到病灶部位；此外，接合单元还应该包含效应组件，以便在病灶部位发挥治疗效果。为了要提高接合单元的标的或治疗效果或提升其稳定度，本发明接合单元还可进一步包含第三组件；所述的第三组件可以是第二种标的组件、第二种效应组件或PEG链。

(2)第一组件是以成束(bundle)的形式存在。如上文所述，第一组件的数目取决于中心核所包含的赖氨酸残基的数目。如果中心核中赖氨酸残基的数目是2到15，则每一接合单元可带有至少两个第一组件。因此，相较于传统治疗性构建体仅能携带单一个分子(譬如单一个免疫抑制药物或抗体分子)，本发明接合单元可同时提供更多的功能性组件(不论是标的组件或效应组件)，进而可大幅提升疗效。

在某些治疗应用中，可能想要采用单一份的标的或效应组件。譬如，可使用单一份标的组件来避免因为标的组件结合力太强而导致不理想的副作用；当所用的scFv对标的抗原有相对较高的亲和力，且当标的抗原是正常细胞(而非所标的的染病细胞)上的细胞表面抗原时，上述考虑更显重要。在又一种例子中，可能想要加入单一份的长链PEG，以提升接合单元的药动学特性；因为使用两个或更多的长PEG链可能会使得PEG链缠结而影响标的或效应组件的结合力。

第二节用以治疗移植排斥的Fc型分子构建体及其用途

以广义的Fc构形来看，可利用免疫球蛋白抗体作为一标的或效应组件的基础，并将与其搭配的效应或标的组件以scFv区域的形式引入其两条γ重链的C-端。以传统的“Fc”构形来看，可利用双链IgG.Fc作为分子平台的基础。每一多肽链可和一或两个标的组件以及一或两个效应组件融合，使得每一链共带有二至三个组件。具有Fc构形的T-E分子总计可带有四至六个组件(譬如scFv、蛋白质或载药束)。在可任选的实施方式中，所述分子构建体的Fc部分亦带有Fc介导的效应功能，如ADCC和/或补体介导的活化作用。然而在某些其他应用中，不会出现此种Fc介导的效应功能。

藉由挑选本案Fc型分子构建体的T-E组件，所得到的分子构建体可用于预防和/或治疗与移植排斥相关的症状。在某些实施方式中，本揭示内容的优点还包括使用了本揭示内容提出的接合单元，因而提供了一种能够轻易控制此处提出的Fc型分子构建体的标的与效应组件数量的方法。随着所选用的标的和/或效应组件不同，本Fc型分子构建体可采用不同的构形，兹分述如下。

在本揭示内容的分子构建体中，较佳的标的或效应组件是采用以下形式：抗原结合片段(Fab)、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、单一区域抗体(sdAb)或其他抗体的抗原结合片段。根据某些较佳的实施方式，可在scFv的VL与VH间或在VH与VL间加入一多肽接合物(GGGGS)2-5。其他具有可挠性且不具坚硬二级结构的序列，例如某些人类免疫球蛋白CH1与CH2区域以及CH2与CH3区域间的连接序列。在某些视需要而采用的实施方式中，可在scFv或其他抗体片段或治疗性抗体的C-端加入多肽接合物(GGGGS)1-3与末端丝氨酸残基。硫氢基可用以和位于由接合单元延伸之连接臂末端的顺丁烯二酰亚胺基复合。

在第一类的Fc型分子构建体中，标的组件是对一HLA异型专一的抗体或其片段，而效应组件则为对CD25专一的抗体或其片段。下文讨论了此种Fc型分子构建体的某些例示性结构。

参照第2A图，其绘示了根据本揭示内容某些实施方式的Fc型分子构建体800A之结构。如图所示，Fc型分子构建体800A包含两条相同的CH2-CH3链810、连接于CH2-CH3链810之N-端的第一对效应组件E1(如，对CD25专一的scFvs)以及连接于CH2-CH3链810之C-端的第一对标的组件T1(如，对一HLA异型专一的scFvs)。

第2B图所示的Fc型分子构建体800B与第2A图所示的Fc型分子构建体800A非常相似，不同之处在于两个效应组件E1分别连接到CH2-CH3链810之C-端，而两个标的组件T1分别连接到CH2-CH3链810之N-端。

根据某些实施方式，效应组件和标的组件都连接到CH2-CH3链的N-端。举例来说,当效应组件和标的组件都是单链可变片段(scFvs)时，效应组件和标的组件可以串联或双抗体的形式相连接，因而形成连接到CH2-CH3链N-端的双专一性scFv。Fc型分子构建体800C(第2C图)包含一Fc部分，且CH2-CH3链810各有一T1-E1双专一性scFv连接于其N-端。

在某些例子中，成对的效应组件或成对的标的组件采用Fab构型(亦即，由VH-CH1区域以及VL-Cκ区域所组成)；此种Fab片段连接于CH2-CH3链的N-端，而使得Fc型分子构建体形成IgG构形。在这些情形中，成对的效应组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端。举例来说，在第3图所示的Fc型分子构建体800D中，每一标的组件T1包括VH-CH1区域820以及VL-Cκ区域825，因而形成连接于CH2-CH3链810之N-端的Fab构型830，而使得Fc型分子构建体800D形成IgG构型。在此种情形中，成对的效应组件E1连接于成对CH2-CH3链810的C-端。

如上所述，本发明提出的Fc型分子构建体可携带最多六种组件。额外的组件可以是第二对效应组件或第二对标的组件。

在第二类的的Fc型分子构建体中，标的组件是抗体或其片段(如，对一HLA异型专一的scFv)，而效应组件为蛋白或多肽(如，免疫检查点蛋白或其片段)。

第4A图绘示了根据本揭示内容某些实施方式的Fc型分子构建体1200A包含连接于成对CH2-CH3链1210之N-端的一对标的组件T1(此组件为一scFv)，以及连接于成对CH2-CH3链1210之C-端的一对效应组件E1(此组件为治疗性多肽)。或者是，在第4B图的Fc型分子构建体1200B中，成对的标的组件T1(此组件为一scFv)系连接于CH2-CH3链1210之C-端；而成对的效应组件E1(此组件为治疗性多肽)则是连接于成对CH2-CH3链1210之N-端。

在某些实施方式中，成对的标的组件采用Fab构形(即，由VH-CH1区域与VL-Cκ区域组成)；此种Fab片段系连接于CH2-CH3链的N-端，而使得Fc型分子构建体成为IgG构形。在这些情形中，成对的效应组件可连接于成对CH2-CH3区段的C-端

举例来说，在第4C图所示的Fc型分子构建体1200C中，两个标的组件T1分别包含VH-CH1区域820与VL-Cκ区域825，因而形成连接于CH2-CH3链810的N-端的Fab构形830，而使得Fc型分子构建体1200C成为IgG构形。在本例中，成对的效应组件E1是连接于成对CH2-CH3链810的C-端。

在第三类的Fc型分子构建体中，标的组件是抗体或其片段，而效应组件则为包含复数个免疫抑制物分子的载药束。

在此类情形中，用以治疗患病细胞的Fc型分子构建体的构形如第5A图的分子构建体1000A或第5B图的分子构建体1000B所示。在第5A图中，效应组件E1(如载药束)系连接于成对CH2-CH3区段1010的C-端，而标的组件T1(于本例中，scFv)则是连接到成对CH2-CH3区段1010的N-端。根据替代性的实施方式，分子构建体1000B(参见第5B图)的成对标的组件T1采用Fab 1030的构形。具体来说，Fab 1030构形包括VH-CH1区域1020以及VL-Cκ区域1025，其系连接至成对CH2-CH3区段1010的N-端，而使得Fc-型分子构建体1000A成为IgG构形。在本例中，成对的效应组件E1连接至成对CH2-CH3区段1010的C-端。

当可想见，当效应组件E1是载药束时，可利用本揭示内容所述的接合单元(参见，如第1A图至第1C图)作为载药束。根据本揭示内容的原理与精神，可分别制备标的构建体(包含成对CH2-CH3区段1010以及标的组件T1)与载药束(作为效应组件E1)，之后再将两者复合。

在根据本揭示内容任一种实施方式中，CH2-CH3链是来自人类免疫球蛋白γ1或γ4。一般来说，当想要发挥Fc介导的功能(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导活性(发炎活化或目标细胞溶解))时，可以选择γ1。当想要避免Fc介导的功能时，可以选用γ4来建构本发明Fc型分子构建体。

根据本揭示内容多个实施方式，上述载药束包含一中心核、复数个连接臂以及视需要而加入的耦合臂。根据本揭示内容多种实施方式，中心核可以是包含复数个赖氨酸(K)残基的多肽。每一连接臂的一端藉由和多肽核中K残基上的氨基侧链反应，而与中心核连接。连接臂在其自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，而每一药物分子则藉由和顺丁烯二酰亚胺基反应以透过连接臂而与中心核连接。在视需要而采用的实施方式中，每一效应组件E1是带有3至5个免疫抑制分子的载药束。

在中心核是多肽核的情形中，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基。根据某些实施方式，当多肽中心核的末端氨基酸残基带有叠氮基时，载药束可以透过发生于上述末端残基与多肽延伸段C-端之间的SPAAC或CuAAC反应而与其连接。或者是，当多肽中心核的末端氨基酸残基带有炔基时，载药束可以透过发生于上述末端残基与多肽延伸段C-端之间的CuAAC反应而与其连接。又或者是，当多肽中心核的末端残基是半胱氨酸时，载药束更包含上述耦合臂。耦合臂的一端藉由和多肽核的半胱氨酸残基反应反应，而与中心核连接。耦合臂的自由端亦带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基，而使得载药束可透过iEDDA反应(耦合臂带有四嗪基或环辛烯基时)、SPAAC反应(耦合臂带有叠氮基或环辛炔基时)、或CuAAC反应(耦合臂带有炔基或叠氮基时)而连接到多肽延伸段的C-端。

根据某些实施方式，所述用以治疗疾病的Fc-型分子构建体更包含一段多肽延伸段1050(参见，第5A与5B图)，其序列为(G2-4S)2-8C。如图所示，成对的多肽延伸段1050连接到成对CH2-CH3区段1010的C-端。多肽延伸段C-端的半胱氨酸残基透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而和耦合臂1055相连接。此外，在将其和效应组件E1(此处为一载药束)耦合之前，耦合臂的自由端(即，并未和半胱氨酸残基相连的一端)经过炔基、叠氮基、高应力炔基或四嗪基的修饰，而使得载药束可透过iEDDA反应(参见第5A图)、SPAAC(参见第5B图)或CUAAC反应(未绘示)而与其相连。

举例来说，在第5A图中，效应组件E1(此处为一载药束)的第二耦合臂1040透过iEDDA反应而连接于CH2-CH3区段1010。第5A图所示的椭圆点1045代表多肽延伸段1050与效应组件E1间，因为iEDDA反应而产生的化学键结。当可理解，iEDDA反应通常发生于四嗪基与环辛烯基(如反式-环辛烯(transcyclooctene，TCO)基)之间。

或者是，在第5B图中，效应组件E1透过SPAAC反应而连接到CH2-CH3区段1010。第5B图所示的菱形点1045代表多肽延伸段1050与效应组件E1间，因为SPAAC反应而产生的化学键结。具体来说，SPAAC反应通常发生在叠氮基与高应力炔基(如，环辛炔基，包括：二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化环辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)以及二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基)之间。

在第三类的Fc型分子构建体中，标的组件与效应组件其中一种是多肽。

当可想见，上文关于Fc型分子构建体的Fc区域与载药束的叙述亦适用于此，此处为求简洁不再赘述。

根据本揭示内容的实施方式，有足够的弹性来设计可加入之标的组件与效应组件的数目，因而能够达到较佳的标的专一性与效应活性。可先制备分别带有标的组件与效应组件的接合单元，而后再将两者接合在一起。于制备ADC时，可单独制备免疫抑制物的载药束，而不需让抗体处于严苛的化学反应环境下。相较于将药物直接复合到抗体分子上，利用此种方式能够更妥善地控制药物与抗体比例(drug toantibody ratio，DAR)。采用这种Fc型分子构建体与载药束平台可制备多种标的/效应药物分子。此处的另一个优点在于所述分子构建体中不含IgG.Fc，所以能够尽可能地降低不必要的Fc-介导效应，如补体-介导活化作用。

在讨论了本案Fc型分子构建体的基本结构之后，下文进一步说明某些由特定效应组件(们)与标的组件(们)所形成的组合。

在制备用以防止及/或治疗与一个体因接受供体移植物(如，器官、组织或细胞)而产生移植排斥相关的疾病/症状的Fc型分子构建体时，可使用对于仅存在于供体移植物之细胞上而不存在于受体细胞上的一HLA异型专一的抗体或其片段作为标的组件。

用以治疗移植排斥的效应组件可以是免疫检查点蛋白、对CD25专一的抗体片段或包含复数个免疫抑制物分子的载药束。所述的免疫检查点蛋白是涉及免疫检查点反应的蛋白，例如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，亦称为CD151)的胞外域以及程序性死亡配体1(PD-L1，亦称为CD274)的胞外域。免疫抑制物的例示性实施例包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制物，如西罗莫司与依维莫司。另一类免疫抑制物为钙调磷酸酶抑制物，如他克莫司。芬戈莫德及其衍生物(如，芬戈莫德磷酸盐)亦为适当免疫抑制物的实施例。

本发明的精髓在于采用特定标的与效应组件的组合或搭配。在较佳的实施方式中，所述分子构建体采用了Fc融合构形。本发明所属技术领域具有通常知识者当可想见，亦可利用其他分子平台来连接此处提出的标的与效应组件的组合；上述分子平台诸如多肽、蛋白质(譬如白蛋白)、聚糖、聚乙二醇以及其他类型的聚合物，只要其能够作为连接多个分子组件的结构基础即可。

本揭示内容亦有关于用以防止及/或治疗与一个体因接受供体移植物(如，器官、组织或细胞)而产生移植排斥相关的疾病/症状的方法。一般来说，上述方法涉及了对需要此一治疗的个体投予治疗有效量的Fc型分子构建体，所述Fc型分子构建体可以是根据本揭示内容各实施方式所述的任一种Fc型分子构建体。

实验例

实验例1：合成作为多肽核的多肽1(SEQ ID NO:18)、多肽2(SEQ IDNO:26)与多肽3(SEQ ID NO:19)，并将半胱氨酸残基的SH基和作为耦合臂的顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO复合

分别将合成多肽1至3(Chinapeptide Inc.，上海，中国)溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0；含50mM NaCl与5mM EDTA)，最终浓度2mM。利用1mM三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称TCEP)使溶解的多肽还原，反应温度25℃、时间2小时。将多肽和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO(Conju-probe Inc.)以1/5的莫耳比混合，并在pH 7.0、4℃的条件下反应18小时，以使半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO复合而带有功能性连接基团TCO。利用反相HPLC来纯化TCO-多肽复合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。

所述合成TCO-多肽1(如下所示)的分子量为2,078.9道耳顿。

所述合成TCO-多肽(如下所示)的分子量为2,020.09道耳顿。

所述合成TCO-多肽(如下所示)的分子量为3,381.85道耳顿。

实验例2：将作为连接臂的NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和TCO-多肽1的氨基复合以合成接合单元

将三个PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到多肽核TCO-多肽1。交联物NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺(琥珀酰亚胺-[(N-顺丁烯二酰亚胺基-丙酰胺基)-十二乙二醇]酯(succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-dodecaethyleneglycol]ester)系购自Conju-probe Inc。根据制造商的指示进行接合。将带有赖氨酸残基的多肽溶解于复合缓冲液磷酸盐缓冲液(PBS；pH 7.5)中，浓度100mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺交联物，最终浓度1mM(比起0.1mM多肽溶液，莫耳数过量10倍)。使反应混合物在室温下反应18小时。以反相HPLC纯化PEG12-顺丁烯二酰亚胺-TCO-多肽1复合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。

所述合成PEG12-顺丁烯二酰亚胺-TCO-多肽1复合物接有一条带有TCO基的耦合臂以及三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂，其分子量为4,332道耳顿。

实验例3：合成西罗莫司-甘氨酸与西罗莫司-二甘氨酸分子

西罗莫司单甘氨酸(西罗莫司-Gly)与西罗莫司二甘氨酸(西罗莫司-diGly)系依合作约定由嘉义大学应用化学系(嘉义，台湾)黄建智博士设计与制备。

于合成西罗莫司–甘氨酸(7a)与西罗莫司–二甘氨酸(7b)时，以西罗莫司(1)为反应起始物，并以咪唑为碱使其与三甲基氯硅(trimethylsilyl chloride，TMSCl)反应以得到28,40-双-邻-TMS西罗莫司(28,40-bis-O-TMS sirolimus，参见反应式6)。根据反应式6，利用咪唑与咪唑盐酸盐以选择性地移除位在28,40-双-邻-TMS西罗莫司的40-O位置上的三甲基硅基，以得到28-O-TMS西罗莫司(2)；总产率82％。以三苯甲基甘氨酸(tritylglycine(3))与三苯甲基甘胺酰基甘氨酸(tritylglycylglycine(4))将40-OH酯化，此反应以DCC为耦合剂并以DMAP为催化剂(溶剂为CH2Cl2)，以得到28-O-TMS西罗莫司–GlyTrt(5a)与28-O-TMS西罗莫司–diGlyTrt(5b)，产率分别为75％以及>99％。在酸性环境下移除化合物5a与5b中的三甲基硅基，以得到西罗莫司–GlyTrt(6a；产率99％)与西罗莫司–diGlyTrt(6b；产率85％)。以溶于三氟乙醇的HOBt将化合物6a与6b的三苯甲基去保护，以得到所欲的西罗莫司–甘氨酸(7a)与西罗莫司–二甘氨酸(7b)，产率分别为61％与27％。

试剂与起使材料于购入后直接使用，未经进一步修饰。以预先涂覆的分析盘(silica gel 60F-254；购自Merck Inc.)进行分析用薄层层析(thin-layer chromatography，TLC)。利用Merck Reagents Silica Gel 60(粒径大小0.063–0.200mm；70–230筛孔ASTM)进行管柱层析以纯化产物。利用Agilent 400-MR(400MHz)光谱仪纪录质子NMR光谱，溶剂为CD3OD或DMSO-d6。多重性(multiplicities)缩写如下：s，单重峰；d，双重峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰。利用Finnigan LCQ质谱仪测定ESI-MS质谱。利用LTQ Orbitrap XL质谱仪(Thermo Fisher Scientific)得到高分辨率质谱。根据前人揭示的方法制备三苯甲基甘氨酸(3)与三苯甲基甘胺酰基甘氨酸(4)(Nogusa et al.,1995)。

<<反应式6合成西罗莫司–甘氨酸(7a)与西罗莫司–二甘氨酸(7b)>>

28-O-TMS西罗莫司(2).在冰浴中，将三甲基硅盐酸盐(TMSCl；1.0M，于CH2Cl2中；13.0毫升；13.0毫莫耳；6.0当量)缓慢加入溶于CH2Cl2(109毫升)的西罗莫司(1；1.992克；2.179毫莫耳；1.0当量)与咪唑(0.1494克；2.194毫莫耳；1.0当量)中。在0℃下搅拌反应混合物，并以TLC监控反应过程。当反应完全后(约10分钟)，在减压环境下使溶液浓缩。利用快速管柱层析纯化残余物；洗提液为50％乙醇(溶于己烷)，以得到28,40-双-邻-TMS西罗莫司(2.261克；2.136毫莫耳)；ESI-MS:1080.62(M+Na)⁺。将所制得的28,40-双-邻-TMS西罗莫司和咪唑(2.250克；33.05毫莫耳；15当量)以及咪唑盐酸盐(3.463克；33.13毫莫耳；16当量)在CH2Cl2(218毫升)中混合。在室温下搅拌反应混合物，并以TLC监控反应过程。在反应完全后(约3小时)，在减压环境下使溶液浓缩；利用快速管柱层析纯化残余物；洗提液为50％乙醇(溶于己烷)，以得到28-O-TMS西罗莫司(2；1.772克；1.796毫莫耳)，总产率82％。ESI-MS:1008.58(M+Na)⁺.

28-O-TMS西罗莫司–GlyTrt(5a).将含有DCC(0.386克；1.87毫莫耳；6.1当量)的无水CH2Cl2溶液(5.0毫升)缓慢加入含有化合物2(0.305克；0.309毫莫耳；1.0当量)、三苯甲基甘氨酸(3；0.592克；1.87毫莫耳；6.1当量)与DMAP(0.065克；0.532毫莫耳；1.7当量)的无水CH2Cl2溶液(10毫升)中。在室温下搅拌反应混合物，并以TLC监控反应过程。在反应完全后(约3小时)，在溶液中加入水(1.0毫升)，并过滤得到白色的DBU沈淀物。以EtOAc稀释滤液并以饱和NaHCO3冲洗。以MgSO4使有机层干燥，并在减压环境下使其浓缩。利用快速管柱层析纯化残余物；洗提液为20％乙醇(溶于己烷)残基，以得到化合物5a(300毫克；0.233毫莫耳)，产率75％。

28-O-TMS西罗莫司–diGlyTrt(5b).利用与制备化合物5a相同的方式来制备化合物5b，起始物为化合物2(0.305克；0.309毫莫耳；1.0当量)、三苯甲基甘胺酰基甘氨酸(4；0.347克；0.927毫莫耳；3.0当量)、DMAP(11毫克；0.090毫莫耳；0.30当量)与DCC(0.240克；1.16毫莫耳；3.8当量)。反应所得产物为化合物5b(0.535克；0.398毫莫耳)，产率大于99％。HRMS理论值C77H107N3NaO15Si(M+H)⁺1364.7364,实测值1364.7275.

西罗莫司–GlyTrt(6a).在冰浴中，将水(2.0毫升)与0.10N HCl(0.50毫升)加入化合物5a(0.193克；0.150毫莫耳；1.0当量)的THF溶液(10毫升)中。室温下将反应混合物搅拌12小时。于溶液中加入NaHCO3(0.10M；1.0毫升)并以EtOAc稀释之。以水冲洗溶液后，利用MgSO4使其干燥，并在减压环境下使其浓缩。以管柱层析纯化残余物；洗提液为50％乙醇(溶于己烷)，以得到6a(180毫克；0.148毫莫耳)，产率99％。HRMS理论值C72H97N2O14(M+H)⁺1213.6934,实测值1213.6887.

西罗莫司–diGlyTrt(6b).利用与制备化合物6a相同的方式来制备化合物6b，起始物为化合物5b(0.535克；0.398毫莫耳；1.0当量)。反应所得产物为化合物6b(0.431克；0.339毫莫耳)，产率85％。HRMS理论值C74H100N3O15(M+H)⁺1270.7149,实测值1270.7054.

西罗莫司–甘氨酸(7a).将化合物6a(0.168克；0.138毫莫耳；1.0当量)溶于0.10M HOBt的三氟乙醇溶液(1.0毫升)中，并以TLC监控反应过程。在反应完全后(约12h)，在溶液中加入水(0.10毫升)并以EtOAc稀释之。以饱和Na2CO3冲洗溶液，利用MgSO4使其干燥，经过滤后在减压环境下使其浓缩。利用管柱层析来纯化残余物，以得到化合物7a(82毫克；0.084毫莫耳)，产率61％。HRMS理论值C53H83N2O14(M+H)⁺971.5839,实测值971.5806；¹H NMR(CD3OD)δ6.48–6.36(m,2H),6.30–6.03(m,3H),5.47(s,1H),5.42(d,1H),5.21(d,1H),5.06(d,1H),4.68(s,1H),4.15(d,1H),4.08(d,1H),3.98(d,1H),3.66(d,1H),3.56–3.50(m,1H),3.41(s,2H),3.36(s,3H),3.26(s,3H),3.12(s,3H),2.84–2.80(m,1H),2.79–2.76(m,1H),2.48–2.40(m,2H),2.35–0.90(m,52H).

西罗莫司–二甘氨酸(7b).利用与制备化合物7a相同的方式来制备化合物7b，起始物为化合物6b(0.431克；0.339毫莫耳；1.0当量)。反应所得产物为化合物7b(96毫克；0.093毫莫耳)，产率27％。¹H NMR(DMSO-d6)δ6.70–6.53(m,1H),6.48–6.22(m,2H),6.23–6.00(m,3H),5.58–5.33(m,1H),5.29–5.10(m,2H),4.98–4.84(m,2H),4.60–4.41(m,2H),4.14–4.01(m,5H),3.99–3.46(m,2H),3.76–3.46(m,3H),3.21(s,3H),3.12(s,3H),3.00(s,1H),2.94(s,3H),2.75–2.60(m,2H),2.39–2.28(m,1H),2.26–2.16(m,1H),2.15–1.75(m,3H),1.68–0.53(m,45H).

第6A图显示所合成的西罗莫司-甘氨酸(反应式6，化合物7a)的质谱分析结果。MS(ESI)理论值C53H82N2O14 971.22；实测值993.5668,对应于[M+Na]⁺。MS光谱在以下位置可观察到三个同位素峰：994.57,995.574,和996.58,对应于[M+Na+1]⁺,[M+Na+2]⁺,和[M+Na+3]⁺.

第6B图显示所合成的西罗莫司-二甘氨酸(反应式6，化合物7b)的质谱分析结果。MS(ESI)理论值C55H85N3O15 1028.27；实测值1028.6067,对应于[M+H]⁺。MS光谱在以下位置可观察到三个同位素峰：1029.6113,1030.6152,和1031.6191,对应于[M+H+1]⁺,[M+H+2]⁺,和[M+H+3]⁺.

实验例4：将西罗莫司-甘氨酸与西罗莫司-二甘氨酸分子与NHS-S-S-PEG3-迭氮连接臂复合

于本实验例中，使西罗莫司-甘氨酸以及西罗莫司-二甘氨酸分子胺基和异型双功(hetero-bifunctional)可裂解交联物NHS-S-S-PEG3-迭氮(Conju-probe Inc.)反应。

简言之，将西罗莫司-甘氨酸溶解于100％DMSO，最终浓度50mM；并将NHS-S-S-PEG3-迭氮溶解于100％DMSO，最终浓度250mM。将59.76μl的NHS-S-S-PEG3-迭氮接合物溶液加入至149.4μl的溶解之西罗莫司-甘氨酸溶液中，最终浓度5mM(相较于2.5mM的西罗莫司-甘氨酸溶液，其莫耳述过量2倍)。之后，将298.8μl的缓冲溶液(含100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)及2,480μl的100％DMSO)加入反应混合物中，使最终体积达到2,988μl。将反应混合物在室温下培育3小时，之后在真空下使溶剂蒸发。

所得产物为叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物，将其溶解于65％乙腈中；之后利用反相HPLC来纯化产物；使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为50％至100％乙腈、20分钟，流速3.0mL/min、管柱温度45℃。

第7A图显示质谱分析结果所合成的叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物(见下图)。MS(ESI)理论值C64H101N5O18S2 1292.64；实测值1314.6463,对应于[M+Na]⁺。MS光谱在以下位置可观察到三个同位素峰：1315.65,1316.6532,和1317.6559,对应于[M+Na+1]⁺,[M+Na+2]⁺,和[M+Na+3]⁺。

相似地，将西罗莫司-二甘氨酸溶解于100％DMSO，最终浓度50mM；以及将NHS-S-S-PEG3-迭氮接合物溶解于100％DMSO，最终浓度250mM。之后将46.68μl的NHS-S-S-PEG3-迭氮接合物溶液加入116.7μl溶解之西罗莫司-二甘氨酸溶液中，最终浓度5mM(相较于2.5mM的西罗莫司-二甘氨酸溶液，其莫耳述过量2倍)。之后，将233.4μl的缓冲溶液(含100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)及1,937.22μl的100％DMSO)加入反应混合物中，使最终体积达到2,334μl。将反应混合物在室温下培育3小时，之后在真空下使溶剂蒸发。利用上文所述的方法进行反相HPLC以纯化产物。

第7B图显示质谱分析结果所合成的叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-二甘氨酸复合物(见下图)。MS(ESI)理论值C66H104N5O19S2 1349.69；实测值1371.6785,对应于[M+Na]⁺。MS光谱在以下位置可观察到三个同位素峰：1372.6817,1373.682,和1374.6828,对应于[M+Na+1]⁺,[M+Na+2]⁺,和[M+Na+3]⁺。

实验例5：将芬戈莫德磷酸盐分子与NHS-PEG5-NHS交联物复合

芬戈莫德系购自Biotang Inc.(Lexington,USA)，而芬戈莫德磷酸盐则是购自KM3Scientific Corporation(新北市，台湾)。使芬戈莫德分子的NH2基和同型双功(homo-bifunctional)交联物NHS-PEG5-NHS反应，如反应式7所示。

<<反应式7芬戈莫德分子与NHS-PEG5-NHS交联物的复合>>

简言之，将芬戈莫德和同型双功交联物NHS-PEG5-NHS各自溶于100％DMSO中，两者的最终浓度分别是10mM与250mM。将6％(v/v)的碱性磷酸钠缓冲液(pH12.7)加入芬戈莫德溶液中并培育10分钟，以活化芬戈莫德的NH2基。将NHS-PEG5-NHS交联物加入至溶解的芬戈莫德溶液中，最终浓度30mM(比起10mM的芬戈莫德溶液，莫耳数过量3倍)。将反应混合物在室温下培育3小时。

将芬戈莫德磷酸盐和NHS-PEG5-NHS各自溶于100％DMSO中，两者的最终浓度分别是5mM与250mM。将NHS-PEG5-NHS交联物加入至溶解的芬戈莫德磷酸盐溶液中，最终浓度15mM(比起5mM的芬戈莫德溶液，莫耳数过量3倍)。将反应混合物在室温下培育3小时；接着加入18％(v/v)的酸性磷酸钠缓冲液以降低缓冲溶液的pH值，进而淬灭反应。在真空下使溶剂蒸发。

将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物与NHS-PEG5-芬戈莫德复合物磷酸盐分别溶于30％乙腈，之后以反相HPLC进行纯化；使用Supelco C18管柱(250mmX 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为30％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。

根据第8图的分析结果，所述合成NHS-PEG5-芬戈莫德复合物(如反应式7所示)的分子量为725.41道耳顿。

所述合成NHS-PEG5-芬戈莫德复合物磷酸盐(如下所示)的分子量为803.3道耳顿。

实验例6：将芬戈莫德分子与NHS-S-S-PEG3-迭氮连接臂复合

使芬戈莫德分子的NH2基和异型双功(hetero-bifunctional)可裂解交联物NHS-S-S-PEG3-azido(Conju-probe Inc.)以1：3的莫耳比反应。利用HPLC纯化产物叠氮-PEG3-S-S-芬戈莫德，以移除多余、未反应的芬戈莫德分子。复合与纯化的方法与上文实施例所述相近。

第9图为所合成的与叠氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物(如下所示)的质谱分析结果。MS(ESI)理论值C30H53N4O6S2 629.9007；实测值651.321,对应于[M+Na]⁺。MS光谱在以下位置可观察到三个同位素峰：652.315与653.328,对应于[M+Na+1]⁺与[M+Na+2]⁺.

实验例7：将叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物分子与DBCO-PEG4-NHS交连物复合

将叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物分子与DBCO-PEG4-NHS交联物各自溶于100％DMSO中，两者的最终浓度分别是10mM与250mM。将4μl的DBCO-PEG4-NHS交联物溶液加入50μl的叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物溶液，最终浓度4mM，以使得DBCO-PEG4-NHS与叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物的最终莫耳比为2：1。将反应混合物在室温下培育3小时以进行SPAAC反应。

第10A图为所合成的NHS-PEG4-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物(如下所示，菱形符号代表SPAAC反应的缩合产物)的质谱分析结果。MS(ESI)理论值C98H140N8O28S2 1942.33；实测值1941.9267,对应于[M+H]⁺。MS光谱在以下位置可观察到四个同位素峰：1942.9299,1943.9328,1944.9349和1945.9371,对应于[M+H+1]⁺,[M+H+2]⁺,[M+H+3]⁺,和[M+H+4]⁺。

第10B图为所合成的NHS-PEG4-PEG3-S-S-西罗莫司-二甘氨酸复合物(如下所示，菱形符号代表SPAAC反应的缩合产物)的质谱分析结果。MS(ESI)理论值C100H143N9O29S21999.38；实测值1998.9514,对应于[M+H]⁺。MS光谱在以下位置可观察到四个同位素峰：1999.9546,2000.9571,2001.9591和2002.9609,对应于[M+H+1]⁺,[M+H+2]⁺,[M+H+3]⁺,和[M+H+4]⁺。

实验例8：将叠氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子和NHS-PEG4-DBCO交联物复合

将叠氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子与NHS-PEG4-DBCO交联物各自溶于100％DMSO中，两者的最终浓度分别是10mM与250mM。将5μl的NHS-PEG4-DBCO交联物溶液加入400μl的叠氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物溶液，使得NHS-PEG4-DBCO与叠氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物的最终莫耳比为1：3.2；反应物于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5；最终浓度10mM交联物)中。将反应混合物在室温下培育3小时以进行SPAAC反应。

第11图为所合成的NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物(如下所示，菱形符号代表SPAAC反应的缩合产物)的质谱分析结果。MS(ESI)理论值C64H92N7O16S2 1278.5938；实测值1278.613,对应于[M+H]⁺。MS光谱在以下位置可观察到两个同位素峰：1279.640和1280.635,对应于[M+H+1]⁺和[M+H+2]⁺。

实验例9：将NHS-PEG4-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物与TCO-多肽2复合

将TCO-多肽2溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，最终浓度20mM；并将NHS-PEG4-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物溶解于100％DMSO中，最终浓度10mM。将1.5μl的TCO-多肽2与60μl的NHS-PEG4-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物混合，两者莫耳比为1：20(TCO-多肽2：NHS-PEG4-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物)。之后，将3.5μl的缓冲溶液(含100mM磷酸钠缓冲液(pH 10)及35μl的100％DMSO)加入反应混合物中，使总体积达到100μl；在室温下将反应混合物培育3小时。

第12A图的分析结果显示，所合成的载药束分子量为11,562道耳顿；如下图所示，此一载药束系由带有一个自由TCO官能基与一组五个西罗莫司-甘氨酸分子的接合单元所构成。

实验例10：将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物分子和TCO-多肽2与TCO-多肽3复合

将TCO-多肽2溶于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，浓度20mM；并将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物溶于100％DMSO中，浓度50mM。将TCO-多肽2与NHS-PEG5-芬戈莫德复合物以1/42的莫耳比混合，并在室温下培育3小时。接着，将额外的TCO-多肽2加入反应溶液，使其最终莫耳比为1：13.5(TCO-多肽2：NHSPEG5-芬戈莫德复合物)。再将混合物在室温下培育3小时。

第12B图的数据显示由TCO-多肽2和芬戈莫德所形成的载药束的分子量为5,069道耳顿。所合成的载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基和一组五个芬戈莫德分子的接合单元所组成。

将TCO-多肽3溶于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，浓度10mM；并将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物溶于100％DMSO中，浓度50mM。将TCO-多肽3与NHS-PEG5-芬戈莫德复合物以1/42的莫耳比混合，并在室温下反应一晚。

第12C图的数据显示由TCO-多肽3和芬戈莫德所形成的载药束的分子量为9,478.958道耳顿，这代表确实有10个芬戈莫德分子复合至TCO-多肽3接合单元上。所合成的载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基和一组十个芬戈莫德分子的接合单元所组成。

实验例11：将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物磷酸盐分子和TCO-多肽2复合

在100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，将TCO-多肽2和NHS-PEG5-芬戈莫德复合物磷酸盐以1/42的莫耳比混合，并在室温下反应3小时。

质谱分析结果显示TCO-多肽2和芬戈莫德磷酸盐形成的载药束的分子量为5,379.16道耳顿(第12D图)。所合成的载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基和一组五个芬戈莫德磷酸盐分子(p芬戈莫德，作为效应组件)的接合单元所组成。

实验例12：将NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子和TCO-多肽2复合

于本实验例中，将五个NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子连接到TCO-多肽2上。利用和上文实施例所述相似的方法，将NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子复合到TCO-多肽2赖氨酸残基的NH2基上。利用MALDI-TOF质谱分析来确认产物。

所合成的载药束(如下所示)的分子量为7,815道耳顿；其系由带有一个自由TCO官能基和一组五个芬戈莫德分子的接合单元所构成。

实验例13：利用Expi293F过表现系统制备重组人类HLA-A1-IgG1.Fc、HLA-A2-IgG1.Fc与PD-1-IgG1.Fc

将编码scFv的序列置于pG1K表现匣中。人类HLA-A1-IgG1.Fc、HLA-A2-IgG1.Fc以及PD-1-IgG1.Fc的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:27至29所示。

于利用哺乳类动物表现系统来制备重组蛋白时，使用以Expi293F^TM细胞系为基础的过度表现系统来制备。此系统使用ExpiFectamine^TM 293转染套组(Life Technologies,Carlsbad,USA)，其包含Expi293F^TM细胞株、阳离子脂质系ExpiFectamine^TM 293试剂、ExpiFectamine^TM 293转染强化剂1与2、以及表现系统所用的培养基(Gibco,New York,USA)。

将Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表现培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染当日，将带有7.5×10⁸个细胞的255毫升培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamine^TM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamine^TM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育5到6天。收集培养上清液，并使用蛋白A亲和力层析法纯化培养基中的scFv蛋白。图13A、13B与13C分别是HLA-A1-IgG1.Fc、HLA-A2-IgG1.Fc与PD-1-IgG1.Fc融合蛋白(箭头所指处)的SDS-PAGE分析结果。

实验例14：利用Expi293F过表现系统制备重组人类CTLA-4与PD-L1

重组人类CTLA-4与PD-L1的序列如SEQ ID NO:30与31所示。上述蛋白经特殊设计而在C-端带有可挠性接合物(GGGGSGGGGS)与末端的半胱氨酸残基。

根据上文实验例所述的方式使Expi293F细胞表现所建构的基因。利用亲和力层析法搭配固定之对CTLA-4专一抗体还纯化所表现的CTLA-4蛋白。利用亲和力层析法搭配固定之对PD-L1专一抗体还纯化所表现的PD-L1蛋白。

利用12％SDS-PAGE分析上述分子构建体。第14A与14B图的SDA-PAGE结果显示纯化的CTLA-4与PD-L1蛋白大小分别约为26与32kDa(如箭头所示)，和预期结果相符。

使用西方墨点法分析与侦测重组CTLA-4蛋白。简言之，以12％SDS-PAGE胶片分析50μl的纯化CTLA-4蛋白(电泳条2)，并转移至PDVF膜上。使用(CTLA-4)-IgG1Fc-(scFvαHLA-A1)蛋白作为正对照(电泳条1)。以5％BSA(于TBST中)在室温下阻断反应1小时后，加入稀释的CTLA-4专一scFv(1μg/ml)并在温和摇晃、4℃下和膜培育一夜。之后以TBST将膜润湿并冲洗三次。加入稀释的HRP-复合蛋白L(1:5000)，并和膜在室温下培育1小时，再以TBST将膜润湿并冲洗三次。接着，将膜和HRP受质溶液一起培育20分钟，再将其暴露于感光底片。

第14C图的西方墨点分析结果显示，重组人类CTLA-4可被CTLA-4专一scFv专一性地结合(如电泳条2箭头所示处)。CTLA-4专一scFv为本实验室自行制备，其制备方法如PCT专利申请公开案WO/2016112870所述。

利用ELISA来测定重组PD-L1蛋白的结合活性；在96-孔盘涂覆50μg/ml的重组PD-L1蛋白，每孔100μl。在冲洗掉过量的PD-L1并进行固相阻断后，在每孔加入100μl浓度50μg/ml的PD1-IgG1.Fc。利用HRP-复合山羊抗人类IgG.Fc来测定结合的PD1-IgG1.Fc。加入50μl的TMB受质以利显色。以50μl的1M HCl使反应终止。利用盘式分析仪测定在450nm的吸亮度。每一长条代表二重复样本的OD450吸亮度平均值。

由第14D图所示的ELISA结果可以看出重组人类PD-L1可专一结合至重组PD1-IgG1.Fc。

实验例15：利用Expi293F过表现系统制备对HLA-A1专一单抗之scFv以及对CD25专一单抗之scFv

对人类HLA-A1专一scFv的VL与VH来自单株抗体4-35-7；对CD25专一scFv的VL与VH来自达克珠单抗(dacilizumab)。衍生自上述抗体的scFv经过特殊设计而在C-端带有可挠性接合物(GGGGSGGGGS)与末端的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基的硫氢基可和位于各接合单元连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基接合。于制备对人类HLA-A1专一单抗与对人类CD25专一单抗的scFv时，使用编码上述抗体VL与VH的DNA序列并进行密码子优化(codon optimization)。合成编码以下序列的DNA序列：VL-(GGGGS)3-VH-(GGGGS)2-C。本发明各实验例中所制备的对人类HLA-A1专一单抗与对人类CD25专一单抗的scFv之氨基酸序列分别如SEQ ID NO:32与33所示。

根据上文实验例所述的方式使Expi293F细胞表现所建构的基因。收集培养上清液，并使用蛋白L亲和力层析法纯化培养基中的scFv蛋白。第15A、15B与15C图分别是纯化对人类HLA-A1专一单抗之scFv的12％SDS-PAGE、质谱与ELISA分析结果。由第15A图的SDA-PAGE结果可以看出纯化对人类HLA-A1专一单抗之scFv的大小约为25kDa(如箭头所示)，和预期结果相符。第15C图的ELISA结果显示，纯化对人类HLA-A1专一单抗之scFv可专一地和人类HLA-A1结合。对TNF-α专一的scFv为负对照组，其制备方式如PCT专利申请公开案WO/2016112870所述。

实验例16：构建与选择对人类HLA-A2专一的噬菌体-呈现人类scFv

经双方协议，由中央研究院基因体研究中心(台北，台湾)杨安绥博士研究室取得带有对人类HLA-A2专一的人类scFv之噬菌体株。GH2scFv抗体库的框架序列(framework sequence)衍生自人类IgG抗体片段，即G6抗-VEGF Fab(蛋白库编码：2FJG)，将其选殖到噬质体载体pCANTAB5E(GE Healthcare)的限制位SfiI与NotI间，上述噬质体载体带有胺苄青霉素(ampicillin)抗性基因、lacZ启动子、有助于将scFv片段分泌至培养上清液中的pelB引导序列(leader sequence)以及用于侦测的E-标签。基于寡核苷定点突变(oligonucleotide-directed mutagenesis)技术将scFv模板的VH与VL域多样化；将每一可变区域中的三个CDR同时多样化。使用带有超过10⁹个选殖株的scFv抗体库在上述实验例所制备的HLA-A2-IgG.Fc融合蛋白上进行筛选。

使用涂覆了重组人类HLA-A2-IgG1.Fc融合蛋白(每孔1μg/100μl PBS)的Maxisorp 96-孔盘(Nunc)来淘选抗-HLA-A2抗体。简言之，在室温下以阻隔缓冲液处理孔盘，阻隔缓冲液是以5％脱脂牛奶溶于PBST(带有0.1％tween-20的磷酸延缓冲液)，处理时间1小时。将阻隔缓冲液中的重组噬菌体稀释到6x10¹¹菌落形成单元(colony-forming unit，CFU)/mL的浓度后，加入经涂覆抗原的孔盘中，并温和摇晃1小时。接着以PBST剧烈地清洗孔盘十次，再以PBS冲洗六次，以移除未专一结合的噬菌体。利用0.1M HCl/甘氨酸缓冲液(pH 2.2)来冲提结合的噬菌体，并立刻以2M三碱(Tris-base)缓冲液(pH 9.0)中和冲提液。利用大肠杆菌品系ER2738(OD600＝～0.6)在37℃下进行噬菌体感染，处理时间30分钟；利用胺苄青霉素处理30分钟，以移除未受感染的大肠杆菌。在胺苄青霉素处理后，加入带有康霉素抗性的辅助噬菌体M13KO7继续培育1小时。从大肠杆菌培养物中选择可被辅助噬菌体拯救的噬菌体，将其在带有康霉素的环境中于37℃下剧烈摇晃一晚，以扩增所选的噬菌体。在PEG/NaCl中使扩增的噬菌体析出，之后再重新悬浮于PBS中，以用于下一次的选择-扩增循环。重复上述选择-扩增循环，以在人类HLA-A2上连续进行三次淘选。

经噬菌体感染的ER2738菌落盘于系列稀释后，计算其噬菌体效价，以得到每一淘选回合后每毫升的输出效价(output titer/ml；CFU/ml)。经过三回合淘选后，噬菌体输出效价由4.0E+05CFU/孔提升了2500倍而达到1.0E+09CFU/孔。第16A图显示每一回合的噬菌体输出/输入效价比。Y轴显示每一淘选回合的噬菌体输出/输入效价比。经过三回合的淘选后，阳性菌落的比例明显提升。相较于第一回合，第三回合的输出/输入效价比提高了300倍，而结合的菌落也逐渐成为抗体库中的优势族群。

实验例17：对人类HLA-A2专一的噬菌体-呈现scFv的单菌落ELISA分析

大肠杆菌品系ER2738经单一菌落噬菌体感染后，分别获取了各别噬菌体的噬质体内的所选scFv基因；在深孔中加入2YT培养液(含16g/L胰化蛋白、10g/L酵母抽出物以及5g/L NaCl；pH 7.0)以及100μg/ml胺苄青霉素，在37℃下摇晃，以将这些大肠杆菌培养到中对数期(mid-log phase)。在培养液的OD600达到1.0时，加入IPTG，使其最终浓度为1μg/ml。其后，以4,000g在4℃下将孔盘离心15分钟。

利用ELISA来进行可溶性scFv结合试验。简言之，将Maxisorp 96-孔盘(Nunc)涂覆HLA-A2(每孔0.5μg/100μl PBS)或两种阴性对照抗原(分别是人类热休克蛋白70(Hsp 70)与本实验自行制备的RSV-IgG1.Fc融合蛋白)，在4℃下摇晃18小时。在以300μl的阻隔缓冲液处理1小时后，将100μl含可溶性scFv的上清液和100μl的阻隔缓冲液混合，而后将此混和物加入经涂覆的孔盘再处理1小时。将山羊抗-E-标签抗体(与HRP复合，1：4000，型录编号AB19400，Abcam)加入孔盘处理1小时。将TMB基质(每孔50μl)加入孔盘，并于加入1N HCl(每孔50μl)使反应停止后，测量在450nm下的吸光值。

在经过三轮淘选后，共选出192株噬菌体进行本实验例的分析。其中有12株scFv和HLA-A2结合后的OD450差异大于10，进一步对编码这12株scFv的基因进行DNA定序，并识别出8种不同的DNA序列。第16B图期中一株scFv(3E10)的ELISA分析结果。scFv株3E10和HLA-A2结合的OD450为1.3，其氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。

实验例18：制备四嗪-对人类HLA-A1专一scFv

根据上文实验例合成与表现编码对人类HLA-A1专一scFv(SEQ ID NO:32)的DNA序列。将对人类HLA-A1专一单抗的scFv和10μM TCEP在室温下以温和摇晃培育4小时，以使位于C-端的半胱氨酸残基还原，以利与Mal-PEG4-四嗪(Conju-probe,Inc.)复合。利用NAP-10Sephadex G-25管柱，将经还原scFv蛋白的缓冲液置换为磷酸钠缓冲液(100mM磷酸钠(pH7.0)、50mM NaCl与5mM EDTA)。在还原反应与缓冲液交换后，使莫耳比10：1([Mal-PEG4-四嗪]：[scFv])的反应物于室温下反应一晚以进行复合。利用去盐管柱移除过量的交联物，并分析四嗪-scFv复合产物。

MALDI-TOF质谱分析结果指出四嗪-对人类HLA-A1专一scFv复合物的分子量为27,462道耳顿。用12％SDS-PAGE以考玛斯蓝(Coomassie blue)染色来分析四嗪-对人类HLA-A1专一scFv复合物的纯度。第17A与17B图分别是四嗪-对人类HLA-A1专一scFv复合物的质谱与ELISA分析结果，以未经修饰的对人类HLA-A1专一scFv为正对照组。ELISA结果显示，四嗪-对人类HLA-A1专一scFv复合物可和重组HLA-A1结合。

实验例19：将三个CTLA-4分子与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1复合

将CTLA-4和TCEP以2：1的莫耳比([TCEP]:[蛋白])在室温下以温和摇晃培育4小时，以使位于C-端的半胱氨酸残基保持还原状态，以利与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1复合。接着，利用NAP-10Sephadex G-25管柱(GE Healthcare)，将经还原的CTLA-4蛋白缓冲液置换为顺丁烯二酰亚胺-SH耦合反应缓冲液(100mM磷酸钠(pH7.0)与50mM NaCl)。在还原反应与缓冲液交换后，使莫耳比1：4([接合物]：[蛋白])的反应物于室温下反应一晚，以使其与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1核复合。

利用粒径筛析管柱S75，将与三个CTLA-4分子复合的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-TCO-多肽1复合物和游离的CTLA-4、游离的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-TCO-多肽1复合物以及与一个或两个CTLA-4分子复合的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-TCO-多肽1复合物互相分离。将纯化的产物，即-顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1-三CTLA-4复合物浓缩并以缓冲液至换为链接反应缓冲液(100mM磷酸钾；pH 7.0)。

所合成的效应接合单元如下图所示，其系由带有一个自由TCO官能基且和一组三个CTLA-4分子(作为效应组件)的接合单元所组成。

实验例20：效应接合单元的SDS-PAGE分析，此效应接合单元带有连接于TCO-多肽1上三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的三个CTLA-4分子

利用8％SDS-PAGE来分析所得到的样本，即，带有连接于TCO-多肽1核上三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的三个CTLA-4分子之效应接合单元。实验所得到的分子量与由三个CTLA-4分子接合至具有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1所得产物的理论分子量相符。将具有三条丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1和CTLA-4分子复合后的反应混合物进行SDS-PAGE分析。对产物进行10％SDS-PAGE分析，结果显示有一较弱的电泳带，其对应于与三个CTLA-4分子复合的TCO-多肽1。

实验例21：制备效应接合单元，此效应接合单元为带有三个PD-L1分子之TCO-多肽1

利用上文实验例所述之方式将人类PD-L1与接合单元复合，并进行纯化与分析产物。

第18图为将具有三条丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1和PD-L1分子复合后的反应混合物(电泳条1)进行10％SDS-PAGE分析的结果。箭头#1、#2分别是和三个及两个PD-L1分子复合之TCO-多肽1。

利用MALDI-TOF来分析所得到的样本，即，带有连接于TCO-多肽1核上三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的三个PD-L1分子之效应接合单元。实验所得到的分子量中位数与由三个PD-L1分子接合至具有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1所得产物的理论分子量相符。所合成的效应接合单元如下图所示，其系由带有一个自由TCO官能基且和一组三个PD-L1分子(作为效应组件)的接合单元所组成。

实验例22：制备效应接合单元，此效应接合单元为与三个对人类CD25专一scFv的TCO-多肽1

利用上文实验例所述之方式将对人类CD25专一scFv与接合单元复合，并进行纯化与分析产物。

所合成的效应接合单元如下图所示，其系由带有一个自由TCO官能基且和一组三个对人类CD25胞外域专一的scFv(作为效应组件)的接合单元所组成。

实验例22：制备分子构建体；此分子构建体带有作为标的组件的一个对HLA-A1专一scFv以及作为效应组件的三个CTLA-4分子

于本实验例中，使上述实验例所制得之效应接合单元的和四嗪-对人类HLA-A1专一scFv复合物的四嗪基进行iEDDA反应，而将两者接合。具体来说，所述效应接合单元带有三个CTLA-4分子以及一个自由TCO基。

根据制造商(Jena Bioscience GmbH,Jena,Germany)的说明进行四嗪-TCO接合。简言之，将100μl的标的接合单元(0.3mg/ml)加入含有效应组件的溶液中，两者的莫耳比为1.2：1([四嗪]：[TCO])。在室温下将反应混合物培育3小时。

质谱分析所得到的分子量中位数与由联合接合物分子构建体的理论分子量相符。此一产物(如下所示)是一种单一接合单元分子构建体，其具有一个对人类HLA-A1专一的scFv(作为标的组件)以及三个CTLA-4分子(作为效应组件)。

实验例23：制备分子构建体；此分子构建体带有作为标的组件的一个对HLA-A1专一scFv以及作为效应组件的三个PD-L1分子

于本实验例中，使上述实验例所制得之效应接合单元的和四嗪-对人类HLA-A1专一scFv复合物的四嗪基进行iEDDA反应，而将两者接合。具体来说，所述效应接合单元带有三个PD-L1分子以及一个自由TCO基。四嗪-TCO接合反应如上文实验例所述。

此一产物(如下所示)是一种单一接合单元分子构建体，其具有一个对人类HLA-A1专一的scFv(作为标的组件)以及三个PD-L1分子(作为效应组件)。

第19图是所得产物的反应混合物(电泳条2)之10％SDS-PAGE分析结果；所述产物为具有一个对人类HLA-A1专一的scFv(作为标的组件)以及三个PD-L1分子(作为效应组件)的单一接合物分子构建体。电泳条1显示带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1和PD-L1分子复合后的反应混合物。箭头#1(电泳条2)为单一接合物分子构建体，其具有一个对人类HLA-A1专一的scFv(作为标的组件)以及三个PD-L1分子(作为效应组件)。箭头#2、#3分别是和三个与两个PD-L1分子分子复合的TCO-多肽1。

实验例24：制备分子构建体；此分子构建体带有作为标的组件的一个对HLA-A1专一scFv以及作为效应组件的三个对人类CD25专一scFv

于本实验例中，使上述实验例所制得之效应接合单元的和四嗪-对人类HLA-A1专一scFv复合物的四嗪基进行iEDDA反应，而将两者接合。具体来说，所述效应接合单元带有三个对人类CD25胞外域专一的scFv以及一个自由TCO基。四嗪-TCO接合反应如上文实验例所述。

此一产物(如下所示)是一种联合接合物分子构建体，其具有一个对人类HLA-A1专一的scFv(作为标的组件)以及三个对人类CD25胞外域专一的scFv(作为效应组件)。

实验例25：制备分子构建体；此分子构建体带有作为标的组件的一个对HLA-A1专一scFv以及作为效应组件的五个西罗莫司-甘氨酸分子

于本实验例中，所建构的分子构建体带有一个对人类HLA-A1专一scFv与由五个西罗莫司-甘氨酸分子所组成的一载药束。利用TCO-四嗪的iEDDA反应来制备所述分子构建体。四嗪-TCO接合反应如上文实验例所述。

MALDI-TOF质谱分析显示实验所得到的分子量中位数与所得联合接合物的理论分子量相符。此一产物(如下所示)是一种联合接合物分子构建体，其具有一个对人类HLA-A1专一的scFv(作为标的组件)以及带有五个西罗莫司-甘氨酸分子的载药束(作为效应组件)。

实验例26：制备分子构建体；此分子构建体带有作为标的组件的一个对HLA-A1专一scFv以及作为效应组件的五个芬戈莫德分子

于本实验例中，所建构的分子构建体带有一个对人类HLA-A1专一scFv与由五个芬戈莫德分子所组成的一载药束。利用TCO-四嗪的iEDDA反应来制备所述分子构建体。四嗪-TCO接合反应如上文实验例所述。

实验所得到的分子量中位数与所得联合接合物的理论分子量相符。此一产物(如下所示)是一种联合接合物分子构建体，其具有一个对人类HLA-A1专一的scFv(作为标的组件)以及带有五个芬戈莫德分子的载药束(作为效应组件)。

实验例27：西罗莫司与NHS-S-S-PEG3-迭氮连接臂复合后的生物活性分析

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种蛋白激酶，其可控制T细胞活话语增生。西罗莫司亦称为雷帕霉素，可藉由和免疫亲和素抑制—FK结合蛋白(FK binding protein，FKBP12)结合而间接地抑制mTOR。雷帕霉素与FKBP12形成的复合物可和mTOR作用并抑制其使下游标的70 S6激酶(p70 S6 Kinase，p70S6K)磷酸化之功能，进而抑制细活化话与增生。

根据上文实验例所述方式合成经修饰的西罗莫司分子(包括：西罗莫司-甘氨酸、西罗莫司-二甘氨酸以及叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物)。利用人类Jurkat T细胞进行mTOR/p70S6K讯息传导路径的西方墨点分析与T细胞增生分析，以探究这些化合物的生物活性。利用细胞存活率试剂(Invitrogen)评估T细胞存活率与增生。

简言之，进行mTOR/p70S6K讯息传导路径的西方墨点分析时，将Jurkat T细胞播于6公分的细胞培养盘中，所用培养基为含10％胎牛血清的RPMI1640培养基。1小时后，将10ng/ml的IL2与100nM的西罗莫司、西罗莫司-甘氨酸、叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物或西罗莫司-二甘氨酸加入细胞共处理24小时。

之后在金裂解液(含30mM Tris–HCl(pH 7.9)、5mM EGTA、137mM NaCl、15％甘油、1％Triton X-100以及1X蛋白酶抑制物综合液)中使细胞溶解。在4℃下以14,000×g离心20分钟以收集不溶物。利用10％SDS-PAGE胶片分离细胞溶解产物样本并转移至PVDF膜(Millipore)。于室温下，以含5％BSA的PBS处理1小时，以阻断膜印迹，之后再和一级抗体、抗-磷酸-p70S6K抗体(Cell Signaling Technology,Danvers,USA)与抗-p70S6K抗体(Cell Signaling Technology)在4℃下培育一晚。在以TBST(含20mM Tris–HCl(pH 7.6)、0.8％(w/v)NaCl与0.25％Tween-20)冲洗三次后，将膜和与HRP复合的山羊抗小鼠IgG.Fc抗体(Millipore)一起培育。之后以TBST将膜冲洗三次，并利用ECL^TM西方墨点侦测试剂(Millipore)侦测免疫反应，并曝光于Fujifilm(Tokyo,Japan)上。利用Image J(NIH,Bethesda,MD,USA)对X光底片上的ECL信号进行相对定量分析。

第20A图为西方墨点分析结果，其显示西罗莫司、西罗莫司-甘氨酸、西罗莫司-二甘氨酸与叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物在Jurkat T细胞的mTOR蛋白上的作用效果。如第20A图所示，在经西罗莫司与西罗莫司衍生化合物处理的细胞中，p70S6K的磷酸化程度降低，但整体的p70S6K蛋白含量不变。此一结果显示，在经过处理的T细胞中，mTOR/p70S6K讯息传导路径会被西罗莫司衍生化合物阻断，其效果与未经修饰的西罗莫司相近。

在进行T细胞增生分析时，将Jurkat T细胞(2*10⁴/孔)播于96孔盘中，所用培养基为含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基。1小时后，加入或不加入10ng/ml的IL2继续培育。24小时候，将不同浓度(将200nM进行2倍系列稀释)的西罗莫司、西罗莫司-甘氨酸、叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物或西罗莫司-二甘氨酸加入细胞共处理24、48或72小时。利用细胞存活率试剂(Invitrogen)根据制造商的指示来评估细胞存活率与增生。

第20B图为西罗莫司、西罗莫司-甘氨酸、西罗莫司-二甘氨酸与叠氮-PEG3-S-S-西罗莫司-甘氨酸复合物的生物活性分析结果。结果显示，西罗莫司衍生化合物抑制mTOR活性的生物活性和未经修饰的西罗莫司相仿。

实验例28：芬戈莫德透过连接臂和多肽核复合后的生物活性分析

芬戈莫德是神经鞘胺醇-1-磷酸盐(sphingosine-1-phosphate，S1P)受体-1(S1P1)功能的功能性拮抗物，因此若以芬戈莫德预先处理表现S1P1受体的细胞，这些细胞不会响应后续的S1P刺激(Pedro J.et al.,2012)。芬戈莫德调控S1P1功能的能力来自其可快速将S1P1由膜内化至细胞质中的能力，这使得细胞无法响应外界的S1P信号。近来的研究结果显示，磷酸化的芬戈莫德可和S1P受体结合，并可阻断T、B淋巴细胞的输出(egress)与循环。

利用上述实验例中合成的经修饰芬戈莫德分子(NHS-PEG5-芬戈莫德复合物以及带有一个自由TCO官能基与五个芬戈莫德分子的载药束)。利用分离自人类周边血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，简称PBMC)的人类原代B细胞(primary B cell)进行S1P引发的转移盘移行分析，以探究三种化合物的生物活性。

于制备人类初代B细胞时，利用B细胞分离套组(Myltenyi Biotech)由人类PBMC分离出人类B细胞。之后，将分离的B细胞播于15公分的培养盘上，并维持于添加10％胎牛血清(Gibco)与20ng/ml IL2(Peprotech Inc.)的IMDM培养基中。

第21A图为所分离的可表现S1P1的人类B细胞之染色分析，在冰上将2x10⁵个B细胞和10μg/ml的抗-S1P1受体抗体(AbD Serotec)于含1％BSA的PBS中培育30分钟。冲洗细胞后，以FITC-复合山羊抗-小鼠IgG(以1：200的比例稀释于PBS/BSA中)在冰上于黑暗中培育30分钟。冲洗细胞后，将细胞和FITC-复合山羊抗小鼠IgG(以PBS/BSA稀释为1:200)在冰上于黑暗中培育30分钟。接着以FACS(FACSCanto II,BD Biosciences)分析细胞。

于进行趋化性分析时，将100μl经保持的人类B细胞(4x10⁵细胞)转移到1.5毫升的微量离心管中，于其中分别加入芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、NHS-PEG5-芬戈莫德复合物或带有一个自由TCO官能基与五个芬戈莫德分子的载药束，最终浓度为1与10μM，并在37℃下反应4小时。接着，将100μl经处理的B细胞加入至设有5μm孔聚酯膜嵌套(Corning)的6.5毫升转移盘之上层空间，而转移盘的下层空间含有500μl的IMDM培养基且含有最终浓度10nM的S1P分子。3小时后，收集下层空间中的移行细胞，以台酚蓝进一步染色后，利用血球计计算数目。每一次测量时，比迁移率(specific migration)的计算方式如下：[(下层细胞数目)/(下层与上层细胞总数)x 100]-(在0nM贴附时的细胞迁移百分比)]。第21B图摘要整理了比迁移细胞百分比。

第21B图为NHS-PEG5-芬戈莫德复合物与带有一个自由TCO官能基与五个芬戈莫德分子的载药束之生物活性分析结果。此一结果显示，芬戈莫德和连接臂复合后，在阻挡B细胞移行的生物活性与未经修饰的芬戈莫德相近。

实验例29：构建编码带有CTLA-4与对HLA-A1专一的scFv之双链IgG1.Fc融合蛋白的基因片段

阿巴西普(abatacept)是由人类IgG1的Fc区域和CTLA-4胞外域所形成的融合蛋白。在重组链中配置阿巴西普-(scFvαHLA-A1)，以建构双链IgG.Fc融合蛋白。透过可挠性接合物((GGGGS)3)将阿巴西普的C-端连接到对HLA-A1专一的4-35-7scFv的N-端。

对人类HLA-A1专一scFv的方向为VL-接合物-VH。VL与VH是透过亲水性接合物((GGGGS)3)而连接。IgG1.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如SEQ ID NO:35所示。

上述双链Fc-融合分子构建体CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)的构形如上图所示。

实验例30：重组双链CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白的表现与纯化

在本实验例中，将编码的基因序列置于pcDNA3表现匣中。将Expi293F细胞以每毫升2.0×10⁶个活细胞的密度播于Expi293F表现培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×10⁸个细胞的255毫升培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamine^TM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamine^TM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育7天。收集培养上清液，并使用蛋白A亲和力层析法纯化培养基中的重组双链CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白。将缓冲液置换为PBS，之后利用8％SDS-PAGE测定CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)蛋白的浓度并进行分析；参见第22A图。在约72kDa的位置观察到含Fc-融合分子构建体的主要电泳条，其大小与预期相符。

实验例31：重组双链CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白结合力的ELISA分析

于本实验例中，利用涂覆100μl的5μg/mL重组CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)蛋白的ELISA 96孔盘，以分析重组双链CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)的结合能力。利用本实验室制备的(scFvα内毒素)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)作为负对照组。

在以200μl的阻断缓冲液处理1小时后，在经涂覆孔盘中加入100μl的抗CTLA-4scFv继续处理1小时。之后，将HRP-复合蛋白L(1：5000)加入经涂覆孔盘再处理1小时。接着，加入50μl的TMB受质以利显色。以50μl的1M HCl使反应终止。利用盘式分析仪测定在450nm的吸亮度。每一长条代表二重复样本的OD450吸亮度平均值。

第22B图为本分子构建体的ELISA分析结果。由ELISA分析结果可以看出，对CTLA-4专一的scFv可专一性地与CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白结合。对CTLA-4专一的scFv为本实验室所制备，其制备方法如PCT专利申请公开案WO/2016112870所述。

接着，利用涂覆100μl的5μg/mL重组HLA-A1蛋白的ELISA 96孔盘，以分析重组双链CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)的结合能力。利用GST蛋白(中央研究院基因体研究中音林国仪博士所提供的样本)作为负对照组。

在以200μl的阻断缓冲液处理1小时后，在经涂覆孔盘中加入100μl浓度为5μg/ml的CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)继续处理1小时。之后，将HRP-复合山羊抗人IgG.Fc(1：2000)加入经涂覆孔盘再处理1小时。接着，加入50μl的TMB受质以利显色。以50μl的1M HCl使反应终止。利用盘式分析仪测定在450nm的吸亮度。每一长条代表二重复样本的OD450吸亮度平均值。

第22C图为本分子构建体的ELISA分析结果。由ELISA分析结果可以看出，CTLA-4-hIgG1.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白可与人类HLA-A1专一地结合。

实验例32：制备重组双链(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白

将人类PD-L1透过可挠性铰链区域融合到IgG4.Fc的CH2域N-端，并透过可挠性接合物((GGGGS)3)将对人类HLA-A1专一的4-35-7scFv连接到CH3域C-端，以得到PD-L1-CH2-CH3-scFv(人类γ4)重组链。

上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL与VH是透过亲水性接合物((GGGGS)3)而连接。IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如SEQ ID NO:36所示。

利用SDS-PAGE与ELISA来分析所合成的新分子构建体。第23A图的SDA-PAGE分析结果显示此一新分子构建体的重组链大小约为80kDa(如箭头所示)，和预期大小相符。

利用涂覆100μl浓度5μg/mL之(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)蛋白的ELISA 96孔盘，以分析重组(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)的结合能力。在冲洗掉过量的(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)并进行固相阻断后，在每孔加入100μl浓度50μg/ml的抗-PDL1抗体。利用HRP-复合山羊抗人类IgG.Fc来测定结合的抗-PDL1抗体。加入50μl的TMB受质以利显色。以50μl的1M HCl使反应终止。利用盘式分析仪测定在450nm的吸亮度。每一长条代表二重复样本的OD450吸亮度平均值。第23B图的ELISA分析结果显示，对人类PD-L1(MPDL3280A，中央研究院基因体研究中音杨安绥博士所提供的样本)专一单抗可专一地和(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)结合。

另外，利用涂覆100μl浓度10μg/mL之重组(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)蛋白的ELISA 96孔盘，以分析重组(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)的结合能力。在冲洗掉过量的(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)并进行固相阻断后，在每孔加入100μl浓度10μg/ml的PD1-IgG1.Fc。利用HRP-复合山羊抗人类IgG.Fc(1：2000)来测定结合的PD1-IgG1.Fc。加入50μl的TMB受质以利显色。以50μl的1M HCl使反应终止。利用盘式分析仪测定在450nm的吸亮度。每一长条代表二重复样本的OD450吸亮度平均值。第23C图的ELISA分析结果显示，重组人类(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)可专一地和重组(PD1)-hIgG1.Fc结合。以本实验室制备的(瑞替普酶)-hIgG4.Fc-(scFvα纤维素)融合蛋白作为负对照组。

利用涂覆100μl的10μg/mL人类HLA-A1蛋白的ELISA 96孔盘，以分析重组(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)对人类HLA-A1的结合能力。在冲洗掉过量的人类HLA-A1并进行固相阻断后，在每孔加入100μl浓度10μg/ml的(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)。利用HRP-复合山羊抗人类IgG.Fc来测定结合的(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)。加入50μl的TMB受质以利显色。以50μl的1M HCl使反应终止。利用盘式分析仪测定在450nm的吸亮度。每一长条代表二重复样本的OD450吸亮度平均值。第23D图的ELISA分析结果显示，重组人类(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)可专一地和重组HLA-A1结合。以GST蛋白作为负对照组。

上述双链(PD-L1)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)分子构建体的构形如下图所示。

实验例33：建构编码双链(scFvαCD25)-hIgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)融合蛋白的基因片段

CD25是来自达克珠单抗(dacilizumab)。在重组链中配置(scFvαCD25)-CH2-CH3-(scFvαHLA-A1)(人类γ4)，以建构双链IgG.Fc融合蛋白。透过短接合物(ASGGS)将对人类CD25专一的scFv之C-端融合到CH2域N-端；透过可挠性接合物((GGGGS)3)将对人类HLA-A1专一的scFv融合到CH3域C-端。

上述scFv的方向是VL-接合物-VH。scFv中的VL与VH是透过亲水性接合物((GGGGS)3)而连接。IgG4.Fc融合蛋白分子构建体之重组链的序列如SEQ ID NO:37所示。Fc融合蛋白的制备方式如上文实验例所述。

上述(scFvαCD25)-IgG4.Fc-(scFvαHLA-A1)分子构建体的构形如下图所示。

当可理解，上文实施方式的说明仅为例示，且本发明所属技术领域具有通常知识者可对其进行各种修饰。上文的说明、实验例与数据完整地说明了本发明例示性实施方式的结构与用途。虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明之保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。

序列表

<110> 张子文

朱鑫懋

林俊宇

田伟廷

杜莉云

<120> 用以治疗移植排斥的分子构建体

<130> P2960-PCT

<150> US 62/308,349

<151> 2016-03-15

<150> US 62/213,012

<151> 2015-09-01

<160> 37

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-1

<400> 1

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 2

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-2

<400> 2

Gly Ser Gly Ser

1

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-3

<400> 3

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-4

<400> 4

Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-5

<400> 5

Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-6

<400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-7

<400> 7

Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-8

<400> 8

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-9

<400> 9

Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-10

<400> 10

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-11

<400> 11

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-12

<400> 12

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-13

<400> 13

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-14

<400> 14

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-15

<400> 15

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 填充序列-16

<400> 16

Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核

<400> 17

Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys

1 5 10 15

<210> 18

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核-1

<400> 18

Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys

1 5 10 15

Gly Ser Lys

<210> 19

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核-3

<400> 19

Cys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys

1 5 10 15

Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys

20 25 30

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> Xaa是高炔丙基甘氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核

<400> 20

Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys

1 5 10 15

<210> 21

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> Xaa是高炔丙基甘氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核

<400> 21

Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys

1 5 10 15

Gly Ser Lys

<210> 22

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> Xaa是L-迭氮高丙氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核

<400> 22

Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys

1 5 10 15

Gly Ser Lys

<210> 23

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> Xaa是高炔丙基甘氨酸

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核

<400> 23

Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Cys

20

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核

<220>

<221> MOD_RES

<222> 2

<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，二个EG单元

<220>

<221> MOD_RES

<222> 4

<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，二个EG单元

<220>

<221> MOD_RES

<222> 6

<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，二个EG单元

<400> 24

Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys

1 5

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> MOD_RES

<222> 1

<223> ACETYLATION

<220>

<223> 多肽核

<220>

<221> MOD_RES

<222> 2

<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，六个EG单元

<220>

<221> MOD_RES

<222> 4

<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，六个EG单元

<220>

<221> MOD_RES

<222> 6

<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，六个EG单元

<220>

<221> MOD_RES

<222> 8

<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，六个EG单元

<220>

<221> MOD_RES

<222> 10

<223> Xaa是聚乙二醇氨基酸，六个EG单元

<400> 25

Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys

1 5 10

<210> 26

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽核-2

<400> 26

Cys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys

1 5 10 15

<210> 27

<211> 501

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HLA-A1-IgG1.Fc

<400> 27

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Lys Met Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gln Glu Thr

50 55 60

Arg Asn Met Lys Ala His Ser Gln Thr Asp Arg Ala Asn Leu Gly Thr

65 70 75 80

Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Asp Gly Ser His Thr Ile Gln

85 90 95

Ile Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr Arg Gln Asp Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Ile Thr Lys

130 135 140

Arg Lys Trp Glu Ala Val His Ala Ala Glu Gln Arg Arg Val Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Arg Cys Val Asp Gly Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Pro Pro Lys Thr His Met Thr His His

180 185 190

Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp Gly Gly Gly Ala Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

275 280 285

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

290 295 300

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

305 310 315 320

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

325 330 335

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

340 345 350

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

355 360 365

Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

370 375 380

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

385 390 395 400

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln

405 410 415

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

420 425 430

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

435 440 445

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

450 455 460

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

465 470 475 480

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

485 490 495

Leu Ser Pro Gly Lys

500

<210> 28

<211> 501

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HLA-A2-IgG1.Fc

<400> 28

Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly

1 5 10 15

Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln

20 25 30

Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg

35 40 45

Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr

50 55 60

Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr

65 70 75 80

Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln

85 90 95

Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly

100 105 110

Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu

115 120 125

Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys

130 135 140

His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu

145 150 155 160

Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys

165 170 175

Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His

180 185 190

Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe

195 200 205

Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln

210 215 220

Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr

225 230 235 240

Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg

245 250 255

Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu

260 265 270

Arg Trp Gly Gly Gly Ala Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

275 280 285

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

290 295 300

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

305 310 315 320

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

325 330 335

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

340 345 350

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

355 360 365

Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

370 375 380

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

385 390 395 400

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln

405 410 415

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

420 425 430

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

435 440 445

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

450 455 460

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

465 470 475 480

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

485 490 495

Leu Ser Pro Gly Lys

500

<210> 29

<211> 390

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PD-1-IgG1.Fc

<400> 29

Ala Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr

1 5 10 15

Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe

20 25 30

Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr

35 40 45

Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu

50 55 60

Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu

65 70 75 80

Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn

85 90 95

Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala

100 105 110

Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg

115 120 125

Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly

130 135 140

Gln Phe Gln Thr Leu Val Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Ala Ser Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu

165 170 175

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

180 185 190

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

195 200 205

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

210 215 220

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

225 230 235 240

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

245 250 255

Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

260 265 270

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

275 280 285

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn

290 295 300

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

305 310 315 320

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

325 330 335

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

340 345 350

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

355 360 365

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

370 375 380

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385 390

<210> 30

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA-4-Linker-Cys

<400> 30

Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys

35 40 45

Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr Phe Leu Asp Asp Ser

50 55 60

Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln

65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu

85 90 95

Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile

100 105 110

Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser Asp Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys

130 135

<210> 31

<211> 231

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-Linker-Cys

<400> 31

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1 5 10 15

Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu Asp Leu

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

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145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys

225 230

<210> 32

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-HLA-A1 4-35-7 scFv

<400> 32

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1 5 10 15

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Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Asp Tyr Ser Val

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100 105 110

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu

115 120 125

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Gln Arg Leu Ser

130 135 140

Cys Val Ala Ser Gly Val Pro Phe Ser Asn Tyr Ala Met Asn Trp Val

145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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225 230 235 240

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Cys

<210> 33

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> anti-CD25 scFv, Dacilizumab scFv

<400> 33

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20 25 30

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln

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180 185 190

Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Val

210 215 220

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225 230 235 240

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys

245

<210> 34

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 噬菌体展示的HLA-A2特异性scFv（3E10）

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Phe Phe Phe

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

100 105 110

Ser Ile Glu Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val

115 120 125

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

130 135 140

Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Ser Asn Gly Gly Ile His Trp Val

145 150 155 160

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Trp Pro

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 35

<211> 614

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CTLA-4-IgG1.Fc-(anti-HLA scFv)

<400> 35

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1 5 10 15

Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Thr Glu Val

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Val Thr Glu Val Cys

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile Cys Lys Val Glu Leu

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100 105 110

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115 120 125

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Leu Gly Gly Ser Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

165 170 175

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

180 185 190

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

195 200 205

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210 215 220

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

225 230 235 240

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260 265 270

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275 280 285

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

290 295 300

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

305 310 315 320

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

325 330 335

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp Leu

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu

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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Gln Arg Leu Ser Cys

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595 600 605

Leu Val Thr Val Ser Ser

610

<210> 36

<211> 711

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PDL1-IgG4.Fc-(anti-HLA scFv)

<400> 36

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1 5 10 15

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20 25 30

Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile Ile Gln

35 40 45

Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser Tyr Arg

50 55 60

Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr Arg Cys

85 90 95

Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val Lys Val

100 105 110

Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val Asp Pro

115 120 125

Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr Pro Lys

130 135 140

Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser Gly Lys

145 150 155 160

Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn Val Thr

165 170 175

Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr Cys Thr

180 185 190

Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu Val Ile

195 200 205

Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Ala Ser Gly Gly

210 215 220

Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

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Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

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Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Trp

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

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Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly

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Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Arg His Leu Asn Ser Trp Gly Gln Gly

690 695 700

Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

705 710

<210> 37

<211> 729

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> (anti-CD25 scFv)-IgG4.Fc-(anti-HLA scFv)

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met

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His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln

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Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys

130 135 140

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Arg Met His Trp Val Arg

145 150 155 160

Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser

165 170 175

Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Ile

180 185 190

Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu

195 200 205

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Gly Val

210 215 220

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser

225 230 235 240

Gly Gly Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

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Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

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Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

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305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser

485 490 495

Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser

500 505 510

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515 520 525

Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

530 535 540

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

545 550 555 560

Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Asp Tyr

565 570 575

Ser Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly

580 585 590

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

595 600 605

Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Gln Arg

610 615 620

Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Val Pro Phe Ser Asn Tyr Ala Met Asn

625 630 635 640

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645 650 655

Ser Gly Gly Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

660 665 670

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675 680 685

Asn Ser Leu Gly Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Thr

690 695 700

Tyr Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Arg His Leu Asn Ser Trp Gly

705 710 715 720

Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser

725