设计的细菌组合物的制作方法

本文公开了可用于治疗例如人类中的生态失调的细菌组合物。

背景技术：

生态失调与许多疾病有关，包括感染如艰难梭菌(clostridiumdifficile)和耐药肠球菌的感染，以及代谢性疾病如糖尿病。治疗生态失调相关病状的方法包括粪便微生物组移植(fmt)，其可以向胃肠道(gi)提供微生物。然而，粪便移植呈现多个问题，包括与安全性和例如基于鼻-十二指肠、基于经结肠镜或基于灌肠剂的方法的递送方法有关的问题，其通常需要诊所内程序并可能引入不良事件。使用fmt的治疗由于捐献移植用粪便的个体之间的可变性而具有固有地不一致的可能性。fmt方法还引入病原生物体(包括源材料中的病毒、细菌、真菌和原生生物)的感染风险。此外，可能存在与捐献粪便的稳定性和储存有关的问题，例如与细菌物种的存活有关的问题。一些使用以胶囊递送的粪便细菌的治疗需要患者服用大量胶囊，这对于患有gi疾病的人来说可能是困难的并且可能降低对完全治疗的依从性。因此，需要递送含有培养细菌的一致产品的组合物，所述培养细菌具有足够的复杂性以有效治疗生态失调或与生态失调有关的病状，例如艰难梭菌感染，例如预防或抑制感染，或者预防或抑制感染复发。如本文所用，治疗和预防可以包括减少疾病的征象或症状。

技术实现要素：

本发明涉及细菌组合物的发现，例如含有限定类型细菌的聚生体的细菌芽孢组合物，其可用于治疗生态失调。这样的聚生体在这里被称为设计的细菌组合物(dbc)。

因此，在第一方面，本发明提供了包含活细菌群体的组合物，所述活细菌群体含有以下细菌物种：表3的dbc1、dbc2、dbc3、dbc4、dbc5、dbc6、dbc7、dbc8或dbc9；或者表4的dbcs1、dbcs2、dbcs4、dbcs5、dbcs6、dbcs7、dbcs8、dbcs9、dbcs10、dbcs11、dbcs12、dbcs13、dbcs14、dbcs15、dbcs16、dbcs17、dbcs18、dbcs19、dbcs20、dbcs21、dbcs22、dbcs23或dbcs24。任选地，dbc中的一个或多个(例如每个)细菌物种的16srdna与图1中的至少一个16srdna序列具有至少97％(例如，至少98％、至少99％或100％)同一性。

在某些实施方案中，所述组合物由如本文所定义的dbc1、dbc2、dbc3、dbc4、dbc5、dbc6、dbc7、dbc8、dbc9、dbcs1、dbcs2、dbcs4、dbcs5、dbcs6、dbcs7、dbcs8、dbcs9、dbcs10、dbcs11、dbcs12、dbcs13、dbcs14、dbcs15、dbcs16、dbcs17、dbcs18、dbcs19、dbcs20、dbcs21、dbcs22、dbcs23或dbcs24的细菌物种的活菌群体组成。任选地，dbc中的一个或多个(例如每个)细菌物种的16srdna与图1中的至少一个16srdna序列具有至少97％(例如，至少98％、至少99％或100％)同一性。

在一些实施方案中，细菌物种群体能够利用图4中列出的碳源的至少90％(例如，至少95％、至少98％或100％)。

另一方面，本发明提供了组合物，其包含至少5个(例如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)物种的活细菌群体，其中所述群体物种中的至少一个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)具有选自以下的一个或多个(例如1、2、3或4个)特征：(i)利用由病原微生物利用的一种或多种碳源，(ii)产生组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂，(iii)产生吲哚或其它色氨酸代谢物，和(iv)产生在胆汁酸调节中起作用的酶。

在多个实施例中，病原微生物是艰难梭菌，并且群体包括一个或多个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)物种的活细菌，其可利用至少5个(例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)不同的艰难梭菌碳源。例如，艰难梭菌碳源可包括或选自：牛磺胆酸盐、甘氨胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐和脱氧胆酸盐。

在其它实例中，群体包括一个或多个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)物种的活细菌，其产生hdac抑制剂，例如选自以下的hdac抑制剂：丁酸盐、异戊酸盐、异丁酸盐、丙酸盐和2-甲基-丁酸盐。

在另外的实例中，群体包括一个或多个(例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)物种，其产生在胆汁酸调节中起作用的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)酶，例如选自胆汁水解酶(bsh)、3-α-羟基类固醇脱氢酶(3-α-hsdh)、7-α-羟基类固醇脱氢酶(7-α-hsdh)和12-α-羟基类固醇脱氢酶(12-α-hsdh)。

另一方面，本发明提供了组合物，其包含来自进化枝86、90、101、139、195、197、206、233、238、241、244和290中的每一个的至少一个物种，以及任选地来自权利要求202的物种。在多个实施例中，本发明的组合物包含5、6、7、8、9、10、11或12个物种的细菌。此外，在多个实施例中，组合物的至少75％(例如至少80％、85％、90％或95％)的细菌呈芽孢形式。

另一方面，本发明提供了包含如本文所述的组合物和药学上可接受的赋形剂(例如包括甘油、聚乙二醇或可可脂的药学上可接受的赋形剂)的制剂。所述制剂可以任选地以胶囊或片剂形式用于例如口服递送。

本发明还提供了药学有效量的如本文所述组合物的用途，其预防(例如降低可能性)或治疗处于生态失调风险中或诊断患有生态失调的受试者中的生态失调。在多个实施例中，组合物中细菌的总浓度为10e1至10e9。此外，组合物的细菌可以任选地以1、2、3、4或5个胶囊提供。

此外，本发明提供了治疗有效量的如本文所述组合物的用途，其用于治疗艰难梭菌感染，或预防(例如降低可能性)艰难梭菌感染，或预防(例如降低可能性)艰难梭菌感染复发。

本发明还提供了预防或治疗处于生态失调风险中或诊断患有生态失调的受试者中的生态失调的方法，其包括向所述受试者施用药学有效量的如本文所述的组合物或制剂。在多个实施例中，组合物中细菌的总浓度为10e1至10e9。此外，组合物的细菌可以任选地以1、2、3、4或5个胶囊提供。

本发明还包括治疗艰难梭菌感染或预防艰难梭菌感染或预防艰难梭菌感染复发的方法，所述方法包括施用治疗有效量的如本文所述的组合物或制剂。

在所述方法的一些实施方案中，所述组合物可用于预防感染(例如艰难梭菌感染)的复发。在一些实施方案中，所述组合物可用于减少胃肠道病原体携带，例如艰难梭菌携带或耐万古霉素肠球菌携带。

定义

本文所述的设计的细菌组合物(dbc)的“治疗有效量”可以根据诸如以下因素而改变：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及dbc在个体中引发所需应答例如改善病症的至少一种征象或症状(和任选地，所施用的任何额外药剂的作用)的能力。在一些实施方案中，治疗有效量的dbc可以预防或降低病症的至少一种征象或症状的风险。例如，在一些实施方案中，dbc可以降低与生态失调相关的感染复发的风险。生态失调可以包括健康微生物组赋予宿主的功能丧失，所述功能包括但不限于定植抗性，免受感染，免疫稳态调节，代谢功能，必需代谢物和维生素的合成，肠道蠕动或神经功能的调节，或者目前与健康微生物组相关的任何数量的其它性质和肠屏障维持。治疗有效量也是其中组合物的任何毒性或有害作用超过治疗有益作用的量。如本文所述的组合物通常以治疗有效量施用。

“携带”是指在受试者体内或身体上携带微生物的状况，例如携带病原体如艰难梭菌。

本文提及的每个专利文献和科学论文的全部公开内容以及由此引用的那些专利文献和科学论文出于所有目的明确地通过引用并入本文。

下面更具体地描述本发明的其它特征和优点。

附图说明

图1是一组与可用于dbc中的细菌相关的示例性全长16srdna序列(seqidno：1-124)。

图2是描绘使用由抗生素诱发的生态失调引起的艰难梭菌感染的鼠类模型的实验设计的图。

图3是描绘在生态失调鼠类模型中测试设计的细菌组合物(dbc)的实验结果的条形图。数据描绘了每个实验组小鼠与感染前基线相比的最小体重。

图4是示出所选dbc物种的碳源利用概况的表格，其基于在具有指示碳源的培养基中的od600，相对于在不具有碳源的基础培养基中的od600进行标准化。空单元格表示否定结果。满单元格表示所列碳源的利用。在所测试的59种碳源中，呈现仅29种被艰难梭菌利用。

图5是示出所选dbc物种的胆汁酸酶促活性的表格。

图6是示出在pyg中生长的纯培养上清液的hdac测定结果的条形图。

图7是示出hdac抑制活性与根据gc的丁酸盐浓度的比较的条形图。

具体实施方式

据报道，哺乳动物中的健康胃肠(gi)微生物组具有约300至1000种不同的细菌物种。令人惊讶的是，申请人已经发现，含有有限数量的限定细菌物种(其中一些据报道以非常低的相对量存在于人类微生物组中)的设计的细菌组合物(本文中称为“dbc”)能够提供动物胃肠道损伤的恢复或改善，例如，艰难梭菌感染(cdi)的恢复或改善。在一些实施方案中，这样的组合物可以抑制与生态失调相关的感染的复发，例如通过减少或消除在感染之前由生态失调引起的致病生物体携带。

此外，申请人已经发现了在健康人类gi微生物组中以极低水平存在的新物种，例如，在健康人类粪便中以小于2％、例如小于1％、小于0.5％、小于0.1％、小于0.01％、小于0.001％、小于0.0001％或小于0.00001％的总细菌检测到。在具体的实施例中，新物种的存在量可以小于1e9cfu/克粪便，1e6cfu/克粪便，小于1e5cfu/克粪便，小于1e4cfu/克粪便或小于1e3cfu/克粪便。令人惊讶的是，尽管这些物种在人类微生物组中的水平极低，但它们能够促进dbc的治疗或预防效用，例如治疗有效的dbc。dbc相比于使用例如直接来源于人类粪便的制剂来治疗生态失调的方法提供了改进。例如，由于人类具有可变的gi微生物组，因此人类粪便制剂中存在的生物体的数量或比例的一致性可能存在问题。此外，这样的制剂具有使接受这种治疗的患者感染病原体的风险。申请人的dbc通过在治疗组合物中包含系统发生不同的生物体来解决患者多样性的问题，所述治疗组合物增加了提供促进广泛范围患者的定植抗性所必需的功能特征的可能性。

本文所述的dbc提供了向治疗生态失调的这些问题以及治疗生态失调相关病症的其它问题提供了解决方案。

组合物

组合物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、25或30种类型的细菌。细菌类型可以是科、属、进化枝、物种或菌株。在一个实例中，组合物包含来自进化枝86、90、101、139、195、197、206、233、238、241、244和290中的每一个的至少一个物种，以及任选地进化枝202，其实例提供在下表2中。在一些实施方案中，组合物由来自进化枝86、90、101、139、195、197、202、206、233、238、241、244和290中的每一个的至少一个物种组成。

在一些实施方案中，组合物包含来自丹毒丝菌科(erysipelatrichaceae)、毛螺菌科(lachnospiraceae)、消化链球菌科(peptostreptococaceae)、梭菌科(clostridiaceae)和黄杆菌属(flavonifractor)中的每一个的至少一个细菌物种。

在一些实施方案中，组合物中的物种选自表1和/或表2中鉴定的那些物种。进化枝是进化上相关的细菌物种，因此具有共享功能特征的高度可能性。进化枝是基于使用系统发生学领域的普通技术人员所熟知的最大似然法由全长16s序列构建的系统发生树的拓扑结构来定义的。构建进化枝以确保给定进化枝中的所有otu是：(i)彼此在指定数量的自举支持节点内，以及(ii)在5％遗传相似性内。基于16s-v4序列数据，位于相同进化枝内的otu可以区分为在基因上和系统发生上不同于在不同进化枝内的otu，而属于相同进化枝内的otu密切相关。属于同一进化枝的otu在进化上密切相关。同一进化枝的成员由于其进化相关性而在例如人类肠道中所存在的微生物生态中发挥类似的功能作用。用来自同一进化枝的另一个物种取代一个物种的组合物可能具有保守的生态功能，因此可用于本发明。在一些实施方案中，组合物包含来自表1或表2中每个进化枝的一个、两个或三个物种。

组合物的一个实例是包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个选自表1和/或表2的细菌物种的组合物。在一些实施方案中，组合物由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个选自表1和/或表2的细菌物种组成。在一些实施方案中，通过与16srdna的同源性鉴定细菌物种。图1中提供了这样的16srdna序列的示例性列表。

表1

*菌株pta-123576和pta-123577于2016年10月26日保藏于美国典型培养物保藏中心(atcc)(10801universityboulevard，manassas，va20110usa)，并根据2016年11月11日的atcc信函在2016年11月8日测试了活力。

表2：进化枝的其它细菌物种

使用表1中列出的细菌物种的组合物的非限制性实例提供于表3中。

表3：设计组合物(dbc)的实例

其它dbc组合物(dbcs1-dbcs24)列于下表4中。表4示出dbcs1至dbcs24的细菌组合物，并显示dbcs1至dbcs24在测试条件下的特征。特征如下：簇iv：这些物种都不在梭菌簇iv中；无簇iv或xiva：这些物种都不在梭菌簇iv或xiva中；高移植，高流行性：在利用从健康人类粪便分离的复杂芽孢组合物的实验中，这些是高移植物的细菌物种(在复杂芽孢组合物中并且随后稍后在服用芽孢组合物的受试者中检测到的物种)和高流行性物种(hmp数据集中常见的物种)的实例；hdac活性：所有物种都产生能够抑制组蛋白脱乙酰酶活性的短链脂肪酸(丁酸盐和/或丙酸盐，和/或异丁酸盐和异戊酸盐)；无hdac活性：这些物种都不产生能够抑制组蛋白脱乙酰酶活性的短链脂肪酸(丁酸盐和/或丙酸盐和/或异丁酸盐和异戊酸盐)；bsh活性：所有物种都具有胆汁盐水解酶活性；无bsh活性：这些物种都不具有胆汁盐水解酶活性；7α-hsdh活性：所有物种都具有7-α-羟基类固醇脱氢酶活性；无7-α-hsdh活性：这些物种都不具有7-α-羟基类固醇脱氢酶活性；3-α或12-α-hsdh活性：所有物种都具有3-α/12α-羟基类固醇脱氢酶活性；在氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸上生长：所有物种都可以使用这些氨基酸作为碳源；在氨基酸丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸和缬氨酸上无生长：这些物种都不使用这些氨基酸作为碳源；吲哚产生：所有物种都可以产生吲哚或吲哚衍生物；非吲哚产生：这些物种都不能产生吲哚；在糖醇上生长：所有物种都可以使用糖醇作为碳源；在糖醇上无生长：这些物种都不能使用糖醇作为碳源；在岩藻糖上生长：所有物种都可以使用岩藻糖作为碳源；在岩藻糖上无生长：这些物种都不能使用岩藻糖作为碳源；在nag上生长：所有物种都可以使用n-乙酰葡糖胺(nag)作为碳源；在nag上无生长：这些物种被预测都不能使用nag作为碳源。预测是基于特定实验/筛选的结果。

在一些实施方案中，dbc中的所有生物体都是专性厌氧菌。在一些实施方案中，组合物中的细菌是可以在体外培养以形成芽孢并且这些芽孢可以在体外萌发的物种。在一些实施方案中，组合物中的细菌是芽孢。在一些实施方案中，组合物中的细菌呈营养期形式。应理解，细菌芽孢组合物或营养期细菌组合物意味着尽管大多数细菌呈指定形式(即芽孢或营养期)，但少数可以是不同的形式，例如在芽孢的情况下，组合物中的一些细胞可能是营养期，而在营养期细菌的情况下，一些细胞可能是芽孢形式。例如，组合物可以是至少100％、至少99％、至少97％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的芽孢，或者组合物可以是至少100％、至少99％、至少97％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％或至少75％的营养期细菌。在一些实施方案中，单个物种以营养期细菌和芽孢比率为例如74∶26、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60、30∶70和26∶74的混合物形式存在。通常使用集落形成单位(cfu)评估所述比率，但可以使用本领域已知的其它方法。呈营养期或芽孢特定形式的细菌百分比评估可截至特定剂型的组合物的制备日期或者截至所述剂型的施用日期。

在其它实施方案中，dbc包含来自表1的至少两种生物体，以及以下中的一种或多种：毛螺菌科细菌a4、毛螺菌科细菌5_1_57faa和酸奶瘤胃球菌。

组合物的另一个实例是含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种以下物种的组合物：乙二醇梭菌、马犹姆贝梭菌、海利氏梭菌、鲍氏梭菌、双孢梭菌、无害梭菌、普氏黄杆菌、球形闪烁梭菌、延长布劳特氏菌、血色苏黎世杆菌、扭曲真杆菌、肠道鼠单胞菌、毛螺菌科细菌a4、毛螺菌科细菌11041和乳清酸梭菌。

令人惊讶的是，申请人已经发现不需要提供反映健康微生物组的那些比例或者天然存在的那些比例的生物体；申请人发现包含大约相同数量的每个细菌物种(例如相同数量的体外可萌发芽孢)的dbc剂量是有效的，即使该组合物不含天然存在比例的生物体。此外，申请人不知道报告具有可检测水平的在表3和表4中提供的任何dbc中的所有生物体的任何个体人类，即申请人认为所述组合物是非天然存在的。

申请人还注意到，治疗中有效的细菌总数远低于健康人类胃肠道中的生物体总数，即，不仅在组合物中提供的物种的多样性方面，而且在所提供的生物体的总数方面，不需要为了达到治疗效果而施用完整的健康微生物组。

应理解，在这些实施例中的“由……组成”是指存在于组合物中的细菌类型。细菌制剂可含有另外的非细菌材料，例如一种或多种赋形剂(包括例如一种或多种胶囊)，水性或非水性介质(例如甘油、聚乙二醇、可可脂、水和/或缓冲剂)，以及一种或多种益生元或小分子药物。

组合物中所用的物种

一般而言，dbc中所用的物种被鉴定为基于其16srdna序列(例如，全长序列，或者一个或多个可变区序列(v1-v9，例如v4序列或v6序列))在选定的进化枝内。

在一些实施方案中，在dbc中有用的物种是具有与参考物种(例如表1或表2中鉴定的物种)的16srdna具有至少95％序列同一性(“同一性”)的全长16srdna的物种。在一些实施方案中，在dbc中有用的物种是具有与参考物种(例如表1或表2中鉴定的物种)的16srdna具有至少97％序列同一性(“同一性”)的全长16srdna的物种。在一些实施方案中，有用的物种具有与参考物种(例如表1或表2中鉴定的物种)的16srdna的v4区具有95％同一性的v4区16srdna。在一些实施方案中，有用的物种具有与参考物种(例如表1或表2中鉴定的物种)的16srdna的v4区具有97％同一性的v4区16srdna。在一些实施方案中，有用的物种具有与参考物种(例如表1或表2中鉴定的物种)的全长基因组dna具有至少95％同一性的基因组序列。在一些实施方案中，有用的物种具有与参考物种(例如表1或表2中鉴定的物种)的全长基因组序列具有至少97％同一性的基因组序列。如果在此没有提供序列，例如v4序列，则在本领域中众所周知用于鉴定这种序列的方法。图1提供了可用作参考序列的全长16srdna序列的非限制性实例。一般来说，与参考物种的同一性或同一性百分比是指与生物体中存在的至少一个16srdna序列的同一性或同一性百分比。

在一些情况下，可用于本发明的细菌物种(例如本文公开的物种)的菌株可以获自公共生物资源中心如atcc(atcc.org)、dsmz(dsmz.de)或rikenbioresourcecenter(en.brc.riken.jp)。可用于鉴定本发明的物种或其它方面的16srdna序列可以获自公共数据库，例如人类微生物组计划(hmp)网站或genbank。

确定序列同一性的方法在本领域中是已知的，并且实例在下文提供。

物种/命名信息

细菌的名称和分类经受文献中可能未反映的变化。为了方便起见，本文提供了一些细菌物种的替代名称，但不打算提供一组全面的替代名称。在一些实施方案中，物种由全部或部分16srdna序列的序列同一性鉴定，例如至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

同一性的测定

进化枝、操作分类单元(otu)、物种和菌株在一些实施方案中通过其16srdna序列进行鉴定。进化枝、otu、物种和菌株的相关性可以通过进化枝、otu、物种或菌株之间的同一性百分比来确定。参考与查询序列之间的同一性百分比可以使用本领域已知的方法来确定。下面提供了用于这种测定的方法的非限制性实例。如本文所用，两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性”来描述。

在一个实施方案中，查询序列与参考序列之间的序列同一性程度通过以下来确定：1)使用默认评分矩阵和默认空位罚分，通过任何合适的比对程序对两个序列进行比对，2)鉴定精确匹配数目，其中精确匹配是其中比对程序已经在两个比对序列中在比对中的给定位置上鉴定出相同核苷酸，以及3)用参考序列长度除精确匹配数目。

在另一实施方案中，查询序列与参考序列之间的序列同一性程度通过以下确定：1)使用默认评分矩阵和默认空位罚分，通过任何合适的比对程序对两个序列进行比对，2)鉴定精确匹配数目，其中精确匹配是其中比对程序已经在两个比对序列中在比对中的给定位置上鉴定出相同核苷酸，以及3)用两个序列中最长的长度除精确匹配数目。

在另一实施方案中，查询序列与参考序列之间的序列同一性程度通过以下确定：1)使用默认评分矩阵和默认空位罚分，通过任何合适的比对程序对两个序列进行比对，2)鉴定精确匹配数目，其中精确匹配是比对程序已经在两个比对序列中在比对中的给定位置上鉴定出相同的氨基酸或核苷酸，以及3)用“比对长度”除精确匹配数目，其中比对长度是包括序列的空位和悬垂部分的整个比对长度。

序列同一性比较通常借助于序列比较程序。这些商业或公开可用的计算机程序使用复杂的比较算法来比对两个或更多个序列，这些序列最佳反映可能导致两个或更多个序列之间的差异的进化事件。因此，这些算法以奖励相同或相似氨基酸的比对并惩罚空位插入、空位延伸和非相似氨基酸比对的评分系统操作。比较算法的评分系统包括：

i)每次插入空位时赋予罚分(空位罚分)，

ii)每次现有空位延伸额外位置时赋予罚分(延伸罚分)，

iii)在比对相同的氨基酸时赋予高分，和

iv)在比对不相同的氨基酸时赋予可变分数。

通常，使用比对程序的默认值进行序列比较。适用于确定同一性的合适计算机程序包括例如blast(blast.ncbi.nlm.nih.gov)。

在本发明的一个实施方案中，比对程序优化所选序列(例如全长、v4或v616srdna序列)全长上的比对。例如，全局比对程序是基于needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，《分子生物学杂志(jmolbiol)》，48：443-53)。这种程序的非限制性实例是可在ebi.ac.uk/tools/psa/获得的embossneedle和embossstretcher程序。

在一个实施方案中，通过全局比对程序来比对序列，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是包括序列的空位和悬垂部分的整个比对长度。在另一个实施方案中，全局比对程序使用needleman-wunsch算法，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是包括序列的空位和悬垂部分的整个比对长度。

在另一实施方案中，全局比对程序选自embossneedle和embossstretcher，并且通过鉴定由程序鉴定的精确匹配数目除以“比对长度”来计算序列同一性，其中比对长度是包括序列的空位和悬垂部分的整个比对长度。

一旦软件已产生比对，就可以计算相似性百分比(％)和序列同一性百分比。

测试候选dbc的方法

体内方法

可以使用与生态失调相关的疾病的动物模型来测试候选dbc，例如hutton等(2014，《fems微生物学快报(femsmicrobiol.lett.)》，352：140-149)，best等(2012，《肠道微生物(gutmicrobes)》，3：145-167)和chen等(2008，《胃肠病学(gastroenterology)》，135：1984-92)。下面的实施例中描述了一个这样的模型的使用。在这种模型中改善征象或症状的候选dbc可用作用于治疗例如人类中的生态失调的dbc。

组合物的特征

如本文所述，通常测试dbc在体内和/或体外抑制致病生物体生长的能力，杀死致病生物体的能力，预防或改善致病生物体的效果的能力，或其它此类合适活性。在一些实施方案中，针对细菌在组合物中、在亚组合物中或呈单独细菌时所展现的特征来选择dbc中的细菌。这些特征的实例包括抑制组蛋白脱乙酰酶，代谢胆汁酸，利用营养源(例如，靶向致病生物体所用的营养源)和代谢色氨酸以产生吲哚和其它色氨酸代谢物的能力。这些特征的细节阐述如下和下面的实施例中。

组蛋白脱乙酰酶活性

组蛋白脱乙酰酶(hdac)是可以从作为真核细胞中dna染色质结构的一部分的组蛋白的n末端中的特定位点去除乙酰基残基的酶家族(综述于davie)。组蛋白乙酰化的稳态是组蛋白乙酰转移酶(hat)乙酰化和hdac脱乙酰化平衡的结果。当hdac被抑制但hat活性持续时，组蛋白变得高度乙酰化，从而破坏高阶染色质结构并通过rna聚合酶iii刺激转录。hdac抑制在基因表达中的作用不是普遍的，因为只有2％的哺乳动物基因受到hdac抑制的影响。

肠道人类微生物组产生的一些短链脂肪酸(scfa)是hdac抑制剂。特别是丁酸盐已被鉴定为体外和体内hdac抑制剂，导致高乙酰化组蛋白h3和h4的积聚(candido等，1978《细胞(cell)》，14：105-113；boffa等，1978《生物化学杂志(jbiolchem)》，253：3364-3366；vidali等，1978《美国科学院院报(procnatlacadsciusa)》，75：2239-2243；davie.2003《营养学杂志(jnutrition)》，133：2485s-2493s)。其它scfa、丙酸盐、异丁酸盐、异戊酸盐、戊酸盐、乳酸盐和乙酸盐也抑制组蛋白脱乙酰化，但据报道不如丁酸盐有效(sealy和chalkley.1978《细胞(cell)》，14：115-121；latham等，《核酸研究(nuclacidsres)》，40：4794-4803；waldecker等，2008《营养生物化学杂志(jnutrbiochem)》，19：587-593)。据报道，丁酸盐的某些治疗作用可至少部分地通过抑制hdac来介导。这些研究清楚地表明了hdac在治疗领域的重要作用，并且将由人类微生物组产生的scfa丁酸盐和丙酸盐与经由hdac抑制的所需功能结果直接相关联。

在一些实施方案中，测定考虑赋予dbc的细菌的hdac活性。这种细菌可用于需要hdac抑制以达到治疗结果或其中scfa的作用已被鉴定的dbc中。这些选择方法的实例在实施例中提供。

申请人已经证明，细菌物种抑制hdac的能力受到提供给细菌的营养源的影响。因此，在一些适应症中，可以提供益生元作为dbc的治疗用途的一部分。至少部分地基于dbc中的细菌使用益生元作为营养源以增加scfa产生的能力来选择益生元。

吲哚和色氨酸代谢

吲哚和吲哚衍生物已经牵涉于宿主生理学中(综述于zhang和davies，2016《基因组医学(genomemedicine)》，8：46中)。例如，吲哚和吲哚-3-醛是芳烃受体(ahr)的激动剂，据报道其诱导il-22表达并增加th-17活性。此外还报道吲哚可增加上皮紧密连接抗性、粘蛋白产生和定植抗性(bansal等，2010《美国科学院院报(procnatacadsci)》，107：228-233)。吲哚-3-乙酸酯、色胺和skatol也是ahr配体(hubbard等，2015.《药物代谢与处置(drugmetabolismanddisposition)》，43：1522-35)，因此可能在宿主生物学中发挥相似的作用。吲哚-3-丙酸酯也是共生细菌的色氨酸代谢产物，是孕烷h受体(pxr)的配体。pxr活化下调tnfα并上调紧密连接蛋白，从而促进免疫稳态和改善肠屏障功能(venkatesh等，2014.《免疫(immunity)》，41：296-310；和romagnoli等，2016.《免疫学杂志(jimmunol)》，196增刊67.10)。此外，据报道，ahr激动剂可改善艰难梭菌感染在鼠类模型中的影响(julliard等，ann.srg.pmid27280500)。此外，在使用来自健康人类粪便的细菌芽孢治疗复发性艰难梭菌感染的研究中，观察到色氨酸代谢增加；色氨酸的粪便浓度降低并且一些吲哚衍生物增加(数据未示出)。

因此，申请人已经发现所选细菌能够代谢色氨酸，因此是dbc的有用添加物。下面的实施例8提供了用于鉴定和表征这些细菌的方法的实例，以及提供了这些细菌的具体实例。

碳源利用

可用于治疗或预防与病原体存在相关的病症的dbc的另一个有用特征是碳源竞争，例如将可以使用与病原体(例如艰难梭菌)所用碳源相同的一种或多种碳源的细菌包含在dbc中。实施例3a和3b提供了可以如何鉴定这种特征的实例，并且提供了可用于例如治疗或预防cdi并适用于dbc的细菌物种的实例。

制剂

在一些实施方案中，治疗包括向受试者(例如，处于艰难梭菌感染风险中，最近接受过艰难梭菌感染治疗或已被诊断患有艰难梭菌感染的患者)施用dbc，所述组合物包含dbc和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，dbc是一种口服剂型。在一些实施方案中，dbc包含作为活性组分的如本文所述的细菌聚生体与一种或多种药学上可接受的载体(赋形剂)的组合。在制备本发明的组合物时，通常将dbc与赋形剂混合，通过赋形剂稀释或以例如胶囊、小药囊、纸或其它容器形式封闭在这种载体内。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料，其充当活性组分的媒介物、载体或介质。因此，制剂可以呈以下形式：片剂，丸剂，散剂，锭剂，小药囊，扁囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂(呈固体形式或在液体介质中)，含有例如高达10重量％的活性组分的软膏剂，软胶囊，硬胶囊，凝胶帽，片剂，栓剂，溶液剂或包装散剂。合适的赋形剂包括例如pbs、甘油、可可脂或聚乙二醇。

在制备制剂时，dbc可以在与其它成分组合之前研磨以提供适当的粒度。

通过采用本领域已知的方法和形式，可以配制组合物以便在施用至患者之后提供活性组分的快速、持续或延迟释放，例如，用于在结肠中释放。

dbc可以配制成单位剂型，每种剂型含有约10²至约10⁹个芽孢，例如约10⁴至约10⁸个芽孢。术语“单位剂型”是指适合作为人类受试者和其它哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性组分以及合适的药物赋形剂。在一些情况下，多于一个单位剂型构成一剂。例如，单剂可以是一个单位剂型、两个单位剂型、三个单位剂型、四个单位剂型、五个单位剂型或更多。在一些情况下，构成单剂的单位剂型数量是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25或30个单位剂型。单剂可以是例如10³至约10⁹个芽孢，例如约10⁴至约10⁸个芽孢。在一个实例中，一剂为1、2、3或4个胶囊，剂量中包含总共10e2至10e8个芽孢。在具有多个剂型的单剂的情况下，通常在规定时期内，例如在1小时、2小时、5小时、10小时、15小时或24小时内递送剂型。

本文描述的组合物可以在宽泛剂量范围内有效并且通常以药学有效量施用。

包含本文描述的组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其它方式混合以提供剂型，例如以便于递送(例如通过改善可吞咽性)或改善向胃肠道如结肠的目标区域的递送。

在一些实施方案中，片剂或丸剂包含围绕组合物的内部组分和外部组分，所述外部组分作为所述内部组分的外壳。两种组分可以通过肠溶包衣层分隔，所述肠溶包衣层可以抵抗在胃中崩解并且允许内部组分完整地进入十二指肠或延迟释放。

在一些实施方案中，包含dbc的制剂经由鼻胃途径，通过内窥镜检查或其它合适的制剂递送方法施用于所需部位例如上肠道(例如胃和/或十二指肠)或下肠道(例如小肠和/或大肠)处或附近。有效剂量可以从体外或动物模型测试系统或临床研究得到的剂量-反应曲线推断。

此外，所述制剂可以任选地与本领域已知的抗酸剂组合施用。

治疗生态失调的方法

如本文所述的dbc可用于施用至需要治疗的受试者(例如哺乳动物，如人类)，例如预防或治疗生态失调。在一些实施方案中，哺乳动物受试者是具有一种或多种生态失调症状的人类受试者，所述生态失调症状包括但不限于不希望的病原体或不希望的分类单元如肠杆菌科或耐万古霉素肠球菌的过度生长，一种或多种关键的细菌分类单元如拟杆菌门(bacteroidetes)或厚壁菌门(firmicutes)或其属或物种的表达减少，或与健康个体相比微生物物种的多样性减少，厌氧细菌的总体丰度降低，或能够实现特定功能(例如胆汁酸代谢)的细菌的总体丰度降低。如本文所用，“治疗生态失调”包括例如治疗诸如艰难梭菌感染的生态失调相关疾病，预防复发性艰难梭菌感染，或治疗或预防耐万古霉素肠球菌感染(vre)。应理解，预防可能是指降低生态失调的风险。

在一些实施方案中，受试者在施用dbc之前接受抗生素治疗。在一些实施方案中，受试者接受抗生素治疗并且直到抗生素治疗已经过去至少一天、两天、三天、5天、一周、两周、三周或四周后并在施用dbc之前未接受dbc。在一些实施方案中，受试者接受多剂dbc以确保给药期的覆盖。在一些实施方案中，受试者在施用dbc之前具有生态失调症状。在其它实施方案中，受试者在施用dbc之前没有表现出生态失调症状，例如预防性施用dbc以降低生态失调会导致临床症状(例如病原体感染)的风险。

在一些实施方案中，施用dbc以改善以下胃肠疾病、病症或病状的影响，例如，艰难梭菌感染、炎性肠病(ibd)(例如溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)、肠易激综合征或与胃肠道生态失调相关的其它病症。在一些实施方案中，将dbc施用于表现出由例如艰难梭菌(包括复发性艰难梭菌感染)、炎性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩氏病)或结肠炎引起的腹泻或其它症状的受试者。

在一些实施方案中，dbc仅在疾病、病症或病状的改善之前施用一次。在一些实施方案中，治疗组合物以大于两天的间隔施用，例如每三天、四天、五天或六天一次，或者每周一次或少于每周一次，例如每两周一次、每三周一次、每4周一次、每六周一次、每八周一次、每十二周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次或每六个月一次。在一些情况下，根据设定的时间表间歇地施用dbc，例如每天一次、每周一次或每月一次，或者当受试者从原发性疾病复发时。在另一实施方案中，dbc长期施用于有病原体感染风险或者可能是这些病原体携带者的个体，包括将进行侵入性医疗程序(例如手术)的个体，将住院治疗的个体，住在长期护理或康复设施中的个体，由于职业而暴露于病原体的个体(牲畜和动物加工工作人员)，或可能是病原体携带者的个体(包括医院工作人员，如医师、护士和其它医疗专业人员)。在一些情况下，dbc是在使用抗生素以防止生态失调及其症状(例如抗生素相关性腹泻)发展之后施用的。

还提供了使用本文提供的治疗组合物来治疗或预防患有代谢疾病和病症或病状或者处于患上代谢疾病和病症或病状风险中的受试者的方法，所述代谢疾病和病症或病状选自糖尿病、代谢综合征、肥胖症、心脏病、自身免疫疾病、肝脏疾病和自闭症。

在实施方案中，细菌芽孢组合物通常是经肠施用的。例如，施用可以是经由吞服形式(例如，丸剂、小药囊、胶囊剂、糖浆剂等)口服施用，或通过口或鼻管(包括鼻胃、鼻空肠、口腔胃或口腔空肠)施用。在其它实施方案中，施用包括直肠施用(例如通过灌肠剂、栓剂或结肠镜检查)。dbc可以施用至胃肠道的至少一个区域，包括口腔、食道、胃、小肠、大肠或直肠。dbc可以诸如散剂、一种或多种胶囊、一种或多种片剂、凝胶或液体的药物形式口服施用。dbc也可以凝胶或液体形式通过口服途径或通过鼻胃管，或以凝胶或液体形式通过直肠途径，通过灌肠剂或通过结肠镜滴注或通过栓剂来施用。

受试者在施用dbc之前可进行结肠清洁准备。结肠清洁方法在本领域中是已知的，例如用于准备进行结肠镜检查的受试者的那些。而且，如本领域已知并且确定适合于受试者，受试者可以任选地用抗酸剂或缓冲剂处理以增加dbc施用时的胃部ph。

为了评估受试者，在施用dbc后1天至6个月的治疗后范围内评估生态失调的征象或症状。一种评估方法包括从受试者获得粪便材料并评估胃肠道中存在的微生物，例如使用16srdna或宏基因组鸟枪测序分析或本领域已知的其它分析。胃肠道细菌物种群体呈现dbc以及dbc中不存在的共生微生物的增加可以用于指示生态失调的改善。在感染的情况下，与治疗前感染实体的水平相比，用dbc处理后感染实体(例如艰难梭菌)水平的降低可用于指示dbc治疗的功效。

本说明书中的实施方案提供了实施方案的例示，并且不应该被解释为限制范围。本领域技术人员容易认识到涵盖许多其它实施方案。本公开中引用的所有出版物和专利的全部内容通过引用并入本文。如果通过引用并入的材料与本说明书相矛盾或不一致，则本说明书将优先于任何此类材料。本文对任何参考文献的引用并不是承认这些参考文献为现有技术。

等同物

所有技术特征可以单独组合成这些特征的所有可能组合。

在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，可以其它具体形式来实施本发明。因此，上述实施方案在所有方面都被认为是说明性的，而不是限制本文所述的发明。

实施例

以下非限制性实施例进一步说明了本文所述发明的实施方案。

实施例1：艰难梭菌感染(cdi)的鼠类模型

使用cdi的小鼠攻毒模型研究测试组合物的功效(chen等，2008，《胃肠病学(gastroenterology)》，135：1984-1992)。小鼠cdi模型用于证实预防感染。在该模型中，小鼠接受抗生素预处理以在肠道中产生生态失调，其增加cdi易感性。当用口服施用的艰难梭菌芽孢攻毒时，小鼠表现出cdi症状，包括体重减轻、腹泻和嗜睡，在艰难梭菌接种后2-3天出现疾病高峰。感染可能是致命的，并且死亡发生在疾病高峰期。在感染时存活的小鼠中，症状主要在接种后第6天消退。在实验持续时间内，动物被关在biobubble清洁室或同等设施中。

简言之，在第-14天至第-6天，动物(雌性c57bl/6小鼠，9-10周龄)在其饮用水中接受抗生素混合液，所述混合液由1％葡萄糖、卡那霉素(0.5mg/ml)、庆大霉素(0.044mg/ml)、粘菌素(1062.5u/ml)、甲硝唑(0.269mg/ml)、环丙沙星(0.156mg/ml)、氨苄青霉素(0.1mg/ml)和万古霉素(0.056mg/ml)组成。在第-3天，动物通过口服灌胃接受剂量为10mg/kg的克林霉素。在第-1天，将测试物品、人类粪便源芽孢制剂(研究功效对照；hbs)和fsv(人类fmt对照)在冰上解冻，在12，100rcf下离心五分钟，倾析除去上清液，并重悬在无菌pbs中。测试物品(dbc)是设计的细菌聚生体。测试物品接种物对照是无菌pbs。通过口服灌胃向动物给予体积为0.2ml的适当处理物。图2提供了研究设计的示意图。

在第0天，通过口服灌胃施用约4.5log10艰难梭菌芽孢或无菌pbs(用于初始对照组)向小鼠攻毒。通过每日评估死亡率、体重减轻和临床征象和症状(临床评分；嗜睡、梳毛(grooming)、湿尾/腹部和体温过低的评分)来评估感染及其后果。

实施例2：测试物品

申请人已经测试了约100种不同的dbc。在这种实验的一个实施例中，使用实施例1中描述的鼠类模型来评估各种口服施用的微生物芽孢制剂用于治疗/预防艰难梭菌感染(cdi)的功效。在组合物中每个单独物种为1e2至1e5范围内的估计剂量下测试9种组合物。细菌数量的估计是基于芽孢集落形成单位(scfu)测定(即来自储备液的在平板上生长的芽孢衍生集落的数量)。进行这种测定的方法在本领域中是已知的，通常包括适于物种生长的萌发剂。表3提供了一些测试的组合物(同上)。阴性对照包括仅pbs作为治疗和初始动物(未感染艰难梭菌)。阳性对照包括用健康人类粪便的浆液处理(fsv)，和用源自人类粪便的细菌芽孢群体处理(hbs)。

用艰难梭菌攻毒的未处理小鼠群组中的死亡率为至少20％。令人惊讶的是，发现一些测试组合物与从健康人类粪便制备的组合物或从健康人类粪便制备的细菌芽孢制剂(hbs)相比在鼠类模型中抑制/预防cdi方面至少同样有效。通常，所测试组合物在鼠类模型中改善艰难梭菌感染作用(例如，相比于治疗前基线的最大体重减轻(图3)、致死率和临床征象)的能力不同。观察到一些组合物在宽泛浓度范围内有效(每只小鼠每个组合物物种1e2至1e5scfu)。有效组合物的实例包括dbc4、dbc6和dbc9。

在进一步的实验中，证实与用艰难梭菌攻毒的pbs处理小鼠相比，dbc能够预防cdi相关死亡，预防cdi相关症状，并显著降低体重的负面变化。

因此，在本发明的一些实施方案中，dbc可以有效地预防或抑制由cdi感染造成的一系列特征，例如体重减轻、腹泻和死亡中的一种或多种。

这些数据表明，包含相对有限数量的特定细菌物种的设计的细菌组合物可以用作预防生态失调的治疗，如通过在鼠类模型中治疗cdi所证明。

实施例3a：碳利用

众所周知，抗生素可以破坏肠道微生物群落，从而导致定植抗性的丧失，并为病原体(包括艰难梭菌)感染奠定基础(综述于keeney等，2014《微生物学年鉴(annrevmicrobiol)》，2014年6月2日.doi：10.1146/annurev-micro-091313-103456)。在连续流模型的早期实验中提出了营养物竞争对艰难梭菌定殖抗性的贡献，其中葡萄糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸(n-乙酰神经氨酸)被鉴定为由于其它肠道生物体的分解代谢而具有有限可用性的艰难梭菌碳源(wilson和perini，1988，《感染与免疫(infectionandimmunity)》，56：2610-14)。最近，在小鼠模型中，艰难梭菌利用唾液酸与较高的艰难梭菌水平相关(ng等，2013《自然-提前在线发表(natureadvanceonlinepublication)》(2013年9月1日).doi：10.1038/nature12503)。因此，dbc的有用特征是能够利用与一种或多种艰难梭菌菌株(例如，产毒艰难梭菌菌株)所使用的碳源重叠的碳源的细菌。

在本发明的一些实施方案中，组合物的选择包括选择利用靶向病原体所使用的至少一种碳源的菌株、otu或物种。为了证明这一点，对于可有效抑制或预防艰难梭菌感染的dbc中使用的物种测试了艰难梭菌所用碳源(本文中称为“艰难梭菌碳源”)的利用。在这些实验中，确定dbc中菌株的碳源利用概况。通过测量培养物的光密度，在96孔板格式中测定在一组59种碳源上的生长。简言之，制备59种碳源的1％溶液并过滤灭菌。96孔深孔板每孔填充0.4ml的2xmcb基础培养基(组合物1x：10g/l牛肉提取物，3g/l酵母提取物，10g/l蛋白胨，5g/lnacl，6.8g/lkh2po4，2mmmgso4，0.5mmcagl2，0.1mmmncl2，0.25g/l半胱氨酸(在接种前加入，参见下文)，10mg/l氯化血红素，1mg/l甲萘醌，10.5g/lmops，ph7)。每个碳源被加入到3个孔中。为每个菌株准备两块平板。每个平板含有29种碳源，葡萄糖和3个仅含有基础培养基的孔。在接种前，将8μl的2.5％半胱氨酸溶液加入到每个孔中。

将用于接种的细菌菌株从冷冻储备液中划线到脑心浸液(bhi)平板上并在37℃温育24小时。将一菌环量的细胞材料转移到5ml预先还原的pbs中并重悬。

将8μl接种物加入到每个平板的95个孔中。每个平板上有1个孔是没有接受细胞的对照。平板用透气膜覆盖并在自封袋中在37℃下温育72小时。将来自每孔的0.2ml转移到透明的96孔平底板中，并在分光光度计中测量od600(在600nm波长下的光密度)。每个孔的od600针对仅具有基础培养基的接种孔的值进行校正。对于每个菌株计算每个碳源的平均od600。如果平均校正od600为对于给定菌株所记录的最大校正od600的≥15％，则结果被视为阳性。

每个菌株在多个碳源上生长(范围为10至30个来源)。所有菌株都可使用所测试29种中的10至24种不同的糖或糖醇进行糖解，其中仅使用组中3种糖的一种菌株除外。所有菌株都使用葡萄糖。七种菌株能够使用至少一种氨基酸(所测试的15种中)作为碳源。这些实验的数据如图4所示。

所选的dbc菌株显示能够利用由艰难梭菌使用的29种测试碳源中的26种(90％)，其包含19种所测试的碳水化合物和羧酸源中的19种(100％)。因此，在一些实施方案中，可用于处理艰难梭菌的dbc包含能够使用也被艰难梭菌所利用的碳源的细菌类型，例如本文所公开的一组碳源的至少90％。

因此，在一些实施方案中，dbc包含可以利用氨基酸和其它物质(例如，糖、糖醇、碳水化合物和羧酸)作为碳源的非致病细菌。

实施例3b：其它碳利用

对实施例3a中描述的实验进行了补充实验，以扩展可被艰难梭菌菌株使用的碳源的知识以及可用于dbc中的细菌的碳利用库。

使用一组碳源分析三种艰难梭菌菌株和12种非艰难梭菌菌株。如本文所用，除非另有说明，否则碳源包括在本文实验中作为生长底物测试的所有来源。三种艰难梭菌菌株是艰难梭菌atcc9689、艰难梭菌atcc43593和艰难梭菌atcc43255，所有这些都可从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得。

在96孔板格式中在87种不同的碳源上测试菌株的生长。该组含有在文献(hafiz和oakley.1976《医学微生物学杂志(jmedmicrobiol)》，9：129-36；wilson和perini.1988《感染与免疫(infectionandimmunity)》，56：2610-14；bergey和holt.《伯杰氏鉴定细菌学手册(bergey′smanualofdeterminativebacteriology)》.baltimore：williams&wilkins，1994；sebaihia等，2006《自然遗传学(naturegenetics)》，38：779-786)中据报道被艰难梭菌利用的34种碳源，包括氨基酸，单糖、二糖、三糖和多糖，葡糖苷和糖醇。碳源以0.5％加入到三种不同的基础培养基中(基础培养基1ssnc组合物：牛肉提取物1g/l，酵母提取物2g/l，细菌大豆胨6g/l，nacl4g/l，kh2po45.44g/l，mgso42mm，cacl21mm，mncl20.1mm，半胱氨酸盐酸盐0.25g/l，氯化血红素10mg/l，甲萘醌1mg/l，mops6.3g/l，ph7；基础培养基2sposcr组合物：牛肉提取物1g/l，酵母提取物2g/l，细菌大豆胨6g/l，nacl4g/l，kh2po45.44g/l，mgso42mm，cacl21mm，mncl20.1mm，半胱氨酸盐酸盐0.25g/l，氯化血红素10mg/l，甲萘醌1mg/l，mops8.4g/l，nahco30.4％，ph7；基础培养基3ycfa：酪胨10g/l，酵母提取物2.5g/l，半胱氨酸盐酸盐1g/l，氯化血红素10mg/l，atcc维生素溶液10ml/l，atcc微量元素溶液10ml/l，k2hpo40.45g/l，kh2po40.45g/l，(nh4)2so40.9g/l，mgso4x7h2o90mg/l，cacl290mg/l，乙酸33mm，丙酸9mm，异丁酸1mm，异戊酸1mm，戊酸1mm，ph7)。

通过测量600nm处的光密度并将其与未添加碳源的基础培养基中的生长相比较来对阳性生长进行评分。对于两者，此外通过测量与每种培养物的废培养基混合的ph指示剂酚红在558nm处的光密度对基础培养基酸产生进行评分。

所有三种艰难梭菌菌株都代谢多种碳源；所测试的87种碳源中有53种被至少一种菌株利用(表5)。所有三种菌株都可使用不同的糖或糖醇仅糖解，并且所有三种菌株都使用氨基酸作为碳源(表5和表6)。如上所述，据报道被艰难梭菌利用的四种碳源对于在该测定法中测试的三种艰难梭菌菌株没有命中(淀粉、蔗糖、糖原和半乳糖醇)，该组中的其它23种碳源对于三种艰难梭菌菌株中的至少一种具有至少一次命中，使得检测的艰难梭菌碳源总数达到53。

在该测定法中被艰难梭菌使用的53种碳源中，所测试的个别细菌菌株在至少一种基础培养基中使用16至29种。非艰难梭菌菌株的碳源利用模式与碳源重叠范围30-55％的艰难梭菌菌株的碳源利用模式不同。所有测试的细菌菌株总共可以利用艰难梭菌所使用的53种碳源中的52种(98％)。这些数据表明非艰难梭菌细菌菌株可以利用多种艰难梭菌碳源。能够与病原体竞争多种碳源的细菌的这种特征对于设计dbc是有用的，例如通过将可以利用也可以被艰难梭菌使用的多种碳源的细菌包括在dbc中。

表6的数据表明，dbc的一个有用特征是包含可以一起利用多种碳源的细菌，特别是考虑到艰难梭菌的不同菌株对碳源利用的可变性。

据报道被艰难梭菌利用但在该实验中为阴性的碳源各自被至少四个非艰难梭菌菌株利用。因此，即使当病原体的多种菌株进行碳源利用表征时，可能希望具有广泛的碳利用概况的dbc甚至涵盖一些未被测试艰难梭菌菌株使用的来源。

这些数据表明，所选细菌菌株可以利用多种艰难梭菌碳源，包括单糖、二糖、三糖和多糖，糖醇，糖苷，羧酸，醇，胆汁盐和氨基酸。已报道释放微生物群的宿主糖例如唾液酸可促进感染动物模型中艰难梭菌的扩增。乙醇胺是另一种宿主源化合物，它可以赋予病原体在gi环境中的竞争优势，并且艰难梭菌具有乙醇胺利用的操纵子(ng等，《自然-提前在线发表(natureadvanceonlinepublication)》(2013年9月1日).doi：10.1038/nature12503；garsin，《自然评论：微生物学(natrevmicrobiol.)》，2010年4月；8(4)：290-5.doi：10.1038/nrmicro2334)。在这些实验中，艰难梭菌被证实能代谢唾液酸和乙醇胺。因此，在一些情况下，可利用例如唾液酸和/或乙醇胺的dbc菌株是有用的。12个选定菌株中的8个和3个菌株也分别能够利用唾液酸和乙醇胺。这些数据支持其中碳源竞争可能有助于dbc的艰难梭菌疗效机制的模型，所述dbc包含能够利用唾液酸和乙醇胺的细菌。

表5.所测试的三种艰难梭菌菌株使用的碳源和对于给定碳源测试为阳性的菌株数量

表6：艰难梭菌和所选非艰难梭菌菌株的碳源利用概况的比较。左栏表示碳源。“+”和“w”分别是指碳源的“阳性”和“弱”利用。在所测试的87种碳源中，呈现有53种被艰难梭菌利用。空白框表示没有可检测的生长；所有碳源都针对所有菌株进行测试。

实施例4：胆汁酸代谢/薄层色谱分析

次级和三级胆汁酸的产生源于初级胆汁酸通过由特定细菌酶催化的一系列反应的连续修饰(例如ridlon等，2006，《脂质研究杂志(jlipidres)》，47：241-259)。为了引起疾病，艰难梭菌芽孢首先在宿主胃肠道中萌发，并且某些胆汁酸可促进艰难梭菌芽孢萌发。另外，营养期艰难梭菌生长受到某些胆汁酸代谢物的限制。因此，dbc的有用功能特征是能够催化将促进艰难梭菌萌发的胆汁酸库转化为不促进艰难梭菌萌发和/或抑制艰难梭菌萌发或生长的库。例如，在一些实施方案中，将能够表达可将促进艰难梭菌的胆汁酸转化为不促进艰难梭菌萌发的胆汁酸的酶的细菌包括在dbc中。包含这种细菌的组合物可用于治疗或预防艰难梭菌感染；例如预防艰难梭菌感染的复发。在一个实例中，选择用于dbc的细菌可以表达至少一种、两种或三种在胆汁酸调节中关键的酶活性，例如胆汁盐水解酶(bsh)、羟基类固醇脱氢酶(7、3或12α-hsdh)和7α-脱羟基酶。在下文的非限制性实施例中提供了鉴定这些细菌的方法。

使用薄层色谱法(tlc)的胆汁盐水解酶(bsh)活性筛选

结合型胆汁酸的脱结合由胆汁盐水解酶(bsh)催化，所述酶由从人类和动物胃肠道分离的一些细菌物种表达。多种细菌物种如梭菌纲(clostridia)、拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌(bifidobacteria)和乳酸杆菌(lactobacilli)可表达功能性bsh。脱结合是胃肠微生物组进一步加工结合型胆汁酸的必要步骤，因此在形成胃肠道的胆汁酸组成方面起着重要作用。一些结合型胆汁酸已显示促进艰难梭菌芽孢萌发，因此降低其浓度可能是有益的。

在用于测试候选dbc细菌展示bsh活性的能力的实验中，使细菌生长24至48小时以产生足够的生物量。对于所选的细菌菌株，取决于所测试的菌株，在脑心浸液(bhi)琼脂或布鲁氏菌血琼脂(bba)上产生划线平板。将菌苔重悬在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中以产生均质悬浮液，然后将其用于bsh测定。为了测定bsh活性，将细菌悬浮液与四种不同的结合型胆汁酸分别温育，每种胆汁酸浓度为5mg/ml。在厌氧条件下，将菌株与相应的胆汁酸一起在37℃温育4小时。在该测定法中测试的胆汁酸包括甘氨胆酸(甘氨胆酸盐；gca)、牛磺胆酸(牛磺胆酸盐；tca)、甘氨鹅脱氧胆酸(甘氨鹅脱氧胆酸盐；gcdca)和牛磺鹅脱氧胆酸(牛磺鹅脱氧胆酸盐；tcdca)。

温育后，将平板短暂离心以使细菌沉淀，并且将来自每个孔的上清液上样到二氧化硅涂覆的tlc板上。样品在缓冲液(苯∶异丙醇∶乙酸；30∶30∶1)中进行色谱分离，并使用本领域已知的方法用对甲氧基苯甲醛染色剂显色。通过在tlc板上作为另外的条带出现的脱结合胆汁酸产物的形成来确定bsh活性。通过与每个tlc板上平行操作的已知标准物的比较来验证胆汁酸。

使用薄层色谱法(tlc)的羟基类固醇脱氢酶(hsdh)活性筛选

通过由细菌酶催化的反应将脱结合的次级胆汁酸进一步修饰成被某些人称为三级胆汁酸者。这包括通过对7-、3-或12-羟基基团具特异性的细菌hsdh酶的活性将胆汁酸氧化成其酮形式。hsdh酶可存在于许多消化道细菌物种中，包括例如梭菌纲、瘤胃球菌属和埃格特菌属(eggerthella)(tanaka等，1999，《奶制品科学杂志(jdairysci)》，82：2530-2535；baron等，1991，《细菌学杂志(jbact)》，173：4559-4569)。

使用tlc的7α-hsdh活性测定

将用于包含在dbc中的所选细菌候选物如上所述生长并重悬。为了测定7α-hsdh活性，将细菌悬浮液与各自浓度为200μm的胆酸(胆酸盐；ca)或鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸盐；cdca)在37℃下有氧温育4小时。利用每种菌株分别测试每种胆汁酸。

温育后，将平板短暂离心以使细菌沉淀，并且将来自每个孔的上清液上样到二氧化硅涂覆的tlc板上。样品在缓冲液(苯∶二氧己环∶乙酸；70∶20∶4)中进行色谱分离，并使用本领域已知的方法用钼酸铈铵染色剂显色。通过在tlc板上作为另外的条带出现的预测的7-氧代-胆汁酸产物的形成来确定hsdh活性。通过与每个tlc板上平行操作的已知标准物进行比较来验证胆汁酸。结果如图5所示。

使用tlc的3α-hsdh活性测定

细菌在适当的培养基平板上生长24至48小时以产生足够的生物量。对于候选细菌菌株，使划线平板在bhi琼脂上生长。将菌苔重悬在pbs中以产生均质悬浮液，然后将其用于hsdh测定。为了测定3α-hsdh活性，将细菌悬浮液与各自浓度为100μm的胆酸、脱氧胆酸(脱氧胆酸盐；dca)或鹅脱氧胆酸在37℃下有氧温育18-24小时。利用每种菌株分别测试每种胆汁酸。

温育后，将平板短暂离心以使细菌沉淀，并且将来自每个孔的上清液上样到二氧化硅涂覆的tlc板上。样品在缓冲液(苯∶二氧己环∶乙酸)中进行色谱分离，并且首先用磷钼酸染色剂显色以使用本领域已知的方法检测氧代胆汁酸产物的形成。然后使用在新鲜tlc平板上进行的第二次操作，对显示hsdh活性的候选菌株特异性测试3-氧代hsdh活性。用对甲氧基苯甲醛染色剂使第二组平板显色以区分3-氧代胆汁酸(染色的粉红色)与其它条带(devlin等，2015，《自然化学生物学(natchembiol)》，doi：1-.1038/nchembio.1864)。在tlc板上作为另外的条带出现的预测的3-氧代-胆汁酸产物的形成证实菌株中存在3α-hsdh活性。通过与每个tlc板上平行操作的已知标准物进行比较来验证胆汁酸。结果如图5所示。

结果

总体而言，在胆汁酸活性测定中测试的十二种细菌物种中有十种根据tlc显示三种胆汁酸代谢活性中的至少一种，即bsh、7α-hsdh或3α-hsdh活性(图5)。在图5中，暗框代表代谢特定指示底物的活性的阳性结果。明框代表使用这种方法没有检测到阳性结果。申请人指出，如下文实施例5所示，使用更灵敏的方法如lcms，可以揭示其它的较低水平的活性。

令人惊讶的是，这些数据还表明，每个酶活性类型中可能存在不同的底物特异性。例如，只有血色苏黎世杆菌显示出将所测试的所有四种结合型胆汁酸脱结合的能力，并且肠道鼠单胞菌是唯一对所测试的所有三种胆汁酸显示出3α-hsdh活性的测试物种。

这些数据表明可用于选择将包含在dbc中的细菌聚生体的方法，所述dbc将提供高水平的一种或多种胆汁酸代谢活性，从而改变可用于促进艰难梭菌萌发或者抑制艰难梭菌萌发或生长的胆汁酸库。

可以使用其它评估胆汁酸活性的方法，例如lcms方法。

实施例5：胆汁酸代谢/使用lc-ms测定

为了相比于tlc方法提高与胆汁酸代谢有关的酶活性检测的灵敏度，使用了利用液相色谱质谱法(lcms)的方法。使用基于液相色谱-质谱(lc-ms)的方法(kakiyama等，2014《脂质研究杂志(jlipidres)》，55：978-990)可以准确鉴定和定量胆汁酸和其它小分子。对于大多数胆汁酸，tlc测定显示10-50um范围内的检测下限，而lc-ms方法将此检测下限扩展至50-100nm，在许多情况下将灵敏度提高了100倍以上。

评估gi微生物组中的次级胆汁酸代谢

胆汁盐水解酶(bsh)活性的lc-ms筛选

次级和三级胆汁酸的产生源于初级胆汁酸通过由特定细菌酶催化的一系列反应的连续修饰。该过程的第一步，导致从初级胆汁酸中去除甘氨酸或牛磺酸基团以释放游离的未结合的胆汁酸，称为脱结合。初级胆汁酸的脱结合由胆汁盐水解酶(bsh)催化。脱结合是肠道微生物组进一步加工次级胆汁酸的必要步骤，因此在形成肠道的胆汁酸组成方面起着重要作用。

为了进行该测定，简言之，使细菌在许可的琼脂培养基平板上生长24至48小时以产生足够的生物量来进行测定。将菌苔重悬于pbs中以产生均质悬浮液，然后将其用于bsh测定。为了测定bsh活性，将细菌悬浮液与各自浓度为150μg/ml的四种不同的结合型胆汁酸的两种不同混合物在厌氧条件下在37℃下温育4小时。然后用等体积的乙腈萃取反应混合物，短暂离心以使细菌沉淀，并且将上清液通过0.2μm过滤器过滤以生成用于lc-ms分析的样品。使用与brukercompactqtofms偶联的agilent1260hplc来测定胆汁酸。使用乙腈：水缓冲系统在双齿c18柱上运行样品以分离胆汁酸，然后将胆汁酸以阴性模式离子化并使用qtof-ms鉴定。通过脱结合胆汁酸产物的形成来确定bsh活性，所述脱结合胆汁酸产物通过与已知标准物比较来验证并且必要时使用标准曲线定量。在该测定法中测试的初级胆汁酸包括甘氨/牛磺胆酸、甘氨/牛磺鹅脱氧胆酸和甘氨/牛磺鼠胆酸。

羟基类固醇脱氢酶(hsdh)活性的lc-ms筛选

通过由细菌酶催化的反应将脱结合的次级胆汁酸进一步修饰成三级胆汁酸。这包括通过对7-、3-或12-羟基基团具特异性的细菌hsdh酶的活性将胆汁酸氧化成其酮形式。

为了测定hsdh活性，如上所述制备细菌悬浮液以用于lc-msbsh测定。为了测定hsdh活性，首先将细菌悬浮液与各自75μg/ml的胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氧胆酸和石胆酸的混合物在厌氧条件下在37℃下温育18至24小时。然后将测定板从厌氧室中取出，并在37℃下有氧温育4小时以促进胆汁酸的氧化。一旦温育完成，用等体积的乙腈提取反应混合物，短暂离心以使细菌沉淀，并且将上清液通过0.2μm过滤器过滤以产生准备进行lc-ms分析的样品。如上文关于lc-msbsh测定所述来测定样品中的胆汁酸。hsdh活性由酮-胆汁酸产物的形成确定，所述产物通过与已知标准物比较来验证并且在必要时使用标准曲线进行定量。

7a-脱羟基化(7α-oh)活性的lc-ms筛选

除了氧化之外，次级胆汁酸也可以通过除去7α位上的羟基基团而进行修饰，导致产生三级胆汁酸。这包括将胆酸转化为脱氧胆酸，并且将鹅脱氧胆酸转化为石胆酸。7α-脱羟基化反应由包括许多仍未表征的酶的多步骤过程催化。

如上所述制备细菌悬浮液以用于lc-msbsh筛选。为了测定脱羟基化活性，将细菌悬浮液与胆酸和鹅脱氧胆酸各自为150μg/ml的混合物在37℃下在厌氧条件下温育18至24小时。该步骤对于诱导参与反应的酶是必需的。然后将测定板从厌氧室中取出并在37℃下有氧温育4小时以促进胆汁酸的脱羟基化。温育完成后，反应混合物用等体积的乙腈提取，短暂离心以使细菌沉淀，并且将上清液通过0.2μm过滤器过滤以产生准备用于lc-ms分析的样品。如上所述使用lc-ms分析胆汁酸。7α-oh活性通过脱氧胆酸和石胆酸的形成来确定，所述脱氧胆酸和石胆酸通过与已知标准物比较来验证并且在必要时使用标准曲线进行定量。

结果

表7和表8提供了各种细菌菌株的胆汁酸产生的lc-ms分析结果。表7列出了表9中提到的菌株子集的lc-ms胆汁酸分析结果，证明了基于lc-ms的测定法可提高灵敏度和覆盖率。表8基于lc-ms分析描述了许多额外菌株的胆汁酸活性。在表中，‘+’表示产物胆汁酸水平增加超过50倍，表明强活性，‘+/-’表示产物胆汁酸水平变化≤50倍，表明弱活性，而‘-’表明在测试条件下完全缺乏活性。具有已知/已公开活性的菌株被用作对照以监测每种反应类型。

一般而言，使用lc-ms分析细菌物种的胆汁酸代谢产生的数据与使用tlc获得的数据一致。然而，lc-ms方法的灵敏度提高揭示了另外的活性；例如乙二醇梭菌通过tlc证明对gcdca没有bsh活性，但lc-ms分析的分辨率增加表明细菌确实保留了对gcdca的bsh活性。另外，lc-ms方法允许表征另外的活性即7α-脱羟基化，其以前难以通过tlc分辨。

这些数据表明在设计细菌组合物，例如设计dbc以具有广泛的胆汁酸代谢活性时，使用lc-ms测定法来鉴定细菌物种的胆汁酸代谢活性提供了更大的精确度。例如，用这种dbc处理可以降低促进艰难梭菌萌发的初级胆汁酸水平，而同时增加抑制艰难梭菌生长的次级胆汁酸。在dbc中优先选择使这些活性最大化的菌株可增加组合物用于治疗艰难梭菌感染的功效。在一些情况下，使用lc-ms测定法或其它灵敏度相当的测定法可以促进细菌组合物的设计，所述组合物以少于在使用灵敏度较低的测定法时组合物中所用物种的物种覆盖一定范围的胆汁酸代谢活性。组合物中物种数量的最小化可以是有用的特征，例如，因为它可以减少必须递送的细菌的数量，使得剂量更易于递送(例如作为口服剂型)并且由于必须进行的单独发酵较少而可以更有效制造以及组合物成本。另外，当在体外测定时，细菌混合物可以显示个体菌株不具有的胆汁代谢活性。这可以允许调节组合物和组成大小，因为混合物可能具有个体菌株不具有的活性。

表7

表8

表8(续)

表8(续)

实施例6：针对功能特征选择的细菌组合物

实验设计

为了进一步研究dbc的功能性，设计具有或不具有选定特征的其它dbc。使用基本上如上所述的cdi的小鼠攻毒模型来研究其它测试组合物的功效(chen等，2008，《胃肠病学(gastroenterology)》，135：1984-1992)。小鼠cdi模型用于证明预防感染。在该模型中，小鼠接受抗生素预处理以在肠道中产生生态失调，其增加cdi的易感性。当用口服施用的艰难梭菌芽孢攻毒时，小鼠表现出cdi症状，包括体重减轻、腹泻和嗜睡，在艰难梭菌接种后2-3天出现疾病高峰。感染可能是致命的，并且死亡发生在疾病高峰期。在感染时存活的小鼠中，症状主要在接种后第6天消退。在实验的持续时间内，动物被关在biobubble洁净室或同等设施中。

简言之，在这些实验中，在第-14天至第-6天，动物(雌性c57bl/6小鼠，9-10周龄)在其饮用水中接受抗生素混合液，所述混合液由1％葡萄糖、卡那霉素(0.5mg/ml)、庆大霉素(0.044mg/ml)、粘菌素(1062.5u/ml)、甲硝唑(0.269mg/ml)、环丙沙星(0.156mg/ml)、氨苄青霉素(0.1mg/ml)和万古霉素(0.056mg/ml)组成。在第-3天，动物通过口服灌胃接受剂量为10mg/kg的克林霉素。在第-1天，将测试物品在12，100rcf下离心5分钟以使细菌沉淀，倾析除去上清液，并重悬于无菌pbs中。测试物品包括fsv(人类fmt对照)、sc(人源微生物芽孢组合物，用于比较各研究间的研究功效)和设计的细菌聚生体(dbc)。测试物品接种物的对照是无菌pbs。通过口服灌胃向动物给予体积为0.2ml的适当处理物。图2提供了研究设计的示意图。

在第0天，通过口服灌胃施用约4.5log10艰难梭菌芽孢或无菌pbs(用于初始对照组)向小鼠攻毒。通过每日评估死亡率、体重减轻和临床征象和症状(临床评分；嗜睡、梳毛、湿尾/腹部和体温过低的评分)来评估感染及其后果。

测试物品

如实施例2中所述，申请人已使用上文实施例1和2中描述的鼠类模型测试了另外的dbc，以评估各种口服施用的微生物芽孢制剂在治疗/预防艰难梭菌感染(cdi)方面的功效。在组合物中每个单独物种的估计剂量为1e5个芽孢集落形成单位(scfu)下如本实施例中所述测试另外24种组合物。选择这些组合物中的二十种，使得在十对中的每一对中，一种组合物中的菌株都具有选定的表型，而在相应的组合物中，所有菌株都缺乏该表型。表4中提供了一些测试的组合物。阴性对照包括仅pbs作为治疗和初始动物(未感染艰难梭菌)。阳性对照包括用健康人类粪便的浆液处理(fsv)，和用源自人类粪便的细菌芽孢群体处理(sc)，剂量为每只小鼠1e4至1e7个芽孢。

结果

表9呈现这个实验的结果。用艰难梭菌攻毒的未处理小鼠组的死亡率为20％，并且其平均最小相对体重为0.81。令人惊讶的是，发现一些组合物在鼠类模型中有效地抑制/预防cdi，并且一些组合物至少与从健康小鼠粪便制备的组合物或从健康人类粪便制备的细菌芽孢制剂(sc)一样有效。一般来说，测试组合物改善鼠类模型中艰难梭菌感染作用的能力不同，例如最小体重、致死率和临床征象有变化。在一些实施方案中，可有效治疗或预防cdi的dbc是相对于pbs对照的最小相对体重p值＜0.0001的dbc。这种组合物的非限制性实例包括dbcs1、dbcs2、dbcs4、dbcs6和dbcs7。在其它实施方案中，可有效治疗或预防cdi的dbc是相对于pbs对照的最小相对体重p值＜0.05的dbc。其它实施方案包括通常具有低累积死亡率评分的特定特征的dbc(例如，dbcs6，其由在接受源自健康人类粪便的复杂微生物芽孢制剂的多重复发性cdi受试者的ph1b/2研究中报道具有高移植率并且在健康人类微生物群(hmp群体)中具有高流行性的细菌物种组成)。在一些实施方案中，与缺乏该特征的dbc相比，有用的dbc具有特定特征和低累积死亡率，例如，dbcs19(针对在糖醇上生长的特征而选择)和dbcs17(针对吲哚产生的特征而选择)、dbcs7(针对hdac活性而选择，其指示scfa产生)和dbcs4(梭菌簇xiva中的菌株)。

在一些情况下，设计具有对比特征的对都是有效的。例如dbcs21和dbcs22分别设计为能够使用岩藻糖作为营养源和不能使用岩藻糖作为营养源。申请人指出，组合物缺乏特征而有效的能力并不表明该特征是无用的，而仅仅是可能存在这些物种可用的替代功能和途径，导致改善艰难梭菌感染的表型。在一些实施方案中，选择具有这种多重能力的物种用于dbc是有用的，例如，以限制提供多种功能所需的细菌类型(例如物种)的数量。

结果不一致的组合物对的实例是dbcs19和dbcs20，它们被设计为使得dbcs19的所有成员都能利用所测试的糖醇并且dbcs20的所有成员都不能利用这些糖醇。在这种情况下，dbcs19对于预防cdi症状是有效的，而dbcs20不是；对两种dbc的比较显示它们在最小相对体重方面在统计学上彼此不同(p＜0.0001)。因此，在组合物中包括一种或多种可利用糖醇的细菌物种可能是有利的，例如用于治疗或预防艰难梭菌感染的组合物。

不一致的dbc对的另一实例是dbcs17(吲哚产生)和dbss18(非吲哚产生)。来自该对的数据表明，在dbc中包含至少一种吲哚产生细菌可用于组合物，例如用于治疗或预防艰难梭菌感染的组合物。hdac活性相对于无hdac活性对的结果与下文实施例7中提供的数据一致。此外，hdac+细菌(活性)以及吲哚产生细菌有效地预防与艰难梭菌相关的体重减轻(hdac阳性和吲哚阳性dbc的最大体重减轻与未经艰难梭菌攻毒的pbs对照没有显著差异)。类似地，包含梭菌簇xiva菌株可以是这种组合物的有用特征。虽然效果不如一些稳定(bsh相比于无bsh，p＝0.82)，但bsh活性的存在产生了有利的结果，因此，包含一种或多种具有bsh活性的细菌可能是有用的。申请人指出，这些是dbc设计中包含细菌的有用指导，但不应被解释为排除不具有这些特征的细菌的基础。

因此，在本发明的一些实施方案中，具有某些限定特征的dbc可以有效地治疗或预防与cdi感染相关的一系列特征，例如体重减轻、腹泻和死亡中的一种或多种。在一些情况下，选定的表型区分有效组合物和无效组合物，而在其它实施方案中，含有具有对比表型的菌株的组合物对都是有效的。

这些数据表明，包含相对有限数量的特定细菌物种的设计的细菌组合物可以用作预防生态失调的治疗，如通过在鼠类模型中治疗cdi所证明。

此外，针对某些特征选择并显示具有所需活性(例如cdi改善)的此类dbc组合物可用作添加其它细菌物种的更复杂组合物的基础，包括具有其它所选特征的那些组合物。dbc4、dbc6和dbc9是此类组合物的非限制性实例，本文公开并且可以使用本文提供的指导来构建的其它组合物也是如此。

表9

实施例7：dbc物种的功能特性；dbc物种中的组蛋白脱乙酰酶(hdac)活性

申请人已经鉴定了通过scfa产生抑制组蛋白脱乙酰酶活性作为一些dbc的有用功能。因此，申请人测定了各种细菌抑制hdac活性的能力。

hdac抑制测定可以在体外检测scfa

为了确定可购得的hdac筛选系统是否可用于测试scfa的hdac抑制，测试了hdac-gloi/ii测定试剂盒promega(参见halley等，2011《生物分子筛选杂志(jbiomolscreen)》，16：1227-35)。对于该实验，试剂盒中提供的hela核提取物被用作hdac酶的来源。选择hdac-gloi/ii试剂盒，因为已报道丁酸盐抑制大部分hdaci和ii家族酶，但hdac6和hdac10除外(davie2003，《营养学杂志(jnutrition)》，133：2485s-2493s)。在该测定中，通过hdac对所提供的底物进行脱乙酰化产生发光信号，该发光信号用合适的平板读取器(spectramaxm5)检测。与无抑制剂对照相比，hdac抑制减少了发光信号。根据制造商的说明如下进行实验：将50μl的在测定缓冲液中以1：3000稀释的hela核提取物与50μl抑制剂溶液(scfa在测定缓冲液中的连续稀释液)混合并温育30分钟。向每个孔中加入100μl显色剂溶液，并且在室温下温育45分钟后测量发光。结果(未显示)表明，在测定条件下，丁酸盐和丙酸盐是强效hdac抑制剂，ic50分别为0.8和2.4mm。在最高测试浓度(3.75mm)下，乳酸盐和乙酸盐具有最小的hdac抑制活性。

测量培养上清液中的丁酸盐产生的hdac抑制测定

为了研究hdac测定与scfa测定之间的相关性，对于来自健康人类供体的十二种微生物组细菌分离株(hhd菌株)和两种已知不产生丁酸盐的公开可获得的菌株(大肠杆菌(escherichiacoli)和青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis))评估了其抑制hdac活性的能力并通过气相色谱法评估丁酸盐产生。所有菌株的培养物一式三份地在蛋白胨酵母葡萄糖培养基(pyg，anaerobesystems)中在37℃下生长5天。包括空白培养物(未接种的无菌培养基)和掺有15mm丁酸盐的无菌培养物作为对照。温育5天后，通过离心(4000rpm持续15分钟)除去微生物细胞，并且通过0.22μm过滤器(millipore)过滤上清液(细菌生长培养基)。呈递上清液以通过气相色谱法(gc-fid，来自mrl，woburnma)测量丁酸盐，并使用hdac-gloi/ii测定试剂盒(promega)测定hdac抑制。对于该测定，将10μl培养上清液、40μl测定缓冲液和50μl稀释的hela核提取物(1∶3000稀释)温育30分钟，然后加入100μl显色试剂。在室温下45分钟后测量发光。结果表明，三种菌株的培养上清液以及掺有15mm丁酸盐的上清液在这些条件下显著降低了hdac源发光，即表现出对hdac的抑制(图6)。如通过生物重复实验之间的小的标准偏差所指示，该测定法是稳定的。由于该测定法对任何特定的hdac抑制剂都不具特异性，因此它对于确定细菌物种或细菌组合物的一般能力是有用的，并且即使在细菌产生非典型的hdac抑制剂(非丁酸盐)时可用于例如鉴定该能力。

如上所述，使用gc测定细菌上清液的丁酸盐浓度。hdac抑制结果与通过gc测量的丁酸盐浓度的比较显示了12种hhd菌株的显著相关性(图7)。这些结果表明如上所述进行的hdac抑制测定可以在这些条件下检测细菌上清液中低至6mm的丁酸盐浓度。在本发明的一些实施方案中，反应中使用超过10μl的上清液，导致较低水平的检测，例如1mm、5μm或1μm。

在不同碳源中生长的培养物上清液中的hdac抑制活性

为了确定hdac抑制是否受到细菌物种可用碳源的类型和水平的影响，对源自dbc中所用的细菌物种选择的上清液的hdac抑制进行测定。在这些实验中，细菌在包括单糖、二糖、多糖和猪粘蛋白的各种碳源中生长。简言之，将600μl补充有0.5％所选碳源的蛋白胨/酵母提取物培养基(py)中的细菌培养物接种在96深孔板中，生长4天，然后通过离心使微生物细胞沉淀，并且将15μl培养基(上清液)用于如上所述的hela核提取物的hdac测定。因为hdac活性在低ph下降低(latham等，2012《核酸研究(nuclacidres)》，40：4794-803)，并且微生物培养物的ph低至5，为了确保加入上清液不会降低测定的最终ph，每孔加入10μl的1mtrisph8溶液以使最终的tris缓冲液浓度达到75mm。因此，利用15μl上清液、10μl1mtrisph8、25μl测定缓冲液和50μl稀释的hela核提取物进行测定，将其预温育30分钟，然后加入显色试剂。30分钟后测量发光。

这些实验的结果提供于下表10中。在实验条件下，掺有15mm丁酸盐的无菌上清液导致62％的hdac抑制。使用25％hdac抑制作为截止值(在实验条件下为1.8mm丁酸盐)，如上所述，只有无害梭菌和球形闪烁梭菌在葡萄糖培养基中生长时表现出hdac抑制活性。然而，当测试替代营养源时，另外4种菌株对hdac抑制呈阳性：乙二醇梭菌、鲍氏梭菌、双孢梭菌和扭曲真杆菌。肠道鼠单胞菌和乳清酸梭菌上清液也显示hdac抑制，但略低于25％截止值。这些数据表明，为了了解物种产生hdac抑制剂的能力，重要的是用多种碳源进行hdac抑制测定。

此外，这些数据表明提供可以使用宽泛范围的碳源的组合物是有利的，由此增加了当作为需要hdac抑制的适应症的治疗施用时，组合物将产生hdac抑制剂的可能性。这样的适应症包括那些需要产生短链脂肪酸例如用于治疗或预防艰难梭菌感染的适应症。这些数据还为作为dbc中的一种或多种物种的营养源的益生元的使用提供支持。

表10：利用不同碳源生长的培养物中的hdac抑制活性

细菌菌株的scfa概况

将用于上述hdac抑制测定的相同细菌培养上清液呈递至gc-ms分析以确定哪些scfa是观察到的hdac抑制的基础。采用的方法(msomics，denmark)测量甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐(2-甲基-丙酸盐)、异戊酸盐(3-甲基-丁酸盐)、戊酸盐(valerate/pentanoate)、4-甲基-戊酸盐、己酸盐(caproate/hexanoate)和庚酸盐。gc-ms结果(表11)表明hdac抑制结果与文献中和hdac抑制相关的scfa产生之间存在极好的相关性。表11中的数字表示检测到的scfa浓度。b＝丁酸盐；p＝丙酸盐；ib＝异丁酸盐，和iv＝异戊酸盐。

无害梭菌和普氏黄杆菌在所测试的所有培养基中都产生丁酸盐。对于无害梭菌，在蔗糖、果胶和fos/菊糖上的丁酸盐浓度高于基础培养基，表明该菌株可以从这些复杂多糖产生丁酸盐。普氏黄杆菌在fos/菊糖、淀粉和粘蛋白上产生另外的丁酸盐，但在葡萄糖上的程度较小。因此，将这两个物种包含在组合物中将能够从宽泛范围的复杂底物产生丁酸盐。

乙二醇梭菌产生异戊酸盐、异丁酸盐和丙酸盐。异丁酸盐和异丙酸盐是支链氨基酸(分别为缬氨酸和亮氨酸)的异化代谢中产生的支链脂肪酸(bcfa)，并且已表明在hela细胞中展现hdac抑制活性(waldecker等，2008《营养生物化学杂志(jnutritionalbiochem)》，19：587-593)。包含这种菌株，例如在dbc6中，其中乙二醇梭菌是唯一显示能够利用缬氨酸和亮氨酸作为碳源的菌株(同上)，因此可以提供能够与艰难梭菌竞争这些底物并且同时调节hdac活性的菌株。申请人注意到，在这些实验中，异亮氨酸代谢产物2-甲基-丁酸盐不是scfa小组的一部分。然而，乙二醇梭菌也可以使用ile作为碳源，在碳源小组中测试的艰难梭菌菌株也是如此。因此，乙二醇梭菌也可用于dbc中作为2-甲基-丁酸盐的来源。

鲍氏梭菌、双孢梭菌、扭曲真杆菌、肠道鼠单胞菌和乳清酸梭菌产生丙酸盐，但只有当提供岩藻糖作为碳源时。岩藻糖是肠上皮腔和粘膜分泌物中聚糖的重要组分。肠岩藻糖已被鉴定为宿主-微生物组共生体的介体(pickard和chervonsky2015《免疫学杂志(jimmunol)》，194：5588-5593)。因此，在dbc中包括至少一种岩藻糖利用物种可以支持这些细菌对宿主的定植，并且在上皮表面附近的丙酸盐利用可以在上皮屏障功能中具有显著的有益效果。

普氏黄杆菌在补充有葡萄糖、fos/菊糖、淀粉或粘蛋白的py(基础培养基)中的生长导致与仅在基础培养基中生长时产生水平相比的丁酸盐水平增加。类似地，在补充有葡萄糖或果胶的培养基中生长的无害梭菌以及在蔗糖或fos/菊糖中以较小的程度产生增加的丁酸盐水平。

在一些情况下，当基础培养基补充有碳源时，物种产生较少的scfa。在不依托任何特定理论的情况下，在这种情况下可能的是，补充碳源是细菌将其代谢转换为使用补充碳源的优选来源，从而当只使用基础培养基用于生长时检测到较少的scfa。

这些数据表明，所选物种可以用于增加当在dbc中施用细菌时将产生scfa的可能性。此外，与hdac抑制和使用各种碳源的scfa产生有关的数据支持使用dbc，而不是其中需要表达hdac抑制分子(例如由细菌产生的scfa或其它未鉴定分子)的单物种组合物用于治疗。

表11：在各种碳源中生长的细菌物种的scfa概况。

数字表示培养上清液中以下物质的测量浓度(mm)：丁酸盐(b)、丙酸盐(p)、异丁酸盐(ib)或异戊酸盐(iv)。检测限(lod)为0.3mm(b)、0.2mm(p)、0.3mm(ib)和0.6mm(iv)。空单元格表明浓度低于lod。

实施例8.dbc物种的功能特性；吲哚和其它色氨酸代谢物的产生

如实施例6中所示，与不产生吲哚的细菌组合物相比，能够产生吲哚或吲哚衍生物的细菌组合物可有效改善艰难梭菌感染。鉴于这一发现，申请人开发了用于吲哚和吲哚代谢物产生的测定法，其可用于测试细菌的这些活性并且能够鉴定具有所述活性的细菌物种。这些物种是构建可用于例如治疗或预防艰难梭菌感染的dbc的有用添加物。

ser-262细菌上清液中吲哚和吲哚代谢物产生的测定

对于吲哚测试，将一滴吲哚试剂(anaerobesystems，morganhill，ca)加入到100μl的在八种不同碳源中生长的细菌菌株的细菌培养物中，一式两份。在所测试的12种菌株中，在这些条件下的吲哚测试中仅乙二醇梭菌和普氏黄杆菌呈阳性(数据未示出)。补充有实施例7中利用的8种碳源中的每一种的普氏黄杆菌培养物变成深蓝色，这是存在吲哚的特征。乙二醇梭菌在除了葡萄糖、果胶和fos/菊糖之外的所有c源中都变成红色(已描述了该测试中不同吲哚衍生物的不同颜色(lombard和dowell，1983《临床微生物学杂志(jclinmicrobiol)》，18：609-613))。对于这些菌株，碳源的吲哚表型模式与hdac和scfa表型的模式相同，并且与生物量无关，这表明重叠调节。此外使用斑点试验再次测定上清液(将4μl上清液点样在浸渍有吲哚试剂(anaerobesystems，morganhill，ca)以及纯化的吲哚、3-甲基-吲哚、吲哚-3-丁酸、色胺和吲哚-3-丙酸作为阳性对照的纸中)。吲哚和普氏黄杆菌上清液产生淡蓝色，而无害梭菌、吲哚-3-丙酸、3-甲基-吲哚、吲哚-3-丁酸和色胺产生紫色斑点。这些结果意味着普氏黄杆菌是一种吲哚产生剂，而无害梭菌是用这种方法无法指定的吲哚衍生物的产生剂。在文献中已经报道了吲哚在免疫调节和上皮屏障功能中的作用的证据。鉴于此以及本文提供的数据，将这两种菌株中的至少一种或两种包含在设计用于治疗或预防感染(例如艰难梭菌感染)的dbc中是有用的。在不依托任何特定理论的情况下，申请人认为将这些物种包含在dbc中可用于免疫调节和恢复上皮屏障功能。

实施例9：dbc临床试验

在被诊断患有cdi的初次(第一次)发作的人类受试者中使用dbc进行临床试验。这种试验的实例描述于clinicaltrials.gov，试验编号nct02830542。

有效的dbc减少该群体中的一种或多种cdi征象和/或症状的复发。其它实施方案属于以下权利要求的范围内。