一种用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置的制作方法

本发明属于肿瘤生物学领域，具体涉及一种用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置。

背景技术：

迄今为止，癌症仍是世界上最严重的公共健康问题。在中国乃至世界范围内癌症的发病率及死亡率仍在不断攀升，恶性肿瘤已经成为导致人类死亡的主要疾病之一。

肿瘤发生是一个复杂的多因素、多阶段过程，是个体基因不稳定性及包括人类生活方式在内的环境因素等共同作用的结果。1971年Folkman等提出实体瘤的生长和转移依赖于肿瘤新生血管生成，进一步地提出以肿瘤血管生成为靶点，通过肿瘤血管生成抑制剂抑制或破坏肿瘤血管生成，切断肿瘤营养来源而“饿死”肿瘤的癌症的新疗法。

目前针对肿瘤新生血管的研究有两大方向：抗血管生成剂(angiogenesis inhibitors,AIs)和血管阻断剂(vascular disrupting agents,VDAs)。VDAs是指一类能选择性破坏恶性肿瘤新生血管，从而达到治疗癌症目的的药物。其作用机制是利用恶性肿瘤新生血管与正常血管在病理生理上的不同，选择性地与恶性肿瘤新生血管相结合，直接或间接地使肿瘤新生血管发生闭塞或损坏，造成肿瘤细胞的缺血坏死，从而起到治疗恶性肿瘤的作用。一些小分子VDAs的临床试验均报道有心血管不良反应如高血压、心动过速、缓慢性心律失常、心房颤动、心肌梗死等，这些不良反应限制了其在临床上的广泛使用。发明一种新型有效直观的诊断检测此技术对肿瘤微循环的影响的技术手段，对于新药的研发和临床应用具有重大的意义。用于治疗肿瘤的射频治疗系统、用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置及利用该装置进行射频治疗的系统均未有报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置，利用该装置可在富勒烯衍生物和纳米材料等药物结合射频治疗过程中对肿瘤部位边射频治疗边观测，操作简单，较小的窗口以及严格无菌的操作提供稳定可视化的观察窗，实时直观地观测肿瘤及正常组织中的微循环在治疗过程中所产生的变化，保证治疗射频的辅助功能稳定有效，为需要射频能量来辅助治疗的富勒烯等血管阻断药物及此种新的治疗方法的疗效机理的研究提供有力且可靠的手段和依据。

本发明提供的用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置，它包括：

用于实时动态观测的肿瘤微环境变化的背脊皮翼视窗；

用于进行射频治疗的射频线圈；

用于将所述背脊皮翼视窗和所述射频线圈进行可拆卸连接的连接装置；

用于将所述背脊皮翼视窗和所述射频线圈隔开、所述射频线圈和所述连接装置隔开的非导电材料。

上述的装置中，所述背脊皮翼视窗可采用常规的背脊皮翼视窗，在本发明的一个或多个具体的实施例中，所述背脊皮翼视窗包括：

用于固定背脊皮翼的视窗固定片Ⅰ和视窗固定片Ⅱ；所述视窗固定片Ⅰ和视窗固定片Ⅱ为可拆卸连接；所述视窗固定片Ⅰ和所述视窗固定片Ⅱ中至少一个开设有窗口；

用于固定在所述窗口上的视窗玻片。

上述的装置中，所述背脊皮翼视窗和所述射频线圈之间的间隔可为1～10厘米，具体可通过设置所述非导电材料的厚度控制所述间隔。

上述的装置中，所述背脊皮翼视窗适用动物范围具体可为所有类型的大鼠和小鼠。所述背脊皮翼视窗中窗口的直径可为10～50毫米，具体可为27毫米、35毫米或46毫米。所述背脊皮翼视窗可用于光学显微镜、荧光显微镜及磁共振成像等多种观察手段。所述背脊皮翼视窗的材质可为钛合金和尼龙。

上述的装置中，所述可拆卸连接可为螺纹连接，具体可由所述背脊皮翼视窗上的螺丝和螺帽进行连接，射频线圈相应打孔。

上述的装置中，所述非导电材料具体可为塑料，如采用塑料片将所述背脊皮翼视窗和所述线圈隔开，采用塑料套管将视窗上的螺丝和线圈隔开。所述非导电材料设置可防止干扰射频线圈所发出的射频信号。

本发明进一步提供了一种利用上述装置进行射频治疗的系统，包括射频发生装置、上述用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置以及纳米材料；所述射频发生装置发射的射频信号通过所述装置中的射频线圈施加到肿瘤部位，使富集在肿瘤血管中的纳米材料发生运动破坏肿瘤血管，治疗肿瘤。

上述的系统中，所述射频发生装置为本领域技术人员公知的射频发生装置，可调节所述射频发生装置的射频频率、射频功率等。所述射频发生装置具体可包括：一用于发射出射频信号的射频信号发生器；一用于放大所述射频信号并整合输出所需频率的射频信号的信号放大器。所述系统还可包括用于检测所述射频线圈的功率密度的频谱仪。所述频谱仪可为肿瘤治疗条件提供参照。

上述的系统中，所述纳米材料为具备有以下性质的纳米材料：(1)表面为亲水性和/或表面带有电负性；(2)该材料具有刚性，使其不易通过肿瘤血管壁孔洞而被卡在所述孔洞；(3)能够吸收外界辐射能量并在内部转化成为热能，同时将所述热能蓄积，使得所述纳米材料的形态结构发生剧烈变化。

所述纳米材料可以是水溶性单质金属、水溶性非金属纳米材料或水溶性复合纳米材料，具体可为水溶性富勒烯纳米颗粒、水溶性金属富勒烯纳米颗粒、水溶性贵金属纳米颗粒，如金纳米颗粒，铂纳米颗粒等，水溶性氧化铁纳米颗粒，水溶性铁酸锰纳米颗粒，水溶性铁酸钴纳米颗粒等等。在本发明的一个或多个具体的实施例中，所述纳米材料可为水溶性Gd金属富勒烯纳米颗粒(如金属富勒烯羟基化衍生物Gd@C82(OH)n)。

为了使所述材料不易通过肿瘤血管壁孔洞而被卡在所述孔洞，所述纳米材料的粒径可为50～250nm，如100～200nm。

所述纳米材料可以水溶液的形式存在，所述纳米材料的水溶液的浓度可为0.1～10mM，如5mM。

上述的系统中，所述射频线圈与不同的治疗药物相匹配；所述射频线圈的发射射频参数能够在下述范围内调节：发射射频频率为10～300兆赫兹；功率为0～100毫瓦。所述发射射频频率具体可为10兆赫兹、100兆赫兹、200兆赫兹或300兆赫兹。所述的射频线圈发射射频功率具体可为1毫瓦、10毫瓦或15毫瓦。

上述的系统中，所述系统还包括成像系统，具体可为光学显微镜或荧光显微镜。实时动态观测可采用照片或视频采集的任何手段记录；所述照片或视频采集信息可通过任何的成像系统得到观测肿瘤微环境时可采用正常组织的血管微环境作为对照进行观测；所述肿瘤和正常组织的血管微环境的变化包括肿瘤血管形态数量、血液循环和肿瘤组织的变化，具体可为血管破裂、出血、血流减少或组织颜色变化。

本发明具有如下有益效果：

本发明将动物背脊皮翼视窗模型和射频治疗线圈巧妙结合，设计不同治疗频率和与不同材质的背脊皮翼视窗相匹配的射频线圈，保证富勒烯类和特定的纳米材料等药物有效的射频治疗效果，同时在射频治疗过程中观察直观、操作简便、可及时并准确地判断研究治疗过程中肿瘤血管和正常血管的情况，为观察和研究射频药物对肿瘤血管的阻断过程和机理，为评价抗肿瘤特别是射频作用下肿瘤血管阻断药物提供了有效且可靠的手段。

附图说明

图1为实施例中小鼠背脊皮翼视窗模型图。

图2为实施例中小鼠背脊皮翼视窗模型与射频线圈结合后的装置图。图中，各标记如下：1背脊皮翼视窗、2射频线圈、3螺丝。

图3为实施例中光学显微镜下观测小鼠背脊皮翼视窗中肿瘤微环境装置图。

图4为实施例中不同治疗时间下小鼠肿瘤血管微环境成像图。

图5为实施例中不同治疗时间下小鼠正常组织血管微环境成像图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置

本发明提供的一种用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置(图2所示)，它包括用于实时动态观测肿瘤微环境变化的背脊皮翼视窗(图1所示)，该背脊皮翼视窗包括用于固定背脊皮翼的视窗固定片Ⅰ和视窗固定片Ⅱ；视窗固定片Ⅰ和视窗固定片Ⅱ中间均开设有窗口；以及用于固定在窗口上的视窗玻片；

用于进行射频治疗的射频线圈；

用于将视窗固定片Ⅰ、视窗固定片Ⅱ和射频线圈进行螺纹连接的螺丝和螺帽；

用于将背脊皮翼视窗和射频线圈隔开、射频线圈和螺帽隔开的塑料垫片和塑料套管。塑料垫片的厚度使得射频线圈与背脊皮翼视窗模型窗口相隔1～10厘米。

本发明装置在使用时，

首先，拉起背部皮肤，将背脊皮翼视窗固定在肿瘤部位的皮肤上，具体操作如下：将视窗固定片Ⅰ缝合在皮窗固定区域(肿瘤部位)上，将窗口部分的皮肤剪掉，放入视窗玻片。将视窗固定片Ⅱ放在上面，与背面固定好的固定片Ⅰ对齐，用手术缝合针缝合。

其次，使视窗背面朝上，拧开背脊皮翼视窗螺帽，将塑料套管套在视窗的螺丝上，将射频线圈装在视窗背面的螺丝上，夹取塑料垫片，拧紧螺帽即可。

实施例2、一种可实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的肿瘤治疗系统

本发明提供的一种用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的肿瘤治疗系统，它包括射频发生装置、实施例1中的用于实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化的装置以及Gd@C82的羟基化衍生物(Gd@C82(OH)n)；射频发生装置包括：用于发射出射频信号的射频信号发生器；用于放大所述射频信号并整合输出所需频率的射频信号的信号放大器。该系统还可包括用于检测射频线圈的功率密度的频谱仪以及用于观察肿瘤微环境变化的光学显微镜或荧光显微镜。射频发生装置发射出的射频信号通过装置中的射频线圈施加到肿瘤部位，使富集在肿瘤血管中的Gd@C82的羟基化衍生物(Gd@C82(OH)n)发生运动破坏肿瘤血管，治疗肿瘤。

用于射频治疗肿瘤的药物Gd@C82的羟基化衍生物(Gd@C82(OH)n)，具体可按照文献Mingming Zhen,Chunying Shu,Jie Li,et al,Science China materials.2015,58,799中公开的方法制备得到，粒径为100-200nm。

实施例3、利用本发明装置及系统进行射频治疗并实时动态观测射频治疗中肿瘤微环境变化

一、建立背脊皮翼视窗

(1)手术前准备

准备所需工具及试剂：钛合金背脊皮翼视窗、手术剪、眼科镊、缝合针线、止血钳、盖玻片、棉签、无菌生理盐水、抗生素、75％酒精及碘伏等，术前和超净台一同紫外杀菌消毒。

(2)移植背脊皮翼视窗手术

戊巴比妥钠对实验小鼠腹腔注射，进行麻醉。待小鼠已基本麻醉，用棉花棒蘸取碘伏，涂抹消毒背部裸露皮肤。拉起小鼠背部皮肤，拉起小鼠背部皮肤，对准光线选取有丰富的血管分布作为皮窗固定区域。用带线缝合针缝合夹紧小鼠皮肤的视窗固定片。让小鼠侧躺，使没有固定片的侧面朝上，可在下面垫上器械使视窗区域保持水平，用镊子小心拉起背部皮肤，开始剪皮，根据装入的视窗玻片大小修理皮肤开口，使开口大小略小于玻片。在皮肤开口处滴上含有抗生素的无菌生理盐水，以防放置视窗玻片时出现气泡，将视窗玻片小心嵌入皮肤开口，切勿出现气泡。将另一片视窗固定片放在上面，与背面固定好的固定片对齐，用手术缝合针缝合。手术后的小鼠会身份虚弱且容易感染，保证其饮食和生活环境的整洁。手术后第一时间用小块纱布包裹小鼠帮助其保暖。饮食方面，保证每日以鸡蛋黄喂食小鼠，饮用水为含有抗生素的无菌水，以防其伤口发炎。垫料也需要每两日更换一次，每天坚持观察小鼠。

(3)背脊皮翼视窗模型接种肿瘤

取正常的小鼠H22腹水，吹打均匀后进行细胞计数。经计算后，细胞密度为每毫升1×10⁷-7.5×10⁷个细胞，用微量进样针吸取10微升，将小鼠侧卧(视窗的非玻片侧向上)放置在左手，右手掌握微量进样针从视窗区域外紧贴皮肤将针头慢慢推入，让针头进入皮肤与视窗玻片之间的间隙，要注意不要穿破皮肤。将细胞慢慢注射在观察区的中央，同时渐渐旋转针头从间隙中抽离出来，完成注射。通常H22肿瘤出现时间大概为术后4-5天，长出淡粉色肿瘤后即可进行观察，如图1所示。在H22肿瘤明显长出以后，用2％异氟烷氧气混合气体对小鼠进行麻醉。用酒清棉签清洁视窗玻片即可。

二、连接背脊皮翼视窗与射频线圈

用2％异氟烷氧气混合气体保持实验小鼠稳定的麻醉状态。小鼠侧躺，视窗背面朝上，轻轻拧开背脊皮翼视窗三个螺帽，用镊子将塑料套管套在视窗的螺丝上，轻轻将对应的200兆赫兹射频线圈装在视窗背面的三个螺丝上，用镊子分别夹取三个塑料垫片，保持视窗平行于桌面，分别轻轻拧紧螺帽即可，如图2所示。

三、射频治疗下实时动态观测射频治疗时肿瘤微环境

(1)固定装置于光学显微镜镜台

用2％异氟烷氧气混合气体保持实验小鼠稳定的麻醉状态。将小鼠视窗窗口朝上侧卧，保持与桌面平行，用专用螺丝将已连接的射频线圈与平板装置固定，拧紧后将其放于光学显微镜样品台并用固定夹夹紧平板装置，此时保证视窗窗口平面与样品台平行，如图3所示。

(2)施加射频治疗

将射频线圈接口与射频发生装置连接，设置射频发生装置参数，射频频率为200兆赫兹，射频功率为10毫瓦，并用频谱仪检测视窗窗口处实际射频功率是否相符。

小鼠静脉注射给药5mM的Gd@C82的羟基化衍生物(Gd@C82(OH)n)(粒径为100-200nm)的水溶液，剂量为15mg/kg，15分钟后，施加射频治疗1小时。

(3)实时采集图片进行观测

用2％异氟烷氧气混合气体保持实验小鼠稳定的麻醉状态，将其平行固定于显微镜样品台，用光学显微镜4倍镜头对窗口内肿瘤血管和周围正常血管进行拍照观测。拍照时间为治疗前、治疗30分钟和1小时。

(4)分析整理数据

调节不同时间点不同部位拍摄的照片的亮度和对比度，比较同一位置不同时间的变化。

如图4所示，治疗前、治疗30分钟和60分钟时H22肿瘤血管的变化过程。治疗前，肿瘤血管丰富清晰完整；治疗30分钟时，肿瘤血管周围出现出血点；治疗60分钟时，肿瘤血管周围出血点面积逐渐变大，血管出现断裂。说明Gd@C82氨基酸衍生化药物在此射频条件下，起到了阻断H22肿瘤血管的作用，在治疗30分钟时起效并破坏H22肿瘤微环境，从而达到破坏抑制肿瘤的生长作用，验证了此药物在射频下阻断肿瘤血管的治疗机理。

如图5所示，治疗前、治疗30分钟和60分钟时正常组织血管的变化过程。在治疗前肿瘤周围正常血管有序清晰完整，随着治疗的进行，在肿瘤血管遭到药物阻断治疗作用的同时，正常组织的血管并没有产生变化，没有被破坏或阻断。说明此阻断肿瘤血管的治疗对正常组织的血管不产生破坏作用，从而对正常组织不产生毒性或破坏，在治疗肿瘤过程中对正常组织器官无毒副作用，验证了此药物在射频下靶向治疗肿瘤作用。