以富含肽的未分化的白桑细胞为基础成分的化妆品的制作方法

技术领域：
本发明属于日化产品领域，具体以富含肽混合物的未分化的白桑细胞为基础成分的化妆品。
背景技术：
：目前市场已推出了大量以植物萃取成分为基础成分的化妆品，主要用于抗衰老、抗皱或者皮肤再生。比如说，以桑树提取物，特别是白桑提取物为基础成分的化妆品，已经登记在EP296923号文件中，因为桑树的提取物能够产生一个水脂层，所以该成分可以产生淡化色素或消炎的作用。EP997140号文件中阐述了一种全新的化妆品和/或皮肤病学成分，其中结合了桑树提取成分和至少一种水杨酸衍生成分，该成分具有淡化色素的作用。US7195787号文件中阐述了一种用于保护局部皮肤抵御自由基的化妆品成分，该成分具有防晒和保护皮肤免受大气污染伤害的作用。该成分包含了三种抗自由基制剂，其中一种便是桑树提取物。同时，EP1531782号文件中还阐述了一种以蛋白质为基础的用于皮肤清洁的成分，该成分包含一类与铜结合的蛋白质或含酶活性成分，以混合植物提取物(其中包括桑树提取物)和乙二胺四乙酸二钠盐的形式组成。本发明人现提出一种化妆品组合物，它不含色素，同时又拥有更多抗氧化和抗自由基的成分，能刺激皮肤再生，使皮肤更加光亮。技术实现要素：本发明的目的是提供一种化妆品用组合物，它不含色素，同时又拥有更多抗氧化和抗自由基的成分，能刺激皮肤再生，使皮肤更加光亮。为实现本发明的目的，本发明提供如下技术方案。本发明提供了一种化妆品用组合物，至少包含：(a)提取出的未分化的白桑细胞，(b)含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽和寡肽-1的肽混合物，以及(c)适用于化妆品的溶剂。所述未分化的白桑细胞为未被碾碎或未被充分碾碎的白桑细胞，同时最易分散在适用于化妆品的溶剂中。所述肽混合物含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽和寡肽-1。其中，肌肽是一种由β丙氨酸和组氨酸组成的二肽(CAS编号：305-84-0)，其分子量为226g，呈白色粉末状。大米肽为大米蛋白质经蛋白酶作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物，为溶液状态，含少于1％的大米提取物和少于1％的防腐药剂(例如抗菌药剂和抗真菌药剂)。本发明所述大米肽溶液是由Vincience以水解水稻提取蛋白质(Thymophytane)之名进行销售的。Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽中Asp是丙氨酸的缩写；Lys是山杨酸的缩写；Leu是亮氨酸的缩写；Lys是赖氨酸的缩写；Pro是脯氨酸的缩写；而Thr是苏氨酸的缩写)，即Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽为丙氨酸-山杨酸-亮氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苏氨酸六肽。它是一种使用在面霜中的活性成分。这个成分在国际多肽研究与治疗杂志(2013)19:217-224中，由安娜·奥勒杰尼克等人所发表的名为“质谱法对于丙氨酸-山杨酸-亮氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苏氨酸六肽的测定”的一文中有相关说明(可在Springerlink.com中找到该文章)。寡肽-1是一种含有少于60个氨基酸的肽。它也被认为是一种小蛋白或表皮生长因子。寡肽-1由BioOrganicConcepts公司(美国加利福尼亚州圣菲斯普林斯，邮编CA90670)以名为DermatienEGF进行销售，该产品为含有25％(重量)硫酸铵和低于0.01％(重量)寡肽-1的水溶液的形式。肽混合物优选包括少于60个氨基酸，更优选少于40个氨基酸，少于10个氨基酸的肽混合物最佳。肽混合物优选多于50％重，更优选多于70％重以及少于10个氨基酸。本发明所述化妆品用组合物还包含适用于化妆品的溶剂，尤其是用于局部。本发明所述化妆品用组合物优选包含0.0005％-20％干重的提取出的未分化白桑细胞。更优选0.001％-10％干重，最好是0.001％-1％干重的提取出的未分化白桑细胞。按照本发明，本领域技术人员可以理解上述提取出的未分化白桑细胞优选混合或分散在适用于化妆品的溶剂中，尤其优选分散于甘油中。本发明所述化妆品用组合物优选还包含0.0001％-10％干重的含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽和寡肽-1的肽混合物。更优选0.0001％-5％干重，最好是0.0002％-1％干重的含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽和寡肽-1的肽混合物。按照本发明，本领域技术人员可以理解所述含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽和寡肽-1的肽混合物优选与提取出的未分化白桑细胞处于同一相中，特别是同一脂相。所述含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽和寡肽-1的肽混合物中，肌肽的重量占肽混合物重量1％-95％，优选占5％-90％，更优选占50％-85％；大米肽的重量占肽混合物重量1％-50％，优选占3％-40％，更优选占4％-20％；Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽的重量占肽混合物重量1％-50％，优选占3％-40％，更优选占4％-20％；寡肽-1的重量占肽混合物重量1％-50％，优选占3％-40％，更优选占4％-20％。本发明所述提取出的未分化白桑细胞直径平均≤200μm，优选≤100μm，在一些实施例中，所述提取出的未分化白桑细胞直径少于5μm。本发明对未分化白桑细胞的提取方法没有特别限定。在一些实施方案中，所述提取出的未分化白桑细胞在提取时在二氧化碳的培养箱中操作，同时交替进行30分钟到6小时的照明处理和15分钟到2小时的非照明处理。即进行30分钟到6小时的照明处理后需要进行5分钟到2小时的非照明处理，然后再进行照明处理。所述含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽和寡肽-1的肽混合物中的大米肽优选为水解的大米肽。更优选为单水稻水解蛋白或多水稻水解蛋白，尤其多水稻水解蛋白。作为优选，所述适用于化妆品的溶剂为甘油和/或丙三醇。本发明所述的化妆品用组合物具有以下至少一种用途：抗氧化和/或抗自由基；防御紫外线(UV-A和/或UV-B)，尤其是紫外线B(UV-B)；防止衰老，尤其是能限制或减缓面部肌肤松弛，减少脸部细纹，和/或延缓细纹的产生；保持肌肤水润；加强皮肤的抗氧化能力；确保内分泌稳定，促进体内平衡；减少角化细胞的脱落，保证角质细胞的凝聚力；增殖皮肤细胞，促使并显著加快细胞更新；促进表皮细胞的分化；促进表皮细胞再生；促进和/或加快胶原蛋白的重新生成。优选的，所述化妆品用组合物用于脸部皮肤，脸颊皮肤，颧骨皮肤，鱼尾纹处，法令纹处，泪沟，特别是眼部皮肤。和/或所述化妆品用组合物呈霜状，膏状，啫喱状，乳状，流动液体混合物，固体或半固体混合物，棍状，棒状，小管状，固体或半固体状凝胶型……。本发明提供了一种化妆品用组合物至少包含(a)提取出的未分化白桑细胞、(b)含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽和寡肽-1的肽混合物以及(c)适用于化妆品的溶剂。本发明所述化妆品组合物不含色素，同时又拥有更多抗氧化和抗自由基的成分，能刺激皮肤再生，使皮肤更加光亮。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1A示未处理的再生表皮组织结构图；图1B示在24小时之内往再生表皮中加入0.5％的活性剂后的再生表皮组织结构图；图1C示在24小时之内往表皮中加入1％的活性剂后的再生表皮组织结构图；和图1D示在24小时之内往再生表皮中加入2.5％的活性剂后的再生表皮组织结构图；图2示未处理的表皮以及24小时内加入0.5％活性剂、1％活性剂和2％活性剂进行处理后，570nm下的光密度的统计图；图3示未处理的表皮以及在24小时之内0.5％活性剂、1％活性剂和2％活性剂进行处理后表皮中羟基脯氨酸的含量统计图，其中羟基脯氨酸浓度单位为mg/L；图4示未处理的表皮以及在24小时之内0.5％活性剂、1％活性剂和2％活性剂进行处理后表皮中细胞增殖标记物(Ki-67)的数量统计图；图5A示未处理组通过彩色显影液染色后，使增殖细胞核抗原Ki-67得以显现的再生表皮组织结构图；图5B示在24小时之内，往再生表皮中加入0.5％的活性剂后的再生表皮组织结构图；图5C示在24小时之内，往表皮中加入1％的活性剂后的再生表皮组织结构图；图5D示在24小时之内，往再生表皮中加入2.5％的活性剂后的再生表皮组织结构图；图6A示未处理组冻结之后确定聚丝蛋白的存在的再生表皮组织结构图；图6B示在24小时之内，往再生表皮中加入0.5％的活性剂后的再生表皮组织结构图；图6C示24小时之内，往表皮中加入1％的活性剂后的再生表皮组织结构图；图6D示在24小时之内，往再生表皮中加入2.5％的活性剂后的再生表皮组织结构图。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未分化白桑细胞的生产流程最好是采用WO03/077881中所述记载的流程。据现行文献对植物未分化细胞的记载，我们可以从中得知，没有一个植物细胞具备独立于其他细胞而独自生存的能力。白桑的未分化细胞可以从整个植株中提取，也可以从植株的某些部分提取，例如叶子、茎干、花朵、花瓣、根、果实、果皮、果壳、种子、花药、汁液、刺棘、芽、茎皮、浆果以及它们的混合物。优选的，白桑的未分化细胞从茎皮、汁液、芽和果皮中提取。白桑的未分化细胞可以从传统繁殖的植物中提取，或者从组织培养出的植物中提取。传统繁殖指的是传统的培养方式，也就是说在室外或在温室中，在土地里、在非地表上或在溶液中进行的培养。组织培养一般指本领域的技术人员通过人工方式从植物或植物的某部分中进行提取。不同于传统繁殖的是，当白桑植物细胞在培养容器中生长时，通过物理化学条件的压力能够过滤出杂质，提取出合格的植物细胞，且该细胞能保鲜整年。按照本发明，最好可以使用组织培养的植物的未分化细胞。白桑未分化细胞的提取最好在培养基中进行。白桑的未分化细胞可以使用之前记载的任意一种的方法进行提取。比如由E.F.乔治和P.D.涉林顿在《商业实验室手册及目录》(ExegeticsLtd1984)的“使用组织培养进行植物繁殖”一文中描述的方法。根据本发明，可使用的最佳培养基一般为本领域技术人员所熟知的培养基。比如，B5培养基、MS培养基、赫勒培养基、WH培养基等等。在E.F乔治、DJM普托克和H.J乔治的“植物培养基：配制和用途”(ExegeticsLtd1987，1&2册)一文中记载了有关于这些培养基的完整说明。按照本发明，最好能够准备一些白桑的未分化植物细胞培养在MS培养基中。按照本发明，成分的特殊性及相关细节将通过单独示例的方式进行说明。本发明中关于化妆品成分的有效性的检测将在下述内容中进行说明。在检测中，使用了以下物质：1.白桑中的完整未分化细胞(最好是混合或分散在适用于化妆品的溶剂中)。这些白桑未分化细胞(最好是混合或分散在适用于化妆品的溶剂中)均采用以下方式提取而成：第一步：提取白桑细胞，并在组织培养基内进行培养。白桑细胞的提取采用的是传统的方法，然后采用从茎部开始连续移植的步骤。此次使用的是整套的B5培养基，购自Sigma-Aldrich(德国)公司。其他培养基也是可行的。第二步：从第一步中移植白桑细胞，并在组织培养基中进行培养，从而使白桑细胞得以增殖。第一步中白桑细胞的提取过程是在组织培养基中进行的(例如B5培养基)，在含有氧气和二氧化碳的体介质中(富含二氧化碳的空气能使其密度比达到2至5％)，在一个包含100次弱光照射的周期内，光照强度少于10lx(1至5lx)，在空气湿润的环境下放置1小时(湿度在75％左右)，富含二氧化碳(使其二氧化碳的密度达到5％)，温度保持30℃。其第二步增殖过程是指分别在弱光照射以及在空气潮湿(湿度在75％左右)富含二氧化碳(使空气中二氧化碳的含量达到5％)的环境下用大于100000lx光照射，并使其湿度达到45％。此次培养在亮室中进行，同时可以借助一个不透光的隔板，得以实现从黑暗环境到明亮环境的转变过程。第三步：在组织培养基中进行白桑细胞的提取，例如经过一次或多次清洗进行过滤，尤其要注意在操作过程中不破坏白桑细胞的细胞膜结构。第四步：白桑未分化细胞分散于载体中，比如分散甘油中。2.肽的混合物按照本发明，制备肽混合物需要使用以下成分：2.1肌肽肌肽是一种由β丙氨酸和组氨酸组成的二肽(CAS编号：305-84-0)，其分子量为226g，呈白色粉末状。2.2大米肽大米肽为大米蛋白质经蛋白酶作用后，再经特殊处理而得到的蛋白质水解产物，为溶液状态，含少于1％的大米提取物和少于1％的防腐药剂(例如抗菌药剂和抗真菌药剂)。本发明所述大米肽溶液是由Vincience以水解水稻提取蛋白质(Thymophytane)之名进行销售的大约含有0.3％的大米肽。2.3Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽为丙氨酸-山杨酸-亮氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苏氨酸六肽是一种使用在面霜中的活性成分。这个成分在国际多肽研究与治疗杂志(2013)19:217-224中，由安娜·奥勒杰尼克等人所发表的名为“质谱法对于丙氨酸-山杨酸-亮氨酸-赖氨酸-脯氨酸-苏氨酸六肽的测定”的一文中有相关说明(可在Springerlink.com中找到该文章)。这种六肽以溶液的形式出现，含有0.5％至6％的六肽(一般约5％)，置于由水和丁二醇组成的混合液中。2.4寡肽-1寡肽-1是一种含有少于60个氨基酸的肽。它也被认为是一种小蛋白或表皮生长因子。寡肽-1由BioOrganicConcepts公司(美国加利福尼亚州圣菲斯普林斯，邮编CA90670)以名为DermatienEGF进行销售，该产品为含有25％(重量)硫酸铵和低于0.01％(重量)寡肽-1的水溶液的形式。肽混合物的制备(MP1)是在一个配备有磁搅拌机的容器中进行，加入100ml的EGF(相当于0.01g的寡肽-1)，在常温下混合搅拌，再加入100ml含有5％(重量)Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽溶液，最后加入100g的肌肽，之后将100ml的(相当于0.3g的大米肽)进行搅拌。相比寡肽-1、大米肽和Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽的总干重，肽混合物MP1中肌肽的含量要多得多。其他从MP2到MP10的肽混合物，均是使用呈溶液状的EGF(溶液形式)和Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽(溶液形式)、肌肽(粉末状)以及(溶液形式)按照不同比例制备得到，如下表1。表1MP2到MP10的肽混合物中各成分的比例混合物MP2MP3MP4MP5MP6MP7MP8MP9MP10寡肽-1100ml100ml100ml100ml100ml100ml100ml100ml50mlAla-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽100ml100ml50ml50ml25ml50ml50ml75ml20ml肌肽50g25g25g50g25g15g5g40g15g大米肽100ml100ml100ml50ml50ml100ml25ml75ml40ml肽的混合最好在用于化妆品的溶剂中进行，例如甘油。按照本发明，本发明所述化妆品用组合物(水溶液)中包含一种或多种应用于化妆品中的赋形剂。这类成分同时还可能包含一种或多种常规化妆品佐剂，可以是脂肪体、有机溶剂、离子或非离子增稠剂、亲水性或亲脂性增稠剂、软化剂、保湿剂、遮光剂、稳定剂、润肤剂、硅树脂、消泡剂、香料、防腐剂、阴离子表面性剂、阳离子或非离子以及两性离子活性剂、载体、聚合物、推进剂、碱化或酸化剂，以及其他常用于化妆品领域和/或皮肤病学领域的成分。脂肪体可以是由一种油或蜡，或它们的混合组成。油是指在常温下的液体混合物。蜡是指在常温下的固体混合物或基本成固态的混合物，熔点一般高于35摄氏度。油类比如有矿物油(石蜡油)、植物油(杏仁油、坚果油、黑加仑籽油、西蒙得木油)、合成油(例如氢化角鲨烯)、醇类、草酰胺(月桂酰肌氨酸异丙酯)、酸类或者脂类(例如含有12至15个碳原子的苯甲酸醇，苯甲酸2-乙基己酯，棕榈酸酯，酸异丙酯，甘油三酯，柠檬酸/辛酸)、硅油(环二甲基硅酮，聚二甲基硅氧烷)或氟化油、聚亚烷基二醇、三烷基偏苯三酸酯(例如偏苯三酸三癸酯)。关于蜡类，可以采用棕榈蜡、蜂蜡、富氢化油、聚乙烯蜡、聚亚甲基蜡。关于有机溶剂，可以采用乙醇和低多元醇。有机溶剂可以在二元醇类和乙二醇醚中进行选择，比如乙二醇、聚乙二醇、丁二醇或二甘醇。亲水性增稠剂可以选择羧乙烯聚合物，如聚合物(Carbomer)以及路博润公司研发的聚合物(丙烯酸酯共聚物/含有10至30个碳原子的丙烯酸)；聚丙烯酰胺；聚合物和2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷的共聚物，最终使其成网状结构，和/或使其中和；2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸和丙烯酸羟乙酯的共聚物；纤维素衍生物，如羟乙基纤维素；多糖，特别是树胶，如黄原胶；以及它们的混合物。亲脂性增稠剂可以选择合成聚合物，如聚丙烯酸烷基酯(含10至30个碳原子)或改性粘土，如锂蒙脱石及其衍生物。本发明中的化妆品用组合物可以根据本领域技术人员的已有技术来进行制备。成分的形式可以是单一或复合型的乳化液(H表示油，E表示水：H/E、E/H、H/E/H或者E/H/E)，例如霜，乳或凝胶，可以是水凝胶或呈乳液的形式。还可以使用气雾剂的形式进行灌装，还可酌情采用泡沫或喷雾的形式。本发明中的化妆品用组合物最好为以乳化液/悬浮油包水或水包油的形式呈现，可以含酒精，或者不含酒精，同时应具有良好的白桑细胞分散性(特别是白桑)。一般情况下，乳化液应含有两性乳化剂、阴离子乳化剂、阳离子乳化剂及非离子乳化剂中的其中一种，可单独使用也可以混合使用。乳化剂应根据需要实现乳化液需要的形式(E/H或H/E)进行适当的选取。乳化液中还可以含有其他类型的稳定剂，如载体，凝胶聚合物或增稠剂。作为水/油乳化液制备用的表面活性剂，举例来说，可以采用烷基酯或山梨糖醇酯，甘油醚，糖类醚；有机硅表面活性剂，例如二甲基硅氧烷共聚比如有环二甲基硅酮的混合物，二甲基硅氧烷共聚物，烷基二甲基硅氧烷共聚比如有十二烷基聚甲基硅氧烷共聚；十六烷基二甲基硅氧烷共聚以及十六烷基二甲基硅氧烷共聚物，硬脂酸聚乙二醇混合物以及己酯混合物。最好能从烷基酯多元醇组中选出一个或多个共同乳化剂加入到其中。对于烷基酯多元醇，举例来说，我们可以采用乳化剂、非离子乳化剂如脂肪酸酯和甘油酯氧化烯(尤其是聚氧乙烯)；脂肪酸酯和脱水山梨醇酯氧化烯；氧化烯酯脂肪酸(氧乙烯和/或环氧丙烷)，例如PEG-100硬脂酸酯/甘油硬脂酸酯的混合物；醇醚脂肪(氧乙烯和/或环氧丙烷)，糖醚例如蔗糖硬脂酸酯，主要是烷基聚葡糖苷(APG)例如癸基糖苷和月桂基葡糖苷，鲸蜡硬脂甙，例如醇花生四烯酸的混合物，苯醇混合物和花生糖苷醇混合物。在其他乳化稳定剂或悬浮稳定剂中，更多地会使用间苯二甲酸聚合物或硫代酸聚合物，尤其是邻苯二甲酸盐/间苯磺/乙二醇的聚合物，例如二甘醇/邻苯二甲酸盐/间苯二甲酸/1,4-环己二醇的聚合物(国际化妆品原料名：Polyester-5)。对于乳液/悬浮液，其水相可以包含运用已知方法制备的非离子型多孔分散剂。为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例进行阐述。本发明在下述实施例中给出了一些样本，非限制性的，局部使用的化妆包成分。在这些样本中，包括冷却的未分化的白桑细胞(20毫升)、甘油(80毫升)以及MP1至MP10的混合物(20毫升)，在下文统称为活化剂(MCF)。如无特殊说明，试验所使用的材料或试剂均为市售产品，可以通过商业渠道购买获得，如试管重建人体表皮为法国里昂AlexandreFleming街4号Episkin公司销售的皮肤模型(F-69366)，在该公司网址上，记载了重建表皮相关的详细信息。专用培养基为加拿大安大略省IDLabs有限公司销售的“ModifiedMCDB153Medium”培养基，产品目录编号IS1141(www.idlabs.com)。MTT购自Sigma-Aldrich公司，产品编号M5655。MIB-1抗体购自Westbrook，ME(产品目录编号0505)。如无特殊说明，试验所使用的方法均为本领域公知的方法。如MTT检测法可参见下述网址：web.mnstate.edu/provost/mtt％20proliferation％20assay％20protocol.pdf实施例1：膏霜配方：MCF(**)为提取出的未分化新鲜白桑细胞(20ml)和甘油(80ml)的混合液，其中还添加了20ml的肽混合物(MP1至MP10)，即MCF(**)中未分化新鲜白桑细胞、甘油和肽混合物(MP1至MP10)的体积比为1:4:1。配制好的膏体粒度非常细腻，未分化的白桑细胞分散均匀。经化学特性分析，不含细菌、真菌，且成分稳定性高。另外可以分别加入1wt％、2.5wt％的MCF，制得类似成分的膏体。同时，相应减少水的用量，使总比例达到100％。实施例2：膏霜配方：MCF(**)为提取出的未分化新鲜白桑细胞(20ml)和甘油(80ml)的混合液，其中还添加了20ml的肽混合物(MP1至MP10)，即MCF(**)中未分化新鲜白桑细胞、甘油和肽混合物(MP1至MP10)的体积比为1:4:1。配制好的膏体粒度非常细腻，未分化的白桑细胞分散均匀。经化学特性分析，不含细菌、真菌，且成分稳定性高。另外可以分别加入1wt％、2.5wt％的MCF，制得类似成分的膏体。同时，相应减少水的用量，使总比例达到100％。实施例3：乳霜水相A：在润肤品中加入去离子水油相B：乳化剂+润肤剂或润肤物质+油C相：防腐剂、香精D相：活性产品：含提取出的未分化白桑细胞(分散于适合制作化妆品的溶剂中，特别是甘油)和肽混合物(MP1到MP10)，呈粘稠的悬浮液状或啫喱状。实施例4：爽肤水爽肤水只属于水相A，由去离子水、丙二醇、防腐剂、香精和活性产品等基本成分组成。其中活性产品含提取出的未分化白桑细胞(分散于适合制作化妆品的溶剂中)和肽混合物(MP1至MP10)，呈粘稠的悬浮液状或啫喱状。实施例5：洗发水洗发水只属于水相A，由去离子水、表面活性剂、起泡剂、增稠剂、香精和活性成分等基本成分组成。其中活性产品含提取出的未分化白桑细胞(分散于适合制作化妆品的溶剂中)和肽混合物(MP1至MP10)，呈粘稠的悬浮液状或啫喱状。实施例6：啫喱在水相A或油相B中添加乳化剂类和增稠剂类成分，可以配制出水凝胶和油凝胶。C相：香精、防腐剂D相：提取出的未分化白桑细胞(分散于适合制作化妆品的溶剂中)和肽混合物(MP1至MP10)，呈粘稠的悬浮液状或啫喱状。实施例7：化妆水化妆水只属于水相A，由去离子水、香精、防腐剂和活性产品等基本成分组成。其中活性产品含提取出的未分化白桑细胞(分散于适合制作化妆品的溶剂中)和肽混合物(MP1至MP10)，呈粘稠的悬浮液状或啫喱状。实施例8：乳液水相A：主要由去离子水组成油相B：油+乳化剂+润肤剂C相：防腐剂+润肤成分D相：活性成分：含提取出的未分化白桑细胞(分散于适合制作化妆品的溶剂中)和肽混合物(MP1至MP10)，呈粘稠的悬浮液状或啫喱状。上述实验中，与乳霜、啫喱或乳液相关的相A、相B、相C、相D，按常规方法混合，可根据不同用途调整它们之间的比例，男士化妆品与其配制方法相同。对于爽肤水、化妆水和洗发水这类针对特定区域使用的化妆品，所含成分不同，只能在水相中根据不同用途调整用量并加以混合，男士化妆品与其配制方法相同。未分化白桑细胞(完整)和肽混合物(MP1至MP10)的比例取决于特定护理区域化妆品的性质和期待的使用效果。很显然，该发明并不仅限于上述几种实验，还可根据特定区域的护理需求，配制其他质地的化妆品，如油类、乳霜、发胶、脂粉(粉底，口红，化妆笔，睫毛膏或其他可以突出眼部效果、为睫毛上色、增长或增厚睫毛的化妆品、眼影)。试验例1：检测发明中所含成分的有效性检测前，需备好一份化妆品基底溶液(由乙醇和水组成)，用这种溶液分别准备一份“对照溶液”(control)和一份按照本发明调配的、成分类似的“实验溶液”。在“试验溶液”中加入由分散在甘油中的未分化的完整白桑细胞和MP1肽混合物组成的活化剂(其中含干重2％的未分化的完整白桑细胞和干重大概为0.03％的MP1肽混合物)。检测前，需使用一块试管重建人体表皮，其中人体角化细胞已经在空气/液体交界面中用专用培养基培养了14天，该培养基每两天更换一次。经过14天培养，重建表皮可用于检测实验。A、毒性检测1、试验试剂：对照溶液按照实施例1分散均匀，不含MCF(未分化的完整的白桑细胞、甘油和MP1肽混合物)试验溶液按照实验1分散均匀，加入MCF(未分化的完整的白桑细胞、甘油和MP1肽混合物)。2、试验方法：每平方厘米重建表皮分别用10μL两种试验试剂与重建表皮接触。放置24小时后，用10％浓度的甲醛水溶液固定表皮标本。采用苏木精－伊红染色法对4μm厚的表皮垂直截面进行染色，在光学显微镜下观察表皮中不同层次细胞的染色情况。将两种处理过的重建表皮与未处理过的重建表皮进行对比。结果显示，对照溶液处理过的表皮和试验溶液处理过的表皮与未经处理的表皮结构相似，从而确定在处理过的表皮中细胞可以存活，并且试验溶液不具毒性。B、组织切片检测和MTT检测试验中需使用水质活化剂(下文中称“活化剂”)。该活化剂由分散在甘油中的未分化的完整白桑细胞和MP1肽混合物组成(上述活化剂中，细胞干重占2％，MP1肽干重约占0.03％)。根据重建表皮的重量，分别以表皮重量的0.5wt％、1wt％、2.5wt％的比重涂抹活化剂进行处理。以未经活化剂处理的表皮做对照。对表皮细胞标本进行组织切片，采用苏木精－伊红染色法进行染色，在光学显微镜下观察表皮细胞的染色情况。将经不同含量活化剂处理过的重建表皮与未处理过的重建表皮进行对比，结果见图1A到1D。结果显示，放置24小时甚至48小时后，经不同含量活化剂处理过的重建表皮与未经处理的重建表皮相似。涂抹或未涂抹活化剂的重建表皮细胞在37℃条件下放置24小时后，用培养基冲洗，然后再放入另外的培养皿中，加入200μL的MTT溶液(MTT浓度为5mg/mL)。37℃培养4小时。这期间，形成的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)的分量与琥珀酸脱氢酶成反比。加入200μL二甲基亚砜后，各个培养皿被清空，细胞溶化，蓝紫色结晶甲瓒溶解。待颜色变均匀后，用分光光度计在570nm波长下测定各个培养皿中的细胞颜色。对经活化剂处理的表皮和未经活化剂处理的表皮进行分光光度分析，结果见图2。结果显示，在570nm波长下，处理过的重建表皮和未经处理的表皮之间不存在光学密度上的差异。并不存在570nm波长上的显著光学密度差异(平均差异低于1.5％)。表明活性剂对表皮无害。C、对合成胶原蛋白的检测经过处理和未经处理的表皮在37℃条件下放置24小时后，进行离心操作，回收纤维母细胞，放入4℃条件下、浓度为0.5mL/L的乙酸溶液中，在胶原酶作用下降解24小时。经过1000g离心处理，胶原蛋白在NaCl溶液中沉淀出来。把沉淀出来的胶原蛋白物制成悬浮液，然后透析提取。用邻苯二甲醛测定伯胺，以排除它们造成的干扰。同样，在4-氯-7-硝基苯并呋喃作用下测定脯氨酸和羟基脯氨酸。与羟基脯氨酸偶合的NBD由HPLC分离、测定(需要先进行校准)。对处理和未经处理的不同表皮的胶原蛋白样本进行HPLC分析，结果见图3。结果显示，仅用占表皮比重0.5％的活化剂处理后，表皮中的羟基脯氨酸含量就会显著增加。与未经处理的表皮相比，用活化剂处理过的表皮放置24小时后测定的羟基脯氨酸含量高出25％，用2.5％活化剂处理过的表皮中的羟基脯氨酸含量甚至高出将近40％。表明，与未经处理的表皮相比，活化剂处理过的表皮(按照表皮重量的2.5％使用)可以促进合成将近40％之多的胶原蛋白总量。D、对有丝分裂指数的测定经过处理和未经处理的表皮在37℃条件下放置24小时后，用10％浓度的甲醛水溶液固定表皮标本。将固定在甲醛中的表皮放入石蜡包埋盒中，切成薄片后进行免疫组化。使用MIB-1抗体完成这一化学反应，经热预处理后，采用过氧化物酶-抗过氧化物酶法得出最终结果。显影液DAB(3.3-二氨基联苯胺)染色后，细胞切片中的Ki-67核抗原呈褐色，其增长表达分成以下几个阶段：G1和S＝细胞潜伏及合成阶段G2＝细胞化合物的释放阶段M＝有丝分裂250倍放大镜下，在每层切片取10个区域，通过计算相应的核抗原数量判定有丝分裂指数，并与未处理表皮最终测定的核抗原数量进行对比，结果见图4。结果显示，仅用占表皮比重0.5％的活性剂处理后，表皮中细胞标记物的数量就会显著增加。图5A、5B、5C、5D为经过彩色显影液染色后，从组织学角度显示的未处理的表皮及处理的表皮中Ki-67核抗原的结果。结果显示在用2.5％比重的活化剂作用后的表皮中，核抗原数量增长量超过20％，有丝分裂指数增长超过27％。E、对丝聚蛋白的测定将经过处理和未经处理的表皮在37℃条件下放置24小时后，转移至-18℃冻存。将冷冻的细胞放入石蜡包埋盒中，然后切片，进行免疫组化检测。在显微镜下观察检测丝聚蛋白的数量变化，结果见图6A、6B、6C、6D。结果显示，经过冻存后，未处理表皮中颗粒层的丝聚蛋白数量密集且持久；而经过处理的表皮的颗粒层中，丝聚蛋白的锲形构象密度较低，说明表皮分化的标志物减少。上述实验表明，本发明所述活化剂包含未分化的完整的白桑细胞和含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽、寡肽-1的肽混合物，为无毒的化妆品成分，未分化的完整的白桑细胞与含肌肽、大米肽、Ala-Asp-Leu-Lys-Pro-Thr六肽、寡肽-1的肽混合物之间存在某种化学作用，可以增加化妆品的使用功效，可以显著促进胶原蛋白的合成，促进细胞增殖，同时减缓表皮分化。在化妆品基础液中添加本发明所述活化剂还能显著促进表皮细胞再生。应当指出的是，上述实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进，这些改进和也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3