一种治疗肝脏疾病的药物组合物及应用的制作方法

文档序号:11090744阅读:383来源:国知局
一种治疗肝脏疾病的药物组合物及应用的制造方法与工艺

本发明涉及医药领域,具体涉及一种治疗肝脏疾病的药物组合物及应用。



背景技术:

叶绿素铜钠(Sodium copper chlorophyllin)又称铜叶绿素钠,通过有机溶剂(如丙酮)提取蚕粪或植物叶子,经皂化(用氢氧化钠的甲醇溶液除去甲基和叶绿基酯基)后用氧化铜铜化而成。其化学命名为Sodium copper chlorophyllin,分子式为C34H29CuN4Na3O6,分子量:722.13。CAS号:65963-40-8。叶绿素铜钠为墨绿色粉末。易溶于水,略溶于醇和氯仿,微溶于乙醚,偏酸性 (pH6.5以下),如有钙离子存在时则有沉淀析出。

叶绿素铜钠盐、铁钠盐、钴钠盐是良好的造血细胞复合剂,对放疗后及各种原因引起的血细胞减少症和各种贫血有治疗作用。有研究报道叶绿素铜钠可以通过阻断THP-1细胞中NF-kB信号通路抑制由疮疱丙酸杆菌引起的IL-8和MCP-1分泌。在对大鼠肝细胞线粒体和pBR322质粒的体外实验中证实叶绿素铜钠能够通过抗γ射线引起的氧化作用和DNA损害保护线粒体,还被证实能够抑制HaCaT细胞中由UVB刺激引起的ROS积累。叶绿素铜钠也被证实能够通过端粒酶活性和COX-2表达抑制HT29细胞生长,使其阻碍于G1期。

据认为,叶绿素铜钠有其多重双键,可能会中和自由电子,拮抗致癌物质的作用。例如,有报道说叶绿素铜钠可抑制黄曲霉毒素B1(AFB1)对-DNA的结合, 因此可能有抗癌变的作用。但是,还没有严格的科学证据来证明叶绿素铜钠的抗癌功能。叶绿素铜钠被用于宠物饲料的添加剂,以及食品色素。至今,尚无关于以叶绿素铜钠为活性成分的药物治疗肝病的研究报道,而叶绿素铜钠存在不稳定、容易降解的缺点,放置3个月后,其有效成分降解到20%。



技术实现要素:

本发明的目的在于克服现有技术的缺点,提供一种治疗肝脏疾病的药物组合物及应用,该药物组合物对肝脏疾病的治疗有显著的作用,且得到的产品有效成分叶绿素铜钠稳定,不易降解。

本发明的目的通过以下技术方案来实现:一种治疗肝脏疾病的药物组合物,它由下述重量份的原料组成:

叶绿素铜钠: 10~50; 微晶纤维素: 100~163;

乳糖: 110~155; 硫脲: 0.1~5;

羟丙纤维素: 8~25; 二氧化硅: 0.5~17。

进一步地,它由下述重量份的原料组成:

叶绿素铜钠: 18~35; 微晶纤维素: 110~143;

乳糖: 127~145; 硫脲: 0.3~3.1;

羟丙纤维素: 10~17; 二氧化硅: 10~15。

作为优选方案,它由下述重量份的原料组成:

叶绿素铜钠: 22; 微晶纤维素: 135;

乳糖: 135; 硫脲: 0.58;

羟丙纤维素: 12; 二氧化硅: 2.92。

进一步地,所述治疗肝脏疾病的药物组合物的含水量为3~10%。

作为最优方案,所述治疗肝脏疾病的药物组合物的含水量为3.8%。

进一步地,所述治疗肝脏疾病的药物组合物的剂型为胶囊剂、片剂或颗粒剂。

作为最优方案,所述治疗肝脏疾病的药物组合物的剂型为胶囊剂。

所述的药物组合物在治疗肝脏疾病或其肝脏疾病引起的并发症药物中的应用。

进一步地,所述肝脏疾病为肝纤维化、肝硬化或肝炎。

所述的肝脏疾病具有如下单一或任意组合的症状:

(1)肝纤维化、肝硬化;由肝病引发的肝脏炎症;系统性炎症;

(2)肝硬化的代偿期以及失代偿期的症状。包括肝功损害,门脉高压症。肝硬化症状,包括全身症状为乏力、消瘦、面色晦暗,尿少、下肢水肿。也可能用于胃肠功能紊乱甚至吸收不良综合征,肝源性糖尿病等症状;

(3)肝硬化晚期的辅助治疗。包括缓解肝硬化病人出现门脉高压,腹腔积液、胸腔积液、食管-胃底静脉曲张,腹壁静脉曲张;

(4)用于肝脏疾病,肝硬化而产生的肠道菌群紊乱;

(5)用于平衡肠组织炎症的预防,治疗。

本发明具有以下优点:本发明的药物组合物通过与其他成分的合理配伍,提高了叶绿素铜钠的稳定性,药品放置3个月后基本不降解;且发现当产品的含水量为3.8%时,稳定性最好;本发明的药物组合物通过实验证实能治疗肝脏疾病,包括肝纤维化、肝硬化、肝炎以及肝脏疾病引起的并发症。

附图说明

图1为本发明药物组合物对小鼠肝脏外观的恢复示意图;

图2为本发明药物组合物对小鼠肝脏坏死的拮抗示意图;

图3为肝脏组织Massion’s Trichrome组织染色结果;

图4为依据Batts-Ludwig肝脏纤维化分类标准的单盲测验打分;

图5为肝脏组织Sirius Red组织染色结果;

图6为Sirius Red组织染色阳性面积统计;

图7为肝脏组织a-SMA、I型胶原、III型胶原RT-PCR结果;

图8为肝脏组织a-SMA、纤连蛋白、β-Actin、GAPDH蛋白质免疫印迹结果;

图9为本发明的药物组合物对小鼠肝脏炎症因子的拮抗示意图;

图10为本发明药物组合物对小鼠系统下炎症的拮抗示意图;

图11为本发明药物组合物对小鼠肝脏基质金属蛋白酶及其抑制剂的再平衡示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述,本发明的保护范围不局限于以下所述:

实施例1:一种治疗肝脏疾病的药物组合物,它由下述重量份的原料组成:

叶绿素铜钠: 10; 微晶纤维素: 100;

乳糖: 110; 硫脲: 0.1;

羟丙纤维素: 8; 二氧化硅: 0.5。

所述治疗肝脏疾病的药物组合物的剂型为胶囊剂,含水量为3%。

实施例2:一种治疗肝脏疾病的药物组合物,它由下述重量份的原料组成:

叶绿素铜钠: 50; 微晶纤维素: 163;

乳糖: 155; 硫脲: 5;

羟丙纤维素: 25; 二氧化硅: 17。

所述治疗肝脏疾病的药物组合物的剂型为颗粒剂,含水量为10%。

实施例3:一种治疗肝脏疾病的药物组合物,它由下述重量份的原料组成:

叶绿素铜钠: 18; 微晶纤维素: 110;

乳糖: 127; 硫脲: 0.3;

羟丙纤维素: 10; 二氧化硅: 10。

所述治疗肝脏疾病的药物组合物的剂型为片剂,含水量为4%。

实施例4:一种治疗肝脏疾病的药物组合物,它由下述重量份的原料组成:

叶绿素铜钠: 35; 微晶纤维素: 143;

乳糖: 145; 硫脲: 3.1;

羟丙纤维素: 17; 二氧化硅: 15。

所述治疗肝脏疾病的药物组合物的剂型为胶囊剂,含水量为3~10%。

实施例5:一种治疗肝脏疾病的药物组合物,它由下述重量份的原料组成:

叶绿素铜钠: 22; 微晶纤维素: 135;

乳糖: 135; 硫脲: 0.58;

羟丙纤维素: 12; 二氧化硅: 2.92。

所述治疗肝脏疾病的药物组合物的剂型为片剂,含水量为3.8%。

以下通过试验说明本发明的有益效果:

1.本发明药物组合物对肝脏外观恢复的影响

(1)材料与方法

雄性Balb/c小鼠、饲料均购自中国北京华阜康生物科技股份有限公司;本发明的药物组合物由成都通德药业有限公司生产,一抗(纤连蛋白、α-SMA、GAPDH和β-Actin)由美国Santa Cruz Biotech公司提供。4-6周龄的SPF级雄性Balb/c小鼠,体重为20-25克,室温(约24 oC)条件下,给予小鼠自由饮水与进食,并接受12小时昼夜更替光照。

在对小鼠进行一定剂量四氯化碳腹腔注射条件下,小鼠产生肝纤维化的典型症状。一般认为四氯化碳经肝微粒体CYP450活化后产生三氯甲基自由基,引起细胞膜和细胞器膜的不饱和脂肪酸过氧化,从而改变膜的流动性和通透性,使膜的Ca2+—ATP酶失活,胞质内Ca2+浓度升高,破坏细胞骨架,激活磷脂酶,损伤细胞膜结构特别是线粒体呼吸链紊乱,引起细胞死亡。肝实质细胞受损后释放信号分子激活肝脏内巨噬细胞炎症信号通路,并释放促炎因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素-1B、白细胞介素-6和干扰素(IFN)等,从而导致炎性反应的发生,以利于机体清除有害因素,但过度的免疫炎性反应导致了大量肝细胞的损伤,引起肝细胞凋亡和坏死,并且使得处于静息状态的肝星状细胞(hepatic stellate cells)转分化(trans-differentiation)为激活状态的成肌纤维细胞(myofibroblasts),并分泌α-SMA、I型胶原,引起细胞外基质(ECM)沉积,并最终导致肝纤维化的发生。因此,我们采用该动物模型来测定本发明药物组合物对肝纤维化、肝硬化的拮抗作用。

4-6周龄的SPF级雄性Balb/c小鼠先经过2周的正常饲料喂养,适应环境后,随机分为3组,每组6只。

第1组,“正常对照组”:给予正常饲料(AIN93)和RO水喂养,8周。

第2组,“肝纤维化造模组”:给予四氯化碳腹腔注射,每周2次,8周。

第3组,“治疗组”:给予四氯化碳腹腔注射,每周2次,8周,同时在饮用水中加入本发明药物组合物,浓度为0.025mg/ml;每日总摄入量0.125mg.

(2)实验结果:

在实验喂养期间,每次注射前记录一次实验小鼠体重及毛色等生长情况,第8周终止实验,处死小鼠,收集肝脏进行后续实验。

肝脏外观结果如图1所示,相比于正常对照组小鼠,

(1)与正常对照组比较,“肝纤维化造模组”肝纤维化小鼠经过四氯化碳腹腔注射8周后产生肝脏纤维化,肝脏明显缩小;宽度由3cm减少到不足2.5cm。

(2)治疗组,经过本发明药物组合物在喂养8周后,肝脏外观显著恢复,在治疗后宽度下降恢复到接近正常水平;宽度由2.5g上升为2.8g。

如图1所示,第一,经过8周注射,“肝纤维化造模组”的小鼠的肝脏宽度降低到2.5cm,明显低于于正常对照。第二,在饮用水中添加本发明药物组合物可以有效地恢复肝脏外观,由2.5g上升为2.8g。经过8周处理后,小鼠肝脏宽度恢复了12%,接近正常对照的水平。

2.本发明药物组合物对肝脏细胞坏死的拮抗

肝脏发生细胞坏死是肝脏纤维化发生发展的主要症状之一。 肝脏细胞发生可观察到的坏死,说明肝脏进入免疫耐受状态,无法清除受损发生坏死的组织。如图3所示,肝脏坏死可以通过肝脏的H&E染色切片观察到。 在四氯化碳腹腔注射下,小鼠肝脏组织出现典型的坏死,如箭头所示。 四氯化碳腹腔注射可以有效地增多组织坏死的出现,暗示肝脏处于免疫耐受状态,发生纤维化。而给予本发明药物组合物治疗,小鼠的肝脏组织外观发生显著改善,其状态与正常对照组水平相似。

小鼠的肝脏组织H&E染色见图2,相比于正常对照组小鼠,

(1)“肝纤维化造模组”,肝纤维化造模组”肝纤维化小鼠经过四氯化碳腹腔注射8周后产生肝脏组织坏死;

(2) 治疗组,经过本发明药物组合物在喂养8周后,肝脏切片形态恢复到正常水平。

如图2所示,肝脏组织切片H&E染色结果,观察其肝脏组织形态,正常小鼠肝脏组织健康有序,在四氯化碳腹腔注射下,小鼠的肝脏组织中可观察到发生组织坏死,而给予本发明药物组合物治疗的小鼠的肝脏组织形态得到显著恢复,接近正常对照组水平。

3.本发明药物组合物对小鼠肝脏纤维化的拮抗

胶原纤维,或称细胞外基质在肝脏组织内的沉积是肝脏纤维化、肝硬化最主要的症状。在细胞水平上,肝脏纤维化的实质是肝脏星状细胞的激活与转分化,形成肌成纤维细胞。 组织纤维化可以为肿瘤的形成提供生长环境。Masson’s trichrome组织染色和Sirius Red 组织染色结果显示,在四氯化碳腹腔注射下,小鼠肝脏组织出现明显的纤维桥。四氯化碳腹腔注射可以有效地增多纤维沉积出现,说明小鼠处于肝脏纤维化乃至肝硬化的状态。而给予叶绿素铜钠,小鼠的肝脏内纤维沉积明显减少,纤维桥变细乃至消失,其状态与正常对照组水平相似。同时我们采用单盲测试(single-blind trail)打分,评分标准采用Batts-Ludwig肝脏纤维化分类标准,具体为: 0=无纤维化,1=门静脉纤维化,2=门静脉周纤维化,3=形成纤维桥,4=坏死。结果造模组小鼠肝脏纤维化得分为3分左右,大部分形成明显纤维桥,而治疗组小鼠肝脏纤维化得分为1分左右,显著低于肝纤维化造模组,恢复至接近正常对照组,Sirius Red染色阳性面积统计也得到类似结论。此外,我们应用了RT-PCR分析技术从mRNA转录水平定量肝纤维化的程度。四氯化碳腹腔注射可以有效地增加促进肝脏纤维化关键基因a-SMA、I型胶原、III型胶原的表达,叶绿素铜钠治疗组小鼠该类基因表达量则显著下降,恢复至或接近正常对照水平。此外,我们应用了蛋白质免疫印迹技术从蛋白水平半定量肝纤维化的程度。四氯化碳腹腔注射可以有效地增加衡量肝脏纤维化关键蛋白质a-SMA、纤连蛋白的蛋白质水平表达,本发明药物组合物治疗组小鼠该类蛋白质表达量则显著下降,恢复至或接近正常对照水平。因此在饮用水中添加10mg/ml的叶绿素铜钠可以有效地抵御肝脏纤维化。

肝脏组织Massion’s Trichrome组织染色结果见图3-8,依据Batts-Ludwig肝脏纤维化分类标准的单盲测验打分见图4,肝脏组织Sirius Red组织染色结果见图5,Sirius Red组织染色阳性面积统计见图6,肝脏组织a-SMA、I型胶原、III型胶原RT-PCR结果见图7,肝脏组织a-SMA、纤连蛋白、β-Actin、GAPDH蛋白质免疫印迹结果见图8;相比于正常对照组小鼠,

(1)“肝纤维化造模组”,肝纤维化造模组”肝纤维化小鼠经过四氯化碳腹腔注射8周后产生肝脏纤维化

(2) 治疗组,经过本发明药物组合物喂养8周后,肝脏纤维化恢复到正常对照水平。

如图3-8,我们从mRNA转录水平、蛋白质水平、组织形态学水平的不同染色方法鉴定了,正常小鼠肝脏组织无纤维化发生,在四氯化碳腹腔注射下,小鼠的肝脏发生严重纤维化,而给予本发明药物组合物治疗的小鼠的肝脏组织纤维化得到显著改善,接近正常对照组水平。因此,通过动物实验,我们证明应用本发明药物组合物可显著改善肝脏纤维化。

4.本发明药物组合物对小鼠肝脏炎症因子的拮抗

肝脏星状细胞由静息状态发生激活与转分化需要促纤维化因子组织生长因子-β(TGF-β)和促炎症因子的刺激。激活的成肌纤维细胞分泌α-SMA、Ⅰ型胶原,引起细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)沉积,并最终导致肝纤维化的发生。我们应用了RT-PCR分析技术从mRNA转录水平定量肝脏促炎因子基因表达的程度。四氯化碳腹腔注射可以有效地增加肝脏内促炎因子基因白介素-1β、白介素-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,本发明药物组合物治疗组小鼠该类基因表达量则显著下降,恢复至或接近正常对照水平。

肝脏组织白介素-1β、白介素-6、肿瘤坏死因子-α的RT-PCR结果见图9;相比于正常对照组小鼠,

(1)“肝纤维化造模组”,肝纤维化造模组”肝纤维化小鼠经过四氯化碳腹腔注射8周后产生肝脏炎症基因表达量明显上调;

(2) 治疗组,经过本发明药物组合物喂养8周后,肝脏炎症基因表达量下降或者恢复到正常对照水平。

如图3-8,我们从mRNA转录水平鉴定了,正常小鼠肝脏组织无炎症或者炎症程度较低,在四氯化碳腹腔注射下,小鼠的肝脏发生炎症,而给予本发明药物组合物治疗的小鼠的肝脏组织炎症得到显著改善,接近正常对照组水平。因此,通过动物实验,我们证明应用本发明药物组合物可显著改善肝脏炎症。

5.本发明药物组合物对小鼠系统性炎症的拮抗

由单核巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子α(TNF-α)在病理状态下分泌量增加可引起各种炎症因子的瀑布式爆发,导致机体发热、休克等。 肝纤维化、肝硬化常常伴随着机体系统性炎症,而血清中肿瘤坏死因子α含量是衡量系统性炎症的重要标准。我们应用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测了血清中TNF-α含量,在四氯化碳腹腔注射下,小鼠血清中TNF-α明显升高,说明小鼠处于系统性炎症状态。而给予本发明药物组合物,小鼠血清中TNF-α明显减少,其水平与正常对照组相似。

血清TNF-α的ELISA结果见图10;相比于正常对照组小鼠,

(1)“肝纤维化造模组”,肝纤维化造模组”肝纤维化小鼠经过四氯化碳腹腔注射8周后产生系统性炎症

(2) 治疗组,经过本发明药物组合物喂养8周后,机体系统性炎症得到缓解。

通过检测血液中TNF-α含量来衡量机体系统炎症水平,结果正常小鼠的血液TNF-α含量为69.89±9.70ng/L,在四氯化碳腹腔注射下上升至105.40±18.63 ng/L,给予本发明药物组合物后降至62.46±3.75 ng/L,有效降低了四氯化碳腹腔注射诱导的系统炎症。通过动物实验,我们证明应用本发明药物组合物可显著改善由于肝脏纤维化导致的系统性炎症。

6.叶绿素铜钠对小鼠肝脏基质金属蛋白酶及其抑制剂的再平衡

肝脏纤维化的实质是I型胶原为主的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)合成与降解失衡,在肝内过度沉积。这种过度沉积不仅是由于ECM合成增多,还有相当部分原因是由于降解减少。而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)及其抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)是调节ECM降解的主要酶系。在正常生理情况下,肝脏内的基质金属蛋白酶降解胶原,但其活性又受到对应抑制因子的抑制,两者形成动态平衡,使肝脏内胶原维持在一个稳定水平。但当肝脏处于病理状态下,如病毒性肝炎、酒精性肝炎或者非酒精性肝炎,两者之间的平衡被打破,导致胶原沉积,并最终形成肝脏纤维化乃至肝硬化。我们应用了RT-PCR分析技术从mRNA转录水平定量肝脏内与纤维化相关的基质金属蛋白酶基因及其对应抑制因子表达的程度,并将每只小鼠对应MMP/TIMP基因表达量比值进行了计算。四氯化碳腹腔注射可以有效地降低肝脏内MMP-9/TIMP-1、MMP-14/TIMP-2比值,本发明药物组合物治疗组小鼠肝脏MMP-9/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1和MMP-14/TIMP-2比值显著上调,恢复至正常对照水平。

肝脏组织MMP-9/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1和MMP-14/TIMP-2基因表达量比值的结果见图11;相比于正常对照组小鼠,

(1)“肝纤维化造模组”,肝纤维化造模组”肝纤维化小鼠经过四氯化碳腹腔注射8周后MMP-9/TIMP-1、MMP-14/TIMP-2比值下调

(2) 治疗组,经过本发明药物组合物喂养8周后,肝脏MMP-9/TIMP-1、MMP-13/TIMP-1和MMP-14/TIMP-2比值显著上调。

如图3-8,我们从mRNA转录水平鉴定了,正常小鼠肝脏组织基质金属蛋白酶与其抑制因子维持平衡,在四氯化碳腹腔注射下,小鼠的肝脏受损,基质金属蛋白酶与其抑制因子动态稳态被打破,导致胶原的沉积并最终发生纤维化,而给予本发明药物组合物治疗的小鼠的基质金属蛋白酶与其抑制因子基因表达量比值显著升高,暗示本发明药物组合物治疗肝脏纤维化实质是增强了胶原的消融。因此,通过动物实验,我们证明应用本发明药物组合物可显著改善各类肝病导致的机体肝脏基质金属蛋白酶与其抑制因子的紊乱。

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