GINS2基因或蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用的制造方法与工艺

文档序号:11093834
GINS2基因或蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用的制造方法与工艺
本发明涉及生物医药技术领域,具体地说,涉及GINS2基因或蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术:
随着人类生活习惯和行为模式的改变,以及农工业发展过程带来的环境污染和人口老龄化等原因,恶性肿瘤成为人类致死的主要疾病。世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC/WHO)的最新数据显示恶性肿瘤在全球的发病率呈上升趋势,2008年760万人死于恶性肿瘤,其中64%发生在发展中国家。在我国,肿瘤防治面临的形势也极为严峻,最新报告显示,在过去30年间,我国恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈明显上升趋势;据预测,在未来20-30年间,我国恶性肿瘤发病率和死亡率不断上升的趋势将继续维持。因此,对肿瘤的研究是生命科学和医学领域的持续研究热点之一。恶性肿瘤传统疗法如放疗、化疗和手术治疗的局限性促使人们寻找新的抗肿瘤方法。随着对肿瘤发生发展分子机制认识的深入,人们已意识到肿瘤是一种基因病,纠正发生缺陷的基因可为肿瘤的治疗提供新的希望。近年来发展了许多针对肿瘤的基因治疗方法的研究,但迄今为止进入临床应用的几种基因药物的临床疗效有限,且具有潜在的、长期的、延迟的副作用,因此,寻求治疗的新靶点和开发新的基因治疗方法已成为国内外肿瘤基因治疗的研究方向。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一门基因阻断技术,为一种双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子在mRNA水平上阻断特异基因的表达或使其沉默的过程,即序列特异性的转录后基因沉默(Post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)。近年来,RNAi已成为肿瘤基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等表达来抑制肿瘤的发生和发展。GINS2是DNA复制复合体GINS家族成员之一,位于人染色体16q24上,其mRNA长度为1196bp,编码相对分子质量为21000的蛋白质。GINS是一种复制解旋酶,在移动到复制叉前打开DNA双链。研究表明,GINS家族成员在癌症的发生中起一定作用,如GINS家族成员在侵袭性黑色素瘤中过表达,也有文献表明,DNA复制相关蛋白在不同细胞中有不同的作用,如在决定中心体复制数量和疾病发生的不同阶段方面,GINS均发挥了一定功能,特别是与染色体的分离密切相关。而目前关于GINS2在肿瘤相关领域的报道很少。

技术实现要素:
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供GINS2基因或蛋白的抑制剂的新用途。本发明提供了GINS2基因或蛋白的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。作为一种具体实施方式,所述的抑制剂选自以GINS2蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制GINS2蛋白表达或基因转录的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、反义核酸;或能表达或形成所述siRNA、dsRNA、miRNA、反义核酸的构建物。作为一个优选例,所述的抑制剂选自下列中的一种:a)siRNA,所述siRNA的靶序列如SEQIDNO.1所示;b)shRNA,所述shRNA的编码序列正义链如SEQIDNO.5所示,反义链如SEQIDNO.6所示;c)能够表达a)所述siRNA或b)所述shRNA的载体;d)包含c)所述载体的病毒。作为本发明的一种具体实施方式,所述的肿瘤为人乳头状甲状腺癌。本发明还提供了一种siRNA分子,所述siRNA的靶序列如SEQIDNO.1所示。本发明还提供了一种shRNA分子,所述shRNA的编码序列正义链如SEQIDNO.5所示,反义链如SEQIDNO.6所示。本发明还提供了一种表达载体,所述表达载体能够表达所述siRNA分子或所述shRNA分子。本发明还提供了一种病毒,其包含所述表达载体。作为本发明的一种具体实施方式,所述病毒为慢病毒。本发明还提供了一种抗肿瘤药物,其包含所述siRNA分子、所述shRNA分子、所述表达载体和/或所述病毒,以及药学上可接受的载体。本发明还提供了检测人GINS2基因或蛋白表达水平的试剂在制备乳头状甲状腺癌诊断试剂或试剂盒中的应用。本发明优点在于:1、本发明设计了针对人GINS2基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列,RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒,进一步检测了GINS2基因的沉默效率、GINS2-siRNA慢病毒对肿瘤细胞增殖能力和凋亡水平的影响,结果表明:(1)采用RNAi方法下调人GINS2基因的表达后可有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长并促进其凋亡,这一研究成果表明GINS2基因可促进肿瘤生长,是原癌基因,可作为肿瘤治疗的靶点,通过RNAi方式沉默GINS2基因的表达可作为抑制肿瘤发展的有效手段;(2)本发明的siRNA序列能够显著地特异性沉默人肿瘤细胞中内源GINS2基因的表达(沉默效率高达80.6%),显著优于常规方法所得的其他众多siRNA序列,表达该siRNA序列的慢病毒能够高效地抑制人肿瘤细胞的增殖和促进人肿瘤细胞的凋亡,因此本发明的siRNA序列、shRNA序列以及它们的构建体和病毒可用于制备高效的抗肿瘤药物。2、本发明证实人GINS2基因在乳头状甲状腺癌肿瘤组织和瘤旁组织表达差异显著,因此可作为乳头状甲状腺癌的诊断标志物。附图说明图1.GV115载体图谱。图2.载体线性化后目的片段的琼脂糖凝胶电泳图片。泳道1:1kbMarker:从上至下依次为10kb,8kb,6kb,5kb,4kb,3.5kb,3kb,2.5kb,2kb,1.5kb,1kb,750bp,500bp,250bp;泳道2:AgeI和EcoRI双酶切线性化后的载体质粒;泳道3:没有酶切的载体质粒。图3.RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图。图4.RNA干扰载体阳性克隆鉴定的琼脂糖凝胶电泳图片。泳道1:阴性对照(ddH2O),排除系统中外源核酸污染导致假阳性结果;泳道2:自连对照(空载体自连对照组);泳道3:250bpMarker:从上至下依次为5kb,3kb,2kb,1.5kb,1kb,750bp,500bp,250bp,100bp;泳道4-8:单克隆psc45562-1,2,3,4,5。图5.GINS2-RNAi慢病毒侵染人乳头状甲状腺癌K1细胞3天后,GINS2mRNA表达水平显著降低。图6.GINS2-RNAi慢病毒侵染人乳头状甲状腺癌K1细胞5天后,引起细胞增殖抑制。经shRNA慢病毒感染,细胞铺于96孔板。Celigo连续检测5天,发现实验组K1细胞的增殖速率受到显著抑制。提示GINS2基因与K1细胞的增殖能力显著相关。图7和图8.FACS检测GINS2基因消减对人乳头状甲状腺癌细胞周期的影响。shRNA慢病毒感染后第3天传代,第5天检测,实验组处于G1期的细胞显著减增多,实验组处于S期的细胞显著减少,处于G2/M期的细胞减少,提示GINS2基因与K1细胞的凋亡显著相关。图9和图10.FACS检测GINS2基因消减对凋亡的影响。shRNA慢病毒感染第3天传代,第5天检测,实验组发生凋亡的K1细胞显著增加,提示GINS2基因与K1细胞的凋亡显著相关。图11.人GINS2基因在乳头状甲状腺癌患者肿瘤组织和瘤旁组织的差异表达。具体实施方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解,实施例仅用于说明本发明,而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件。实施例1:针对人GINS2基因RNAi慢病毒的制备技术路线为:从Genbank中调取人GINS2基因序列;预测siRNA位点;合成针对GINS2基因的有效siRNA序列,两端含酶切位点粘端的双链DNAOligo;慢病毒载体双酶切后与双链DNAOligo连接,构建表达GINS2基因的siRNA序列的RNAi质粒;将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体共转染人胚肾细胞293T细胞,产生种族慢病毒颗粒,即可制得高效沉默GINS2基因的慢病毒。1、RNA干扰靶点设计及双链DNAoligo制备(1)设计合成针对人GINS2基因的有效的siRNA靶点从Genbank调取GINS2(NM_016095)基因信息;设计针对GINS2基因的有效的siRNA靶点。表1为针对GINS2基因的有效siRNA靶点序列。表1靶向人GINS2基因的有效siRNA靶点序列(2)DNAoligo序列合成根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列,并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外,在正链3’端添加TTTTT终止信号,而反链5’端添加终止信号互补序列。合成单链DNAoligo。表2两端含AgeI和EcoRI酶切位点粘端的单DNAOligo*CCGG:AgeI酶切位点;AATTC:EcoRI酶切位点;G:EcoRI酶切位点互补序列。(3)双链DNAoligo制备将合成的单链DNAoligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μM),90℃水浴15min。自然冷却至室温后,形成带粘性末端的双链,其序列为:正链:5’-CCGGGCGATTAACCTGAAACAAAGACTCGAGTCTTTGTTTCAGGTTAATCGCTTTTTG-3’(SEQIDNO.5);反链:5’-AATTCAAAAATCTTTGTTTCAGGTTAATCGCCTCGAGGCGATTAACCTGAAA...
当前第1页1 2 3 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1