本发明涉及一种具有良好生物相容性，可生物降解性的丝素蛋白纳米微球，可用作甲强龙和地塞米松药物缓释载体及其制备方法和应用。
背景技术：
：由交通事故、意外伤害或日常生活生产事故等导致的中枢神经系统损伤在临床极为常见。中枢神经系统损伤后会导致神经元死亡、裂解、减少和消失；进而大量炎症细胞侵入，胶质细胞和结蹄组织增生变多，从而产生许多功能性障碍，包括永久性的运动、感觉功能性障碍，给人们的生产生活带来了极大的不便，由此带来的经济负担也十分沉重。多年来,人们对中枢神经损伤后的再生与康复投入了大量人力、物力,但进展甚微,原因可能有:①神经元本身缺乏再生能力。②神经营养因子生成不足,包括靶源性营养因子的供给因轴突断裂而中断。③细胞外基质不适宜,损伤后产生了神经元生长的抑制因子。④损伤后局部胶质细胞形成坚硬的瘢痕,阻碍轴突的生长、穿过等。虽然很多学者和临床医生在相关方面也做了许多的努力，但是对于中枢神经系统损伤依然没有有效的治疗手段。而急性脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤，容易导致损伤平面以下的感觉功能和运动功能部分或者全部丧失，是脊柱外科领域中一种常见且破坏力极大的疾病。截至目前为止，甲强龙在治疗急性脊髓损伤在国内外已有较多报道，且疗效显著，但神经损伤后注射特定剂量甲强龙缓释时间长短会对神经系统恢复产生一定的影响。关于甲强龙的作用机理可能与提高神经元中酶的活性，抑制脂质水解作用，抑制钙离子介导的神经元丝的水解，促进神经元兴奋和突触的传递以及脊髓微血管渗透性的保护有关，但是人们一般认为中枢神经系统损伤后主要的治疗机理与甲强龙抑制脂质的过氧化和炎症反应有关。特定剂量的甲强龙给药在急性脊髓损伤中虽然具有抗氧化、抑制脂质过氧化从而对神经功能产生一定的修复功能，但是常常也会因为作用时间无法有效控制导致严重的毒副作用、药物浪费和病人的负担加重，甲强龙的疗效未完全发挥和一些毒副作用可能是由于它本身的毒性和作用时间与损伤后给药时间不匹配导致。因此有效的递送甲强龙达到损伤部位并控制甲强龙作用剂量和时间以产生良好的治疗效果和低的毒副作用是目前研究的重点方向。地塞米松是一类具有抗炎、抗过敏及抗免疫抑制类药物，对一些危重疾病及炎症的治疗具有良好的作用。近年来发现，地塞米松同样具有良好的神经保护作用，特别是神经损伤麻醉后基于一定剂量的地塞米松可以有效地降低损伤的发生，减少患者的痛苦，地塞米松对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成骨分化、增殖能力及凋亡率也有一定的影响。此外，地塞米松也可以协助对利多卡因等药物神经毒性保护作用。但是，地塞米松作为糖皮质激素类药物并不能长期给药，长期给药引起的毒副作用主要有溃疡病、血栓性静脉炎、活动性肺结核、精神症状易引起糖尿及类柯兴综合症等。其毒副作用与药量、疗程、给药途径密切相关。因此有效地针对神经损伤部位情况控制药物的释放放量以发挥最大的治疗效果，减少给药疗程也是当前研究的重中之重。丝素蛋白是一种天然大分子蛋白质，因其来源丰富、价格低廉，且具有良好的生物相容性和可控的生物降解性能，已经被广泛用于生物医用领域，特别是在药物缓释应用方面取得较为突出的成就，大量研究表明，丝素蛋白是一种非常理想的药物载体。但是丝素蛋白用于靶向药物缓释研究较少，极大的限制了丝素蛋白的应用前景。我们知道甲强龙作为治疗急性脊髓损伤的有效药物其发挥疗效的作用也与给药剂量和时间的长短有重要关系。一般来说，病人在损伤后3小时内接受甲强龙治疗治疗维持时间就相对较短，而在损伤后甲强龙治疗在3小时后甚至更晚就需要维持较长的时间。而针对神经损伤部位有效地控制地塞米松的释放量和缩短治疗周期对神经修复达到保护作用又不引起毒性反应也是至关重要,这就需要根据病人的损伤情况控制药物的作用时间。丝素蛋白作为良好的药物缓释载体，可以很容易制备成负载颗粒的纳米微球深入到组织内部和血管深处，且具有可控生物降解性，通过溶剂处理方法得到不同分子量的丝素蛋白就具有不同的降解速度，可以有效的控制甲强龙和地塞米松在损伤部位的释放速度，从而根据损伤情况选择不同降解速度的丝素蛋白作为载体，以达到良好的治疗效果，从而发挥丝素蛋白的应用范围和生物利用度。技术实现要素：本发明的目的是，提供一种具有良好生物相容性，可生物降解的，可负载甲强龙和地塞米松释放速度可控的丝素蛋白纳米微球及其制备方法和应用，以有效的解决甲强龙和地塞米松特定剂量作用于损伤部位时间的长短所带来的无法发挥应有疗效的缺陷以及甲强龙和地塞米松联合给药提高治疗效果同时可以减少两种药物毒副作用的优点等。为了解决上述缺陷，本发明采用以下技术方案：一种负载甲强龙和地塞米松释放速度可控的丝素蛋白纳米微球，甲强龙和地塞米松联合药物与载体的质量比为1:3-20，所述载体为脱丝胶后丝素蛋白纳米微球；所述丝素蛋白纳米微球是经过溶剂溴化锂溶解和盐酸或氢氧化钠处理的具有不同分子量的丝素蛋白纳米微球；所述负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球平均粒径为35-125nm。联合药物是甲强龙和地塞米松，两者的质量比为5:1-5，其与载体的质量比为1:3-20。所述的天然蚕丝纤维，是一种高分子的蛋白纤维，所述的高分子的蛋白纤维主要由丝素蛋白和丝胶蛋白构成，两者的成分质量比约为17:3-4：1，其中丝素蛋白作为蚕丝纤维的主要构成成分主要由18种氨基酸构成，其中丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)和甘氨酸(Gly)约占总组成的85％，三者的摩尔比为1:3:4。上述负载甲强龙和地塞米松释放速度可控的丝素蛋白纳米微球，是将天然蚕丝纤维脱丝胶后使用溶剂溴化锂溶解和盐酸或氢氧化钠水解，得到不同分子量的丝素蛋白纳米微球，其特征在于①使用溴化锂处理得到药物释放速度较慢的丝素蛋白微球；②使用盐酸或氢氧化钠处理得到药物释放速度较快的丝素蛋白微球。天然蚕丝脱丝胶的一种方法是，通过0.5±0.1％碳酸氢钠碱性溶液处理，经一至四次煮沸后清洗。本发明所述的负载甲强龙和地塞米松释放速度较慢的丝素蛋白微球，使用的溴化锂摩尔浓度是8.0-10M,水解温度为25-70℃，水解时间为180-250min，丝素蛋白与溴化锂溶液的质量体积比为1：20-25，经透析后待用；本发明所述的负载甲强龙和地塞米松释放速度较快的丝素蛋白微球，经盐酸或氢氧化钠处理得到快速药物释放速度的丝素蛋白，具体制备方法是盐酸或氢氧化钠摩尔浓度是0.3-1M，水解温度为70-80℃，水解时间60-180min,三元溶液溶解时间20-40min，丝素蛋白与三元溶液的质量体积比为1:3-8，盐酸或氢氧化钠与含丝素蛋白三元溶液体积比为1：2-6，透析后待用。所述的释放速度较慢与较快的丝素蛋白在溶解后，所述的慢速药物释放速度丝素蛋白透析截留分子量为12000-14000；快速药物释放速度丝素蛋白透析截留分子量为100-500。通过透析(慢速释放：截留分子量：12000-14000，快速释放：截留分子量：100-500)2-4天以去除盐分子，得到具有慢速和快速药物释放速度的丝素蛋白溶液。丝素蛋白水溶液透析后再通过稀释或浓缩而成质量0.5-5％丝素蛋白溶液。然后可制备出负载有甲强龙和地塞米松的释放速度可控的丝素蛋白纳米微球。上述负载甲强龙和地塞米松而释放速度可控的丝素蛋白纳米微球的制备方法，具体步骤如下：首先将甲强龙和地塞米松(质量比5:1-5)按质量体积比1:3-20溶解到无水乙醇中，然后在将得到的含有甲强龙和地塞米松的无水乙醇溶液在搅拌条件下按体积比1：2-20与上述得到的慢速和快速药物释放速度的丝素蛋白溶液分别充分混合均匀，然后得到的溶液置于-20℃冰箱中5-24小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:10-500加入到去离子水中透析3-8h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面的甲强龙和地塞米松，之后除去有机溶剂，得到所述的负载甲强龙和地塞米松释放速度可控的丝素蛋白纳米微球。上述提到的有机溶剂为乙醇、甲醇和丙醇等；所述的滴加过程在常温下进行；所述除去有机溶剂的方法为挥发。所述的负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球在治疗中枢神经系统损伤、急性脊髓损伤应用或作为可控甲强龙和地塞米松缓释时间的缓释制剂应用。即作为甲强龙和地塞米松的缓释制剂以控制在特定剂量下甲强龙和地塞米松作用损伤部位情况的作用时间的应用。所述的负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球在联合给药时可以有效扩大比单一用药时的疗效和减少单一用药时的毒副作用。有益效果：1、本发明负载甲强龙和地塞米松的纳米微球以释放速度可控的丝素蛋白作为载体，可以将甲强龙在损伤部位有效的发挥应有的疗效，药物释放速度不同的丝素蛋白可以根据损伤后给药时间情况有效的控制甲强龙和地塞米松的作用时间。2、本发明负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球具有较好的药物缓释功能，根据分子量不同控制不同的药物释放速度有效的控制特定剂量下甲强龙和地塞米松的半衰期，对神经系统损伤后的情况采用释放速度可控的载体以发挥最大疗效至关重要，有效缩短了病人的治疗周期和痛苦。3、本发明负载的甲强龙和地塞米松联合给药得到丝素蛋白纳米微球具有良好的协同作用效果，且明显改善甲强龙或地塞米松单独给药的毒副作用和过敏性反应。4、本发明负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球具有良好的生物相容性，加工成形性，且材料便宜易得，成本较低。5、本发明制备方法制得的纳米微球粒径均一，稳定，分散性好。具体实施方式下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但是这些实施例并不限制本发明的保护范围。实施例1：丝素蛋白的制备，脱丝胶：称取包有丝胶的天然蚕丝纤维40-50g到不锈钢的容器中，然后称取碳酸氢钠固体10.18g充分溶解到2L的三蒸水(约0.5％碳酸氢钠碱性溶液)中，将其倒入装有天然蚕丝不锈钢的容器中，使蚕丝完全浸没于溶液中，漂浮裸露出来的蚕丝用玻璃棒适当按压。然后将容器转移至电磁炉加热，直至煮沸，从煮沸时开始计算，蒸煮期间不断用玻璃棒搅拌，使其受热均匀，大约半个小时后，取出，并用三蒸水洗涤两次，此时丝素蛋白裸露，白度增加。为了将丝胶充分脱尽，重复上述步骤进行第二次脱丝胶处理，同样称取碳酸氢钠固体10.18g使其充分溶解在2L的三蒸水中，然后转移至电磁炉上加热煮沸，大约半小时后结束，取出，用三蒸水洗涤两次。然后进行第三次处理同样称取碳酸氢钠固体10.18g使其充分溶解在2L的三蒸水中，然后转移至电磁炉上加热煮沸，大约半小时后结束，取出，用三蒸水洗涤数次，PH试纸检测呈中性，脱水，置于通风橱晾干，待用。实施例2：具有较慢药物释放速度的丝素蛋白的制备称取40.45g溴化锂倒入50ml离心管中,加三蒸水定容到50ml,充分溶解后,在搅拌条件下加入到100ml烧烧杯中,按质量体积比1:20加入2.5g实施例1制得的丝素蛋白(分多次加入),完全加入后在表1水解搅拌,室温下静止放凉，然后,进行透析(截留分子量:12000一14000)3天。表1组(溴化锂)水解温度(℃)水解时间(min)12518027020350180450250570250对组1-1处理的丝素蛋白使用凝胶过滤色谱(GFC)进行分子量的测定，采用TSKgel(G4000SWXL,流动相为0.1mol/LNaSO4V:0.05％NaN3in0.1mol/LPhosphateV＝50：50，流速为0.8ml/min，检测波长为280nm)进行色谱实验，并与标准蛋白进行对比，测试结果显示，使用溴化锂处理的丝素蛋白分子量为100800Da，说明用溴化锂进行水解丝素蛋白仅得到药物释放速度较慢丝素蛋白，并无法通过延长时间得到的更快药物释放速度较快的丝素蛋白。以组1-1的丝素蛋白为例,经过浓缩得到浓度为1.5％的丝素蛋白溶液留作待用。负载甲强龙的丝素蛋白纳米微球的制备在搅拌条件下，将5mg甲强龙溶解到20ml的无水乙醇中，然后将得到含有甲强龙的乙醇溶液滴加到40ml实施例2制备的丝素蛋白溶液(1.5％)充分混合，然后得到的混合溶液置于-20℃冰箱中8小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:400加入到去离子水中透析4h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面甲强龙。将上述混和溶液放入通风橱进一步挥发去除乙醇，得到负载甲强龙的丝素蛋白纳米微球，本实施例制备的丝素蛋白纳米微球的粒径范围为70-125nm。负载地塞米松的丝素蛋白纳米微球的制备在搅拌条件下，将3mg地塞米松溶解到12.5ml的无水乙醇中，然后将得到含有地塞米松的乙醇溶液滴加到25ml实施例2制备的丝素蛋白溶液(1.5％)充分混合，然后得到的混合溶液置于-20℃冰箱中8小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:400加入到去离子水中透析4h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面地塞米松。将上述混和溶液放入通风橱进一步挥发去除乙醇，得到负载甲强龙的丝素蛋白纳米微球，本实施例制备的丝素蛋白纳米微球的粒径范围为70-125nm。负载相对较多甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球的制备在搅拌条件下，将5mg甲强龙与3mg地塞米松溶解到30ml的无水乙醇中，然后将得到含有甲强龙和地塞米松的乙醇溶液滴加到60ml实施例2制备的丝素蛋白溶液(1.5％)充分混合，然后得到的混合溶液置于-20℃冰箱中8小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:400加入到去离子水中透析4h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面甲强龙和地塞米松。将上述混和溶液放入通风橱进一步挥发去除乙醇，得到负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球，本实施例制备的丝素蛋白纳米微球的粒径范围为70-125nm。负载相对较多甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球的制备在搅拌条件下，将2.5mg甲强龙与1.5mg地塞米松溶解到30ml的无水乙醇中，然后将得到含有甲强龙和地塞米松的乙醇溶液滴加到60ml实施例2制备的丝素蛋白溶液(1.5％)充分混合，然后得到的混合溶液置于-20℃冰箱中8小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:400加入到去离子水中透析4h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面甲强龙和地塞米松。将上述混和溶液放入通风橱进一步挥发去除乙醇，得到负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球，本实施例制备的丝素蛋白纳米微球的粒径范围为70-125nm。实施例3具有较快药物释放速度的丝素蛋白的制备称取无水氯化钙18.5g加入到50ml的离心管中，然后再加入三蒸水24ml使其充分溶解，再加无水乙醇19.39ml使其混溶得到三元溶液(氯化钙：乙醇：水摩尔比＝1:2:8)。再搅拌条件下加入到100ml玻璃烧杯中，覆盖上保鲜膜防止乙醇挥发。按质量体积比约1:5加入10g实施例1制得的丝素蛋白(分多次加入)，待完全加入后搅拌30min，搅拌结束后用0.6M盐酸或者氢氧化钠继续在表2条件下水解搅拌,盐酸或氢氧化钠的加入量与含有丝素的三元溶液体积比为1:5，结束后室温下静止放凉，然后,进行透析(截留分子量:100一500)3天。表2组(盐酸或氢氧化钠)水解温度(℃)水解时间(min)17060270180375120475180580180对组2-1处理的丝素蛋白使用凝胶过滤色谱(GFC)进行分子量的测定，采用TSKgel(G4000SWXL,流动相为0.1mol/LNaSO4V:0.05％NaN3in0.1mol/LPhosphateV＝50：50，流速为0.8ml/min，检测波长为280nm)进行色谱实验，并与标准蛋白进行对比，测试结果显示，使用盐酸或氢氧化钠处理的丝素蛋白分子量为25100Da，说明盐酸或氢氧化钠水解处理的丝素蛋白仅得到药物释放速度较快的丝素蛋白，并无法通过水解时间和盐酸浓度得到更快药物释放的丝素蛋白。以组2-1的丝素蛋白为例,经过浓缩得到浓度为8％的丝素蛋白溶液留作待用。负载甲强龙的丝素蛋白纳米微球的制备在搅拌条件下，将5mg甲强龙溶解到20ml的无水乙醇中，然后将得到含有甲强龙的乙醇溶液滴加到40ml实施例3制备的丝素蛋白溶液(1.5％)充分混合，然后得到的混合溶液置于-20℃冰箱中8小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:400加入到去离子水中透析4h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面甲强龙。将上述混和溶液放入通风橱进一步挥发去除乙醇，得到负载甲强龙的丝素蛋白纳米微球，本实施例制备的丝素蛋白纳米微球的粒径范围为35-80nm。负载地塞米松的丝素蛋白纳米微球的制备在搅拌条件下，将3mg地塞米松溶解到12.5ml的无水乙醇中，然后将得到含有地塞米松的乙醇溶液滴加到25ml实施例3制备的丝素蛋白溶液(1.5％)充分混合，然后得到的混合溶液置于-20℃冰箱中8小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:400加入到去离子水中透析4h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面地塞米松。将上述混和溶液放入通风橱进一步挥发去除乙醇，得到负载甲强龙的丝素蛋白纳米微球，本实施例制备的丝素蛋白纳米微球的粒径范围为35-80nm。负载相对较多甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球的制备在搅拌条件下，将5mg甲强龙与3mg地塞米松溶解到30ml的无水乙醇中，然后将得到含有甲强龙和地塞米松的乙醇溶液滴加到60ml实施例3制备的丝素蛋白溶液(1.5％)充分混合，然后得到的混合溶液置于-20℃冰箱中8小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:400加入到去离子水中透析4h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面甲强龙和地塞米松。将上述混和溶液放入通风橱进一步挥发去除乙醇，得到负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球，本实施例制备的丝素蛋白纳米微球的粒径范围为35-80nm。负载相对较少甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球的制备在搅拌条件下，将2.5mg甲强龙与1.5mg地塞米松溶解到30ml的无水乙醇中，然后将得到含有甲强龙和地塞米松的乙醇溶液滴加到60ml实施例3制备的丝素蛋白溶液(1.5％)充分混合，然后得到的混合溶液置于-20℃冰箱中8小时，室温下解冻形成乳状乳液。然后将得到的乳液按体积比1:400加入到去离子水中透析4h以除去没有封装或吸附在丝素蛋白表面甲强龙和地塞米松。将上述混和溶液放入通风橱进一步挥发去除乙醇，得到负载甲强龙和地塞米松的丝素蛋白纳米微球，本实施例制备的丝素蛋白纳米微球的粒径范围为35-80nm。实施例4在37℃条件下，将实施例2制备的8mg负载甲强龙和地塞米松释放速度较慢的丝素蛋白纳米微球和实施例3制备的8mg负载甲强龙或地塞米松释放速度较快的丝素蛋白纳米微球分别放入15mlPBS(摩尔浓度：0.01M,PH＝7.4)透析，每隔2h进行取样，采用高效液相色谱(HPLC,C-18.流动相为乙腈V:水V＝34：66，流速：1ml/h,检测波长：243nm)测定甲强龙和地塞米松的浓度，实验结果表明，负载甲强龙和地塞米松释放速度较慢的丝素蛋白纳米微球的缓释时间12h时释放药物量45％，负载甲强龙和地塞米松释放速度较慢的丝素蛋白纳米微球的缓释时间12h时释放药物量80％。这表明不同处理方法得到的丝素蛋白纳米微球负载同样剂量的甲强龙和地塞米松其药物缓释周期是不一样的。这种释放速度可控的丝素蛋白纳米微球有望用于对药物作用时间严格控制的神经损伤部位，并会取得良好的修复效果。当前第1页1 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