神秘果叶提取物在治疗阿尔兹海默病的药物制备中的应用的制作方法

本发明涉及神秘果叶提取物的应用，特别涉及神秘果叶提取物在制备用于治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。

背景技术：

阿尔茨海默病(alzheimerdisease，ad)，又叫老年性痴呆，是一种中枢神经系统变性病，起病隐袭，病程呈慢性进行性，是老年期痴呆最常见的一种类型。主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状，严重影响社交、职业与生活功能。ad的病因及发病机制尚未阐明，特征性病理改变为β淀粉蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结，以及神经元丢失伴胶质细胞增生等。

由于ad的病因及发病机制未明，目前尚无特效疗法，以对症治疗为主。使用的药物主要有胆碱、卵磷脂、毒扁豆碱和胆碱能激动剂等，但这些药物效果相差迥异，还会产生恶心、呕吐、转氨酶升高、灶性肝细胞坏死及抑郁等副作用。

神秘果(synsepalumdulcificumdaniell)为山榄科神秘果属的一种奇特水果。该水果原产于西非热带地区，现已在我国热带、亚热带地区广泛种植，一年四季均可结果。其果肉含有丰富奇特的糖蛋白、维生素、有机酸、黄酮、花青素等营养物质。现阶段对于神秘果的研究表明，其具有调节血压、血脂，减轻痛风、尿酸、头痛等功效。神秘果叶具有治疗高血压、糖尿病以及动脉硬化等功效，并且能够改善胃酸过多，增强肝胆功能和提高免疫力。

技术实现要素：

本发明基于神秘果叶提取物中包含的抗氧化物质的活性，提供了神秘果叶提取物在预防或治疗阿尔兹海默病的药物制备中的应用。根据本发明的神秘果叶提取物对于阿尔兹海默病具有良好的预防或治疗作用，同时由于其中包含的天然抗氧化活性成分，避免了恶心、呕吐、转氨酶升高、灶性肝细胞坏死及抑郁等副作用，具有优异的生物活性和安全性。

根据本发明的一个方面，提供一种神秘果叶提取物在制备用于治疗阿尔兹海默病的药物中的应用，所述神秘果叶提取物通过以下步骤提取：将神秘果叶干燥、粉碎，得到神秘果叶粉；向所述神秘果叶粉中加入第一醇溶液，进行超声提取，并离心收集上清液，剩余残渣再以同样的方式提取至少两次，合并上清液为醇提取液；所述醇提取液经减压蒸馏、冷冻干燥得到神秘果叶粗提物；将所述神秘果叶粗提物溶解于水中，并经大孔树脂处理，然后用第二醇溶液洗脱剂进行洗脱，收集醇洗脱液；所述醇洗脱液经减压蒸馏和冷冻干燥得到神秘果叶提取物干粉。

优选地，所述第一醇溶液为50～90％(v/v)甲醇水溶液。

根据一个具体实施方式，所述神秘果叶粉与所述第一醇溶液的比例为每克神秘果叶粉使用15～45ml第一醇溶液。

根据另一个具体实施方式，所述超声提取的时间为0.5～1h，超声波水浴的温度为40～60℃。

所述第二醇溶液为10～90％(v/v)的乙醇水溶液。

根据又一个具体实施方式，所述大孔树脂为ab-8。

优选地，在用所述醇类洗脱剂进行洗脱之前先用水洗脱，洗脱液弃之不用。

根据本发明的神秘果叶提取物对dpph(1,1-二苯基-2-苦苯肼)自由基具有较强的清除能力(ic50为83～120μg/ml)，清除能力至少是山奈酚的2倍；具有较高的铁离子还原/抗氧化能力(frap值为6～8mm/gtrolox)，至少是山奈酚的2.5倍。上述神秘果叶提取物能够明显抑制线虫株系cl4176的瘫痪，可以用于抗ad的药物及保健品的制备。

附图说明

图1示出了325nm波长下检测的根据本发明的神秘果叶提取物中抗氧化物质的uplc色谱图。

图2示出了根据本发明的神秘果叶提取物在不同浓度下对线虫株系cl4176的瘫痪抑制作用。

具体实施方式

本发明提供一种神秘果叶提取物在制备用于治疗阿尔兹海默病的药物中的应用，所述神秘果叶提取物通过以下步骤提取：将神秘果叶干燥、粉碎，得到神秘果叶粉；向所述神秘果叶粉中加入第一醇溶液，进行超声提取，并离心收集上清液，剩余残渣再以同样的方式提取至少两次，合并上清液为醇提取液；所述醇提取液经减压蒸馏、冷冻干燥得到神秘果叶粗提物；将所述神秘果叶粗提物溶解于水中，并经大孔树脂处理，然后用第二醇溶液洗脱剂进行洗脱，收集醇洗脱液；所述醇洗脱液经减压蒸馏和冷冻干燥得到神秘果叶提取物干粉。

具体地，神秘果叶通过常规方法干燥和粉碎，例如自然晾干。粉碎后的神秘果叶优选通过80目筛，以得到神秘果叶粉。

优选地，所述第一醇溶液为50～90％(v/v)，优选60～80％(v/v)的甲醇水溶液。

所述超声提取频率为40000赫兹，时间可为0.5～1h，超声波水浴的温度为40～60℃。

在超声提取过程中，若提取溶液第一醇溶液浓度过高(即大于90％(v/v))，则无法提取到极性较大的活性物质；若提取溶液第一醇溶液浓度过低(即小于50％(v/v))，则会有太多的糖类被提取到提取物中，影响下一步干燥效果。

根据一个具体实施方式，所述神秘果叶粉与所述第一醇溶液的比例为每克神秘果叶粉使用15～45ml，优选30ml第一醇溶液。

根据另一个具体实施方式，用作洗脱剂的第二醇溶液为10～90％(v/v)，优选30～70％(v/v)，更优选60％(v/v)的乙醇水溶液。

根据又一个具体实施方式，上述大孔树脂可为ab-8。优选地，在大孔树脂分离步骤中，神秘果叶粗提物溶液的流速为1～3ml/min，优选1.5ml/min。

根据一个实施方式，在用第二醇溶液洗脱剂进行洗脱之前先用水洗脱，丢弃洗脱液，用于除去提取物中的糖类物质。

上述冷冻干燥步骤利用常规方法和条件进行，例如冷冻干燥可在零下35±1℃的温度下进行。

在上述提取方法中，使用甲醇水溶液作为提取剂，因其极性大、分子量较低而更易进入细胞壁内提取活性物质。同时，采用超声波辅助提取，使得提取时间短，操作简单，所获得的产品中活性物质含量高。

根据本发明的神秘果叶提取物具有抗氧化性，其中活性物质主要为多酚和黄酮类化合物。具体地，根据上述方法得到的神秘果叶提取物对dpph自由基具有较强的清除能力，例如ic50为83～120μg/ml，优选100～120μg/ml，清除能力是山奈酚的2倍以上；具有较高的铁离子还原/抗氧化能力(frap)，例如frap值为6～8mm/gtrolox，优选6.5mm/gtrolox，是山奈酚的2.5倍以上；由此能够明显抑制线虫株系cl4176的瘫痪，可以用于抗氧化剂和抗ad的药物或保健品的制备。

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例

实施例1：神秘果叶提取物的制备

将神秘果叶自然晾干，粉碎，并过80目筛，得到神秘果叶粉；

向神秘果叶粉中以每克神秘果叶粉30ml的量加入50％(v/v)的甲醇水溶液，在40℃的水浴温度下，超声提取0.5h，离心收集上清液，剩余残渣以相同的条件重复提取两次，合并这些上清液得到醇提取液；

将上述醇提取液经40℃减压蒸馏，在零下35℃下冷冻干燥24h得到神秘果叶粗提物；

将上述神秘果叶粗提物溶解于水中至没有颗粒，并经大孔树脂ab-8处理，先水洗脱除杂，再用60％(v/v)乙醇洗脱，收集洗脱液；

上述醇洗脱液经40℃减压蒸馏和零下35℃冷冻干燥得到神秘果叶提取物干粉。

实施例2至3

根据与实施例1相同的步骤制备神秘果叶提取物干粉，区别在于实施例2和3中分别采用70％(v/v)甲醇水溶液和90％(v/v)甲醇水溶液作为提取剂。

对比例1

根据与实施例1相同的步骤制备神秘果叶提取物干粉，区别在于对比例1中采用水作为提取剂。

神秘果叶提取物中总酚、总黄酮含量的测定

总酚标准曲线的绘制。用100mg/l的没食子酸储备液配置不同浓度的标准样品。准确移取不同体积没食子酸标准液，加入1ml福林酚试剂(预先用水稀释到原始浓度十分之一)，用水补足总体积为2ml。室温静止5分钟后加入1.0ml碳酸钠溶液(7.5％，w/v)，于黑暗中反应30min后在765nm测定吸光度。其中标准样品中没食子酸的最终浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和4.0mg/l。样品中的总酚含量用达到相同量的没食子酸的百分比(％)来表示。

总黄酮标准曲线的绘制。精确称取干燥至恒重的芦丁对照品0.0100g，用60％(v/v)乙醇溶液配制成0.2mg/ml的对照品溶液。分别准确吸取0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0ml芦丁标准溶液于25ml容量瓶中，以60％(v/v)乙醇溶液稀释至15ml，加入5％(w/v)亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，静置5min。然后加入10％(w/v)硝酸铝溶液0.3ml，摇匀，静置5min。再加入1mol/l氢氧化钠溶液2ml，混匀，用60％(v/v)乙醇溶液稀释至刻度，室温静置15min。以第一管为空白对照，于波长510nm处测定吸光度值。样品中的总黄酮含量用达到相同量的芦丁的百分比(％)来表示。

不同浓度甲醇水溶液提取的神秘果叶提取物中总酚和总黄酮的含量及提取率见表1。

表1

^a：对醇提取液进行的测定

^b：相对于原始神秘果叶质量

^c：对神秘果叶提取物干粉进行的测定

由以上结果可知，根据实施例1至3的醇提取液的提取率和总酚、总黄酮含量，显著高于对比例1中用水提取的提取液的含量。当甲醇水溶液浓度为70体积％时，醇提取液的提取率和总酚、总黄酮含量最高。

dpph自由基清除能力和铁离子还原/抗氧化能力测定(frap)的测定

用甲醇将根据实施例1至3和对比例1的神秘果叶提取物干粉溶解成1mg/ml的样品进行各项抗氧化能力测定。

以1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(dpph，美国sigma公司)为标准物，用dpph自由基清除能力的方法来测定上述神秘果叶提取物的抗氧化能力。

取2ml的dpph溶液(浓度为0.5mm)，分别与0.5ml的各神秘果叶提取物甲醇溶液(浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1mg/ml)混合，在37℃恒温下避光反应1h。在波长525nm处测定吸光度值。由此计算神秘果叶提取物的ic50数值。

frap的测定。frap利用试剂盒进行测定。取稀释10倍后的上述神秘果叶提取物甲醇溶液样品10μl加入到96微孔板中，然后加入200μl新鲜配制的2,4,6-三吡啶基三嗪(tptz)工作液混匀，37℃水浴反应30min后在595nm测定吸光度，以不同浓度trolox(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mm)为标准物做标准曲线。神秘果叶提取物样品的抗氧化活性(frap值)以每克干质量达到同样吸光度所需的trolox毫摩尔数(mmtrolox/g)表示。自由基清除能力和frap的结果见表2。

表2

以上结果数据表明根据实施例1至3的神秘果叶提取物具有很强的抗氧化能力。

神秘果叶提取物的成分分析

采用超高效液相-串联质谱法(uplc-ms)测定了上述神秘果叶提取物中的成分组成。其中，超高效液相色谱(uplc)条件为：

watersacquitybehc18色谱柱(50×2.1mm，1.7μm)，柱温35℃；

watersh-class分离器单元；

watersacquity二极管阵列检测器；

watersmasslynx4.1质谱管理软件

流动相为乙腈(a)和0.1％甲酸水溶液(b)，采用梯度洗脱，洗脱程序为：开始浓度为8％a；0-8min升至20％；8-13min升至30％a；13-15min升至30％a；15-18升至50％a；18-20升至90％a；20-21降至8％a；21-25min为8％a。流速为0.4ml/min。

全波长扫描，扫描范围为200～600nm。

质谱(ms-ms)条件为：

质谱采用电喷雾电离源[esi(-)]，全扫描范围为100～1200da，毛细管电压为2.5kv，锥孔电压为50v。离子源温度为150℃；脱溶剂气体(氮气)温度为500℃，流量为1000l/h；锥孔气体(氮气)流量为50l/h，碰撞气为高纯氩气。

根据标样和质谱数据确定目标产物中的组成。

以70体积％甲醇提取的产物经过乙腈和甲酸梯度分离后的uplc见图1，波长为325nm，结合质谱数据分析神秘果叶提取物中的主要抗氧化物质为：

1、没食子酸2、绿原酸3、5-o-肉桂酰奎尼酸4、4-o-肉桂酰奎尼酸5、没食子酸甲酯6、苯甲酸甲酯7、杨梅素-3-半乳糖苷8、芦丁9、杨梅酮10、金丝桃苷11、异槲皮素12、山奈酚3-o-葡萄糖苷13、槲皮素-3-鼠李糖苷14、根皮苷15、槲皮素糖苷

由以上结果可知神秘果叶中的主要抗氧化物质为多酚和黄酮类物质。

提取物对线虫cl4176株系的瘫痪抑制实验

平板制备：用双蒸水将70％甲醇提取物配制成0.0002mg/ml、0.002mg/ml、0.02mg/ml，将咖啡因(caffeine)用水配成浓度为6.27mm(阳性对照)，分别吸取540ul涂布在线虫生长体培养基(ngm)的表面(6cm培养皿)。室温避光放置半小时后，收入16℃放置过夜后，涂布50ul(1mg/m)大肠杆菌op50(65℃水浴处理0.5h)。制备好的平板在16℃放置24h用于实验。

实验进程：将cl4176株系在对照平板及药物平板上同步化后，15～16℃培养48h后，转入25℃诱导，23h开始统计。

使用log-rank(mantel-cox)test进行瘫痪程度差异比较。*代表<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。

不同浓度的提取物对线虫cl4176株系瘫痪的抑制作用见图2。

由图可知，浓度为0.02mg/ml神秘果叶子提取物能够抑制线虫株系cl4176的瘫痪，但浓度降低到0.002mg/ml和0.0002mg/ml时并没有抑制瘫痪表型的效果。进一步实验表明，上述神秘果叶提取物在0.02～0.05mg/ml的范围内都能够抑制线虫株系cl4176的瘫痪。

多酚类物质能够抑制淀粉蛋白的有毒聚合体，从而可以有效的缓解ad的发生，这些功效都与多酚类物质的抗氧化性能相关。另外，黄酮类物质减缓了人类成神经细胞瘤细胞中淀粉样前蛋白的成熟，进一步能够显著地降低ad鼠模型中不溶aβ的比例，从而也有助于减少ad的发生。本发明提供的神秘果叶提取物中酚类和黄酮类物质含量很高，并且具有良好的抗氧化活性。该提取物对于线虫株系cl4176瘫痪的抑制表明神秘果叶提取物可用于制备有效治疗ad的药物。