氨苯砜在制备保护脑微血管的药物中的应用的制作方法

本发明属于药物技术领域，具体涉及氨苯砜在制备保护脑微血管的药物中的应用。

背景技术：

血脑屏障（bloodbrainbarrier,bbb）系统主要由内皮细胞，周细胞，星形胶质细胞共同组成，能够通过接收神经活动从而调控脑血流（cerebralbloodflow,csf），同时也是调控分子在血液与脑组织之间交流的重要选择透过性屏障。bbb由一层紧密相连的脑血管内皮细胞所组成，这层内皮细胞主要调控脑组织与血液之间的物质交流。通常的大分子物质无法从血液穿过内皮细胞进入脑实质中，但少于九个氢键并且分子量小于400da的脂溶性分子是个例外，因此目前很多临床上用于中枢神经系统给药的药物分子都基于这一点设计而成。

血管内皮细胞间紧密连接（tightjunctions,tjs）和粘附连接（adherensjunctions,ajs）是调控脑血管通透性的主要分子基础。位于脑血管内皮细胞间隙之间的tjs和ajs是细胞间相互连接以及发挥信息传递功能的结构基础。tjs限制离子和大分子物质穿过血管内皮，因此是调控血脑屏障通透性及内皮细胞间信息交流的重要组成部分。tj蛋白主要是一些跨膜的蛋白质，包括：occludin，claudin家族（特别是claudin-5和claudin-12）以及连接粘附分子家族（如junctionaladhesionmolecule,jam-4）。而zonulaoccludings-1（zo-1）将tj蛋白与肌动蛋白骨架相互连接。

氨苯砜目前被用于治疗麻风病和部分皮肤病。发明人前期研究已经发现服用氨苯砜的老年麻风病人脑内海马ca3区的神经元数量则显著多于未服用氨苯砜的病人（de-huachuietal.amjpathol1994）。最近有研究报道，氨苯砜能够减少脑缺血大鼠脑内的梗塞面积，另外发明人前期研究也发现氨苯砜能够缓解由炎症反应引起的血脑屏障损伤。提示氨苯砜对脑微血管内皮细胞具有较好的保护作用。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明的目的是提供氨苯砜在制备保护脑微血管的药物中的应用。

技术方案：氨苯砜在制备保护脑微血管药物的应用。

进一步地，所述药物包含药学上有效量的氨苯砜和药学上可接受的载体。

进一步地，所述药物为口服制剂。

进一步地，氨苯砜通过提高微血管内皮细胞间紧密连接的水平而作为保护脑微血管的药物组合物。

进一步地，氨苯砜的浓度为20nm。

本发明中，可以采用本领域常规的方法，可将氨苯砜制备成适于胃肠道给药的药物制剂。制剂形式可以为片剂、胶囊剂或者缓释剂等。且所述药学上可接收的载体为本领域常规辅料。药物组合物的药剂量根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式不同，可以进行适当的变化，但应当保证药物组合物在动物体内能够达到有效的血药浓度。

有益效果：本发明通过实验证明了氨苯砜保护体外脑微血管内皮细胞表达tightjunction达最佳效果时的浓度为20nm；氨苯砜在有效作用浓度对内皮细胞没有毒性，在经氧化低密度脂蛋白（oxidationlow-densitylipoprotein,oxldl）处理的hbmecs细胞中能够提高tightjunction的水平，从而保护hbmecs保持内皮形态；在高脂饮食饲养的小鼠中，氨苯砜能够通过提高脑微血管内皮细胞tightjunction的水平，保护脑微血管完整性。

附图说明

图1a为浓度梯度的oxldl处理hbmecs细胞对tjs水平的蛋白免疫印迹分析图；

图1b为不同处理时间的oxldl处理hbmecs细胞对tjs水平的蛋白免疫印迹分析图；

图1c为浓度梯度的氨苯砜处理hbmecs细胞对tjs水平的蛋白免疫印迹分析图；

图1d为不同处理时间的氨苯砜处理hbmecs细胞对tjs水平的蛋白免疫印迹分析图；

图2a为氨苯砜对高脂饮食小鼠脑微血管完整性的激光共聚焦影像结果；

图2b为氨苯砜对高脂饮食小鼠脑微血管完整性的激光共聚焦影像结果中荧光强度的统计；

图3a为最适浓度下氨苯砜对高脂饮食小鼠脑微血管内皮中tjs水平影响的蛋白电泳图；

图3b为最适浓度下氨苯砜对高脂饮食小鼠脑微血管内皮中tjs水平影响的蛋白电泳结果的统计。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

1.1hbmecs细胞的培养

hbmecs是人脑微血管原代内皮细胞，培养条件使用ecm内皮细胞培养基，含5%的胎牛血清，1%内皮细胞生长因子和1%青链霉素，细胞培养置于95%湿度和5%co2的37℃培养箱内。

1.2不同浓度的氧化低密度脂蛋白（oxldl）处理hbmecs细胞对tjs水平的影响

oxldl储存浓度为1mg/ml，使用时稀释于培养基，用系列稀释的oxldl（50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）处理hbmecs细胞，培养24小时，并提取细胞蛋白，进行蛋白免疫印迹分析。

如图1a所示，50-200μg/ml内，随着oxldl浓度增加，tjs水平逐渐减少，而400μg/ml时则变化不明显，但与空白组相比依然有明显降低。表明oxldl对tjs水平的影响具有浓度依赖性。

1.3oxldl不同处理时间对hbmecs细胞tjs水平的影响

oxldl储存液浓度为1mg/ml，使用时稀释于培养基，用200μg/mloxldl处理hbmecs细胞，培养6，12，24和36小时，提取细胞蛋白，进行蛋白免疫印迹分析。

如图1b所示，随着oxldl处理细胞孵育时间的延长，tjs的水平逐渐减少，表明oxldl对tjs水平的影响具有时间依赖性。

1.4不同浓度的氨苯砜对oxldl处理hbmecs细胞tjs水平的影响

将氨苯砜溶解于二甲基亚砜（dmso，sigma）中，储存液浓度为200mmol/l，使用时稀释于培养基，dmso终浓度不超过0.1%，用系列稀释的氨苯砜（0.2nm、2nm、20nm、200nm）与200μg/mloxldl处理的hbmecs细胞，培养24小时，并提取细胞蛋白，进行蛋白免疫印迹分析。

如图1c所示，0.2-20nm内，随着氨苯砜浓度增加，tjs水平逐渐增加，而200nm时则有所下降，但与空白组相比依然有明显提高。表明氨苯砜对tjs水平的影响具有浓度依赖性。

1.5氨苯砜不同处理时间对oxldl处理hbmecs细胞tjs水平的影响

氨苯砜溶解于二甲基亚砜（dmso，sigma）中，储存液浓度为200mmol/l，使用时稀释于培养基，dmso终浓度不超过0.1%，用20nm的氨苯砜分别与200μg/mloxldl处理的hbmecs细胞，培养6，12，24和36小时，提取细胞蛋白，进行蛋白免疫印迹分析。

如图1d所示，随着氨苯砜与细胞孵育时间的延长，tjs的水平逐渐增加，表明氨苯砜对tjs水平的影响具有时间依赖性。

1.6氨苯砜对高脂饮食小鼠的脑微血管完整性的影响

选取6-8周龄的c57bl/6j小鼠，饲养于北京大学医学部实验动物部，自由觅食和饮水，12/12h日照节律。将小鼠作如下分组：空白组（control）；高脂饮食组（hfd）；给药组：hfd+5mg/kgdds组（5mg/kgdds）；hfd+10mg/kgdds组（10mg/kgdds）；hfd+15mg/kgdds组（15mg/kgdds）；每组n=6只。高脂饮食饲料连续喂养8周；将不同浓度的dds溶解在1%peg300/水中，通过饮水给予小鼠连续8周；给药结束后用双光子激光共聚焦检测小鼠的脑微血管完整性。在实验结束后，将小鼠灌流后，取脑，提取脑微血管内皮细胞蛋白，进行蛋白免疫印迹实验。

实验结果：双光子实验显示，连续8周给予5mg/kg和10mg/kgdds的高脂饮食小鼠，其脑微血管完整性与hfd组相比得到显著地保护。上述结果说明5mg/kgdds和10mg/kgdds给药能够保护小鼠的脑微血管。脑微血管双光子结果如图2a所示；实验统计结果如图2b所示。与对照组相比***p＜0.0001。

1.7氨苯砜对高脂饮食小鼠的脑微血管内皮内tjs水平的影响

选取6-8周龄的c57bl/6j小鼠，饲养于北京大学医学部实验动物部，自由觅食和饮水，12/12h日照节律。将小鼠作如下分组：空白组（control）；高脂饮食组（hfd）；给药组：hfd+5mg/kgdds组（5mg/kgdds）；hfd+10mg/kgdds组（10mg/kgdds）；hfd+15mg/kgdds组（15mg/kgdds）；每组n=6只。高脂饮食饲料连续喂养8周；将不同浓度的dds溶解在1%peg300/水中，通过饮水给予小鼠连续8周；给药结束后，将小鼠灌流后，取脑，提取脑微血管内皮细胞蛋白，进行蛋白免疫印迹实验。

实验结果：免疫印迹实验显示，连续8周给予dds的高脂饮食小鼠，其脑微血管内皮中tjs水平与hfd组相比得到显著地提高。上述结果说明5mg/kgdds给药能够提高小鼠的脑微血管内皮中tjs水平。蛋白免疫印迹结果如图3a所示；实验统计结果如图3b所示。与对照组相比*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.0001。