谷氨酰胺酶抑制剂CB‑839在制备治疗雌激素敏感型子宫内膜癌的药物中的应用的制作方法

本发明属医药技术领域，涉及谷氨酰胺酶抑制剂CB-839的用途，具体涉及CB-839在制备治疗雌激素敏感型子宫内膜癌的药物中的应用。

背景技术：

子宫内膜癌(以下简称内膜癌)好发于围绝经期和绝经后女性，是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年升高的趋势，中国癌症统计数据显示，2015年中国新发内膜癌6.34万例，死亡2.18万例，居女性生殖系统恶性肿瘤第二位，在北京、上海两地发病率居首位，严重危害女性身体健康。

目前已知雌激素是内膜癌的主要致病因素。雌激素作为一种可溶性介质，作用于内膜癌始动、促炎和进展过程中各个阶段，参与受体和非受体依赖性子宫内膜癌的发病。但在临床诊治过程中，靶向雌激素的方案并未取得预期疗效，晚期内膜癌5年生存率仅为5％～25％。研究发现，雌激素对蛋白质与核酸等物质代谢有重要影响，在性器官中的作用尤为明显，提示雌激素可能通过代谢途径促进内膜癌的进程。然而至今为止内膜癌中雌激素的代谢调节作用机制仍不明确，因此雌激素代谢调控致内膜癌进展的研究正面临着重大挑战与机遇，基于这些机制研究的雌激素代谢调控早期预警和干预策略有待建立。

谷氨酰胺是一种重要的代谢物质，对细胞的生长具有重要影响。然而，谷氨酰胺对内膜癌细胞自噬以及进程的影响及其相关机制远不清楚。

自噬是真核细胞中普遍存在的自我吞噬现象，研究发现，乳腺癌、肝癌、卵巢癌等癌细胞自噬水平低于正常细胞。自噬在肿瘤发展的不同阶段，有不同的作用机制。大多数学者认为，自噬活性的增高可以抑制肿瘤的发生发展。目前认为，自噬抑制肿瘤的作用主要有以下两方面：一方面，自噬发生使细胞进入自噬性死亡。另一方面，多种癌基因和抑癌基因通过参与自噬途径而发挥抗肿瘤作用，如Beclin1、PTEN、Bcl-2等。因此，自噬调控的异常与肿瘤的发生发展有着直接的联系。

CB-839是谷氨酰胺酶高效选择性、具口服活力抑制剂。分子量571.57，分子式C₂₆H₂₄F₃N₇O₃S，CAS号1439399-58-2，结构式如下：

目前关于CB-839对于内膜癌的治疗作用还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种谷氨酰胺酶抑制剂CB-839的用途。

本发明第一方面提供了谷氨酰胺酶抑制剂CB-839在制备治疗雌激素敏感型子宫内膜癌的药物中的应用。

本发明另一方面提供了谷氨酰胺酶抑制剂CB-839在制备制剂中的应用，所述的试剂用于：

a)体外抑制子宫内膜癌细胞中谷氨酰胺的代谢，

b)体外促进子宫内膜癌细胞自噬，

c)体外抑制子宫内膜癌细胞增殖，

d)体外抑制雌激素引起的促子宫内膜癌细胞增殖作用，和/或

e)体外逆转雌激素引起的抑制子宫内膜癌细胞自噬作用。

作为本发明的一种具体实施方式，所述的子宫内膜癌细胞是Ishikawa或KLE细胞。

本发明通过体外研究谷氨酰胺酶抑制剂CB-839在雌激素敏感型子宫内膜癌中抑制雌激素引起的促进谷氨酰胺代谢的抑制凋亡作用，进一步通过体内试验评估CB-839治疗因雌激素刺激所致的子宫内膜癌异常增殖的价值，结果显示：1)雌激素促进激素敏感型子宫内膜癌中谷氨酰胺酶的表达，增强谷氨酰胺的代谢；2)高水平谷氨酰胺代谢抑制子宫内膜癌细胞自噬，促进子宫内膜癌细胞增殖；3)雌激素能降低子宫内膜癌自噬水平，促进子宫内膜癌增殖，但是应用谷氨酰胺酶抑制剂CB-839后，子宫内膜癌的生长明显受限，自噬水平增加。提示该谷氨酰胺酶抑制剂可进一步用于制备治疗雌激素敏感型子宫内膜癌的药物。

基于此，本发明提供了使用谷氨酰胺酶抑制剂CB-839治疗雌激素敏感型子宫内膜癌治疗方法，可通过口服谷氨酰胺酶抑制剂CB-839抑制因雌激素引起的子宫内膜癌自噬水平降低，进而改善雌激素异常引起的子宫内膜癌进展。

本发明为内膜癌的临床治疗提供了新方法和新思路。

附图说明

图1-6是雌激素促进雌激素敏感型子宫内膜癌细胞系增殖并且抑制自噬。

其中，ER-α：雌激素受体α，

Ishikawa：雌激素敏感型子宫内膜癌细胞系，

KLE：雌激素非敏感型子宫内膜癌细胞系，

Actin：肌动蛋白作为内参蛋白，

OD value：吸光度值，

Fulvestrant：氟维司群，一种雌激素受体抑制剂，

LC3B-I、LC3B-II：自噬微管相关蛋白轻链β3-I、自噬微管相关蛋白轻链β3-II，

Beclin-1：酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，

p62：一种与自噬程度负相关的核孔蛋白，

*P<0.05，**P<0.01；ns：无明显差异。

图7-10是雌激素促进雌激素敏感型子宫内膜癌细胞系谷氨酰胺代谢。

其中，Glutaminase：谷氨酰胺酶，

Glutamine；谷氨酰胺，

**P<0.01。

图11-16是谷氨酰胺代谢抑制子宫内膜癌自噬，促进子宫内膜癌增殖。

其中，CB-839：是一种谷氨酰胺酶选择性抑制剂，

Glutamine：200mM谷氨酰胺处理组，

Glutamine+CB-839：谷氨酰胺和CB-839同时处理组，

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns：无显著差异。

图17-20是CB-839对裸鼠子宫内膜癌皮下移植瘤的抑制作用。

其中，Isotype：阴性对照组，

Control：未使用药物的裸鼠肿瘤，

CB-839：口服CB-839的裸鼠肿瘤，

Ki-67是一种与细胞增殖特异相关的核抗原，

肿瘤体积计算公式：体积＝(长*宽²)/2，

**P<0.01，***P<0.001。

图21-25是CB-839抑制雌激素的促谷氨酰胺代谢作用。

其中，Estrogen：雌激素处理组，

Estrogen+CB839：雌激素和CB-839同时处理组，

*P<0.05，**P<0.01；ns：无显著差异。

图26-30是裸鼠口服CB-839抑制雌激素对雌激素敏感型子宫内膜癌的促生长作用。

其中，Control：既不应用雌激素，又不口服CB-839的成瘤裸鼠，

Estrogen：应用雌激素的成瘤裸鼠，

Estrogen+CB-839：同时应用雌激素和CB-839的成瘤裸鼠，

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns：无显著差异。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1：分析雌激素对子宫内膜癌细胞系Ishikawa和KLE自噬与增殖的作用以及对谷氨酰胺代谢的影响

1)雌激素促进激素敏感型子宫内膜癌细胞系Ishikawa增殖，抑制Ishikawa自噬，而对不敏感型KLE无明显作用

首先采用蛋白质印记法检测，发现子宫内膜癌细胞系Ishikawa表达雌激素受体α，但是KLE不表达(Ishikawa和KLE细胞系均购自上海南方模式动物中心，ER-α和Actin抗体购自Abcam公司)(如图1所示)；随后雌激素(10nM)和/或氟维司群(250nM)处理细胞系，Cell Counting Kit-8试剂盒分别检测不同时间点(0、24、48、72小时)细胞的增殖情况(雌激素和氟维司群均购自MedChem Express公司，Cell Counting Kit-8试剂盒购自Yeasen公司)发现雌激素能促进Ishikawa细胞增殖，但是对KLE无明显影响(如图2所示)。蛋白质印记法检测雌激素(10nM)和/或氟维司群(250nM)处理内膜癌细胞系72小时后自噬相关蛋白LC3B-I/II、Beclin-1、p62的表达(LC3B-I/II、Beclin-1、p62均购自CST公司)，同时收集细胞进行自噬电镜扫描，发现，雌激素能抑制Ishikawa细胞自噬，但是对KLE无明显影响，说明雌激素抑制激素敏感型子宫内膜癌细胞自噬(如图3-6)。

2)雌激素促进激素敏感型子宫内膜癌细胞系Ishikawa谷氨酰胺代谢，而对不敏感型KLE无明显作用

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time qRT-PCR)检测雌激素处理Ishikawa后谷氨酰胺酶转录水平明显增加，而KLE无明显改变(real time qRT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，引物由生工公司合成)(如图7)。同时应用Elisa法检测细胞培养上清液中谷氨酰胺的浓度，发现雌激素促进Ishikawa的谷氨酰胺代谢，而对KLE无明显影响(谷氨酰胺Elisa试剂盒购自R&D公司)(如图8)。同时，应用免疫印迹法和激光共聚焦法检测细胞中谷氨酰胺酶的表达，发现雌激素刺激促进Ishikawa细胞内谷氨酰胺酶的表达，而对KLE无明显影响(谷氨酰胺酶抗体购自Abcam公司)(如图9-10)。说明雌激素能促进激素敏感型子宫内膜癌细胞系Ishikawa谷氨酰胺酶的表达，进而促进谷氨酰胺代谢，而对不敏感型KLE无明显作用。

实施例2：体内及体外实验证明谷氨酰胺酶抑制剂CB-839有效抑制子宫内膜癌细胞谷氨酰胺代谢

1)CB-839抑制子宫内膜癌细胞系Ishikawa和KLE中谷氨酰胺的代谢

浓度梯度(0、0.02、0.2、2、20、200mM)谷氨酰胺处理Ishikawa和KLE，Cell Counting Kit-8实验说明谷氨酰胺促进内膜癌细胞增殖(如图11)。谷氨酰胺酶抑制剂CB-839(1μmol/L)能抑制Ishikawa和KLE中谷氨酰胺的代谢(如图12)。免疫印迹法和自噬电镜扫描检测内膜癌细胞的自噬水平，发现CB-839能促进子宫内膜癌细胞自噬(如图13-16)。说明谷氨酰胺酶抑制剂CB-839促进子宫内膜癌细胞自噬，并且抑制子宫内膜癌细胞增殖。

2)口服CB-839能有效抑制裸鼠子宫内膜癌皮下移植瘤生长

流式细胞分析技术检测口服CB-839(口服剂量为200mg/kg，每天两次，载体为含有25％羟丙基-B-环糊精的浓度为10mmol/L柠檬酸钠溶液，pH＝2，羟丙基-B-环糊精与柠檬酸钠均购自Sigma)裸鼠皮下子宫内膜癌肿瘤细胞增殖相关蛋白ki67的表达水平以及平均荧光密度较仅仅服用药物载体组的小鼠明显降低(ki67抗体购自Biolegend)，说明口服CB-839能抑制子宫内膜癌细胞的增殖(如图17)。裸鼠皮下种植肿瘤的生长曲线、瘤体表面观、肿瘤的重量监测说明口服CB-839能有效抑制子宫内膜癌皮下种植肿瘤的生长(如图18-20)。

实施例3：体内及体外实验证明谷氨酰胺酶抑制剂CB-839有效抑制雌激素的促谷氨酰胺代谢作用

1)CB-839有效抑制雌激素对子宫内膜癌细胞系谷氨酰胺代谢的促进作用

Cell Counting Kit-8法检测未处理组、雌激素刺激组、和雌激素与CB-839直接刺激组细胞增殖状况，发现CB-839能抑制雌激素的促增殖作用(如图21)。免疫印迹法和自噬电镜扫描法检测三组细胞自噬水平差异，发现CB-839能有效逆转雌激素引起的抑制自噬作用(如图22-25)。说明CB-839能有效抑制雌激素引起的促子宫内膜癌细胞增殖作用，并且逆转其抑制自噬作用。

2)口服CB-839有效逆转雌激素对子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤生长的促进作用

流式细胞分析技术检测未处理组、应用雌激素组、口服CB-839组以及同时应用雌激素与CB-839组中裸鼠子宫内膜癌皮下移植瘤细胞ki67阳性细胞的比例(如图26-27)。肿瘤生长检测、皮下种植肿瘤外观以及肿瘤重量检测说明口服CB-839能有效逆转雌激素对子宫内膜癌裸鼠皮下移植瘤生长的促进作用(如图28-30)。

本发明经体外和体内试验结果证实，谷氨酰胺酶抑制剂CB-839能有效抑制雌激素对激素敏感型子宫内膜癌细胞的促进作用，抑制内膜癌细胞的增殖并促进其凋亡，利于限制内膜癌肿瘤的生长。口服CB-839可改善因雌激素所致的激素敏感型子宫内膜癌的异常生长。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。