一种纳米羟基磷灰石‑聚乙烯醇多孔支架的制备方法与流程

文档序号:11240374阅读:583来源:国知局

本发明涉及一种纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架的制备方法,属于医用纳米材料制备技术领域。



背景技术:

组织工程支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体内的材料,它是工程化组织的最基本构架。细胞支架不仅为特定细胞提供结构支撑作用,而且还起到模版作用,引导组织再生和控制组织结构。因此,在组织工程中,除了考虑材料的化学性质、表面性能外,还应考虑三维多孔细胞支架的结构,如孔隙形态、大小、连通性、孔隙率等,以利于细胞的黏附、渗透和营养物质的传送及代谢产物的交换。

聚乙烯醇(pva)由于具有韧性好、无毒、生物相容性好以及易于加工等特点,在骨、软骨、人造皮肤、人工角膜、义眼台等方面有广泛的应用,为了增加其生物活性,往往在人工角膜、骨等生物材料中添加羟基磷灰石。要使组织长入材料内部,需要对其制孔,常用的方法是溶剂浇铸/粒子沥滤法,首先用有机溶剂溶解聚乙烯醇,加入致孔剂氯化钠、酒石酸钠和柠檬酸钠等水溶性无机盐或糖粒子并混合均匀,成型后,用水去除致孔剂而得到pva多孔结构。但此种方法存在孔隙间的相互连通程度不高,并且连通大小和形态不规则、不可控制,而且残余的有机溶剂还可能影响细胞的生长。



技术实现要素:

本发明主要解决的技术问题是:针对传统聚乙烯醇多孔支架材料在制备过程中采用水溶性无机盐或糖粒子为致孔剂,所得多孔支架孔隙率低,且孔隙间相互连通程度不高的问题,提供了一种纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架的制备方法。

为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:

(1)将聚乙烯醇、谷朊粉和水搅拌溶胀,再加热搅拌溶解,得预制混合液,再将预制混合液、纳米羟基磷灰石、表面活性剂op-10和无水乙醇高速搅拌混合后,注入模具,经冷冻解冻循环后,脱模,得预制支架材料;

(2)将变质后的牛奶涂布于自制固体培养基表面,进行微生物培养,经去离子水淋洗得菌丝悬浮液,再将预制支架材料浸没于菌丝悬浮液中,经超声处理后恒温静置,再经清洗、灭菌和干燥,即得纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。

本发明的有益效果是:

(1)本发明利用含高蛋白的谷朊粉良好的延展性,提高支架材料在乳化发泡过程中的弹性和韧性,避免乳化过程中微泡破裂,经固化交联后,采用变质牛奶培养微生物,针对性消耗谷朊粉中蛋白质,使谷朊粉分解去除,从而使支架内部孔隙打通,使多孔支架的孔隙率和连通率得到有效提高,应用于人体皮肤及骨组织支架材料时,有利于营养物质运输和细胞代谢废物及时排出,相比于传统支架材料,更有利于细胞组织的生长,患者在治疗过程中,炎症反应逐渐减轻,伤口愈合速度加快,伤口愈合时间较使用传统支架材料而言,缩短10~15%;

(2)本发明利用冷冻解冻循环,在冷冻过程中,内部水分形成细小冰晶,体积膨胀,使孔隙扩大打通,解冻后,水分进一步渗透,经冷冻解冻循环,使孔隙进一步打通,且解冻过程为自然解冻,反应调节温和,使支架材料内部孔隙得到有效保护。

具体实施方式

本发明所需要的原料有:聚乙烯醇、谷朊粉、去离子水、纳米羟基磷灰石、表面活性剂op-10、无水乙醇、牛奶、琼脂、蔗糖、葡萄糖、氯化镁、磷酸二氢钾、、牛肉膏、蛋白胨。

依次称取20~35g聚乙烯醇,2.6~2.8g谷朊粉,倒入盛有200~300ml温度为20~25℃去离子水的烧杯中,用玻璃棒搅拌混合10~15min后,静置2~4h,在静置过程中,使聚乙烯醇和谷朊粉充分吸水溶胀,再将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器,于温度为85~90℃,转速为300~500r/min条件下,恒温搅拌2~4h,通过加热使聚乙烯醇和谷朊粉溶解,得预制混合液;依次取100~150ml预制混合液,6~8g纳米羟基磷灰石,3~5g表面活性剂op-10,6~8ml无水乙醇,倒入带搅拌器的三口烧瓶中,以800~1000r/min转速高速搅拌混合20~30min,在高速搅拌下乳化发泡,利用谷朊粉提高发泡成膜的弹性和韧性,避免乳液中微泡破裂,再将三口烧瓶中物料迅速转入模具中,并将模具移入冰箱中,于温度为-18~-20℃条件下冷冻6~8h,再将冷冻后的模具取出,于室温条件下自然解冻4~6h,如此冷冻、解冻循环3~5次,利用冷冻解冻循环过程中,聚乙烯醇交联固化,得益于纳米羟基磷灰石和谷朊粉配合形成的支架结构,脱模,得预制支架材料;量取60~80ml牛奶,倒入烧杯中,再将烧杯置于避光通风处,静置直至牛奶变质,再取4~6ml变质牛奶,并均匀涂布于自制固体培养基表面,再将固体培养基转入恒温培养箱中,于温度为35~37℃条件下,恒温培养3~5天,并用300~500ml去离子水淋洗培养基表面,利用变质牛奶培养微生物,得菌丝悬浮液;所述的自制固体培养基是由30~50g琼脂,4~5g蔗糖,2~4g葡萄糖,0.1~0.3g氯化镁,0.6~0.8g磷酸二氢钾,4~6g牛肉膏,3~5g蛋白胨与400~500ml去离子水混合而成;将预制支架材料移入烧杯中,再向烧杯中加入所得菌丝悬浮液,直至将烧杯中预制支架材料完全淹没,并将烧杯移入超声振荡仪,以40~42khz频率超声处理8~10min,利用超声分散作用,使菌丝悬浮液充分渗透进入支架材料内部,再将烧杯移入恒温培养箱中,于温度为35~37℃条件下恒温静置13~15h,利用变质牛奶培养的微生物对谷朊粉蛋白质的消耗分解而使谷朊粉溶解去除,使支架材料内部孔隙打通,从而提高产品的孔隙率和连通率,且整个溶解去除过程反应条件温和,形成的孔隙结构均匀,再将烧杯中预制支架材料取出,用去离子水冲洗3~5次后,紫外灭菌处理30~45min,再将灭菌后的预制支架材料转入真空冷冻干燥箱中,干燥4~6h,出料,即得纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。

实例1

依次称取35g聚乙烯醇,2.8g谷朊粉,倒入盛有300ml温度为25℃去离子水的烧杯中,用玻璃棒搅拌混合15min后,静置4h,再将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器,于温度为90℃,转速为500r/min条件下,恒温搅拌4h,得预制混合液;依次取150ml预制混合液,8g纳米羟基磷灰石,5g表面活性剂op-10,8ml无水乙醇,倒入带搅拌器的三口烧瓶中,以1000r/min转速高速搅拌混合30min,再将三口烧瓶中物料迅速转入模具中,并将模具移入冰箱中,于温度为-20℃条件下冷冻8h,再将冷冻后的模具取出,于室温条件下自然解冻6h,如此冷冻、解冻循环5次,脱模,得预制支架材料;量取80ml牛奶,倒入烧杯中,再将烧杯置于避光通风处,静置直至牛奶变质,再取6ml变质牛奶,并均匀涂布于自制固体培养基表面,再将固体培养基转入恒温培养箱中,于温度为37℃条件下,恒温培养5天,并用500ml去离子水淋洗培养基表面,得菌丝悬浮液;所述的自制固体培养基是由50g琼脂,5g蔗糖,4g葡萄糖,0.3g氯化镁,0.8g磷酸二氢钾,6g牛肉膏,5g蛋白胨与500ml去离子水混合而成;将预制支架材料移入烧杯中,再向烧杯中加入所得菌丝悬浮液,直至将烧杯中预制支架材料完全淹没,并将烧杯移入超声振荡仪,以42khz频率超声处理10min,再将烧杯移入恒温培养箱中,于温度为37℃条件下恒温静置15h,再将烧杯中预制支架材料取出,用去离子水冲洗5次后,紫外灭菌处理45min,再将灭菌后的预制支架材料转入真空冷冻干燥箱中,干燥6h,出料,即得纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。

实例2

依次称取20g聚乙烯醇,2.6g谷朊粉,倒入盛有200ml温度为20℃去离子水的烧杯中,用玻璃棒搅拌混合10min后,静置2h,再将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器,于温度为85℃,转速为300r/min条件下,恒温搅拌2h,得预制混合液;依次取100ml预制混合液,6g纳米羟基磷灰石,3g表面活性剂op-10,6ml无水乙醇,倒入带搅拌器的三口烧瓶中,以800r/min转速高速搅拌混合20min,再将三口烧瓶中物料迅速转入模具中,并将模具移入冰箱中,于温度为-18℃条件下冷冻6h,再将冷冻后的模具取出,于室温条件下自然解冻4h,如此冷冻、解冻循环3次,脱模,得预制支架材料;量取60ml牛奶,倒入烧杯中,再将烧杯置于避光通风处,静置直至牛奶变质,再取4ml变质牛奶,并均匀涂布于自制固体培养基表面,再将固体培养基转入恒温培养箱中,于温度为35℃条件下,恒温培养3天,并用300ml去离子水淋洗培养基表面,得菌丝悬浮液;所述的自制固体培养基是由30g琼脂,4g蔗糖,2g葡萄糖,0.1g氯化镁,0.6g磷酸二氢钾,4g牛肉膏,3g蛋白胨与400ml去离子水混合而成;将预制支架材料移入烧杯中,再向烧杯中加入所得菌丝悬浮液,直至将烧杯中预制支架材料完全淹没,并将烧杯移入超声振荡仪,以40khz频率超声处理8min,再将烧杯移入恒温培养箱中,于温度为35℃条件下恒温静置13h,再将烧杯中预制支架材料取出,用去离子水冲洗3次后,紫外灭菌处理30min,再将灭菌后的预制支架材料转入真空冷冻干燥箱中,干燥4h,出料,即得纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。

实例3

依次称取30g聚乙烯醇,2.7g谷朊粉,倒入盛有250ml温度为22℃去离子水的烧杯中,用玻璃棒搅拌混合12min后,静置3h,再将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器,于温度为87℃,转速为400r/min条件下,恒温搅拌3h,得预制混合液;依次取120ml预制混合液,7g纳米羟基磷灰石,4g表面活性剂op-10,7ml无水乙醇,倒入带搅拌器的三口烧瓶中,以900r/min转速高速搅拌混合25min,再将三口烧瓶中物料迅速转入模具中,并将模具移入冰箱中,于温度为-19℃条件下冷冻7h,再将冷冻后的模具取出,于室温条件下自然解冻5h,如此冷冻、解冻循环4次,脱模,得预制支架材料;量取70ml牛奶,倒入烧杯中,再将烧杯置于避光通风处,静置直至牛奶变质,再取5ml变质牛奶,并均匀涂布于自制固体培养基表面,再将固体培养基转入恒温培养箱中,于温度为36℃条件下,恒温培养4天,并用400ml去离子水淋洗培养基表面,得菌丝悬浮液;所述的自制固体培养基是由40g琼脂,4g蔗糖,3g葡萄糖,0.2g氯化镁,0.7g磷酸二氢钾,5g牛肉膏,4g蛋白胨与450ml去离子水混合而成;将预制支架材料移入烧杯中,再向烧杯中加入所得菌丝悬浮液,直至将烧杯中预制支架材料完全淹没,并将烧杯移入超声振荡仪,以41khz频率超声处理9min,再将烧杯移入恒温培养箱中,于温度为36℃条件下恒温静置14h,再将烧杯中预制支架材料取出,用去离子水冲洗4次后,紫外灭菌处理40min,再将灭菌后的预制支架材料转入真空冷冻干燥箱中,干燥5h,出料,即得纳米羟基磷灰石-聚乙烯醇多孔支架。

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