本发明涉及发中药微生物发酵制剂，具体来说是一种中药微生物发酵制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
脑血栓形成是脑梗死最常见的类型。是脑动脉主干或皮质支动脉粥样硬化导致血管增厚、管腔狭窄闭塞和血栓形成，引起脑局部血流减少或供血中断，脑组织缺血缺氧导致软化坏死出现局灶性神经系统症状；该疾病随年龄增长病死率明显上升，平均病死率为25％左右，常见死因是脑疝、多脏器衰竭、继发感染及心肺功能不全幸存者中病残率亦较高，大约20％的幸存者在1～2年内再次复发。
目前西医临床上防治脑血栓的方法主要是急性期内溶栓抗凝抗水肿治疗，所用药物副作用大且复发率高，中医临床使用的药物同样存在上述缺点。
技术实现要素：
本发明针对上述问题，提供一种副作用小、利用率高、不易复发的中药微生物发酵制剂及其制备方法和应用，可以有效预防和治疗高血压、脑动脉硬化、脑萎缩、脑血栓及其后遗症。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种中药微生物发酵制剂，将侧耳与中药原料药混合发酵所得，所述中药原料药按重量份数计：川穹10-100份，丹参10-100份，三七10-100份，天麻10-100份，白芷10-100份，银杏叶10-100份，葛根10-100份，蚕蛹10-100份，安息香10-100份，石菖蒲10-100份，僵蚕6-60份，郁金6-60份，羚羊角6-60份，人工牛黄6-60份，罗布麻6-60份，茯苓6-60份，桂枝6-60份，甘草6-60份，毛冬青6-60份，地龙6-60份，牛膝6-60份，姜黄4-40份，桃仁4-40份，蔓刑子4-40份，黄芪4-40份，路路通4-40份，人参4-40份，黄苓4-40份，独活4-40份，石斛4-40份，冰片2-20份，穿山甲2-20份，血谒2-20份，水蛭2-20份，珍珠2-20份，大黄2-20份，琥珀2-20份，麻黄2-20份，朱砂2-20份，远志2-20份，全蝎2-20份，麝香2-20份；侧耳占中药原料药质量的5％-10％；
所述侧耳为pleurotussp.，已于2014年4月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmccno.9060。
上述侧耳已在cn105412739a(申请号201410480058.0,申请日2014年09月18日)中公布。
本发明中药原料药的重量份数优选为：川穹50-100份，丹参50-100份，三七50-100份，天麻50-100份，白芷50-100份，银杏叶50-100份，葛根50-100份，蚕蛹50-100份，安息香50-100份，石菖蒲50-100份，僵蚕30-60份，郁金30-60份，羚羊角30-60份，人工牛黄30-60份，罗布麻30-60份，茯苓30-60份，桂枝30-60份，甘草30-60份，毛冬青30-60份，地龙30-60份，牛膝30-60份，姜黄20-40份，桃仁20-40份，蔓刑子20-40份，黄芪20-40份，路路通20-40份，人参20-40份，黄苓20-40份，独活20-40份，石斛20-40份，冰片10-20份，穿山甲10-20份，血谒10-20份，水蛭10-20份，珍珠10-20份，大黄10-20份，琥珀10-20份，麻黄10-20份，朱砂10-20份，远志10-20份，全蝎10-20份，麝香10-20份。
本发明中药原料药的重量数最优选为：川穹100g，丹参100g，三七100g，天麻100g，白芷100g，银杏叶100g，葛根100g，蚕蛹100g，安息香100g，石菖蒲100g，僵蚕60g，郁金60g，羚羊角60g，人工牛黄60g，罗布麻60g，茯苓60g，桂枝60g，甘草60g，毛冬青60g，地龙60g，牛膝60g，姜黄40g，桃仁40g，蔓刑子40g，黄芪40g，路路通40g，人参40g，黄苓40g，独活40g，石斛40g，冰片20g，穿山甲20g，血谒20g，水蛭20g，珍珠20g，大黄20g，琥珀20g，麻黄20g，朱砂20g，远志20g，全蝎20g，麝香20g。
所述中药微生物发酵制剂的制备方法为：
(1)按重量份数计，取川穹10-100份，丹参10-100份，三七10-100份，天麻10-100份，白芷10-100份，银杏叶10-100份，葛根10-100份，蚕蛹10-100份，安息香10-100份，石菖蒲10-100份，僵蚕6-60份，郁金6-60份，羚羊角6-60份，人工牛黄6-60份，罗布麻6-60份，茯苓6-60份，桂枝6-60份，甘草6-60份，毛冬青6-60份，地龙6-60份，牛膝6-60份，姜黄4-40份，桃仁4-40份，蔓刑子4-40份，黄芪4-40份，路路通4-40份，人参4-40份，黄苓4-40份，独活4-40份，石斛4-40份，冰片2-20份，穿山甲2-20份，血谒2-20份，水蛭2-20份，珍珠2-20份，大黄2-20份，琥珀2-20份，麻黄2-20份，朱砂2-20份，远志2-20份，全蝎2-20份，麝香2-20份的中药原料药混合，待用；
(2)取步骤(1)的中药原料混合物与侧耳混合发酵后,得到发酵物,将发酵物干燥、磨成细粉即得到中药微生物发酵制剂；
所述步骤(2)侧耳接种量为中药原料的5％-10％，并在温度为37-65℃、湿度为80％-98％条件下发酵1-7天，得到中药微生物发酵制剂。
所述侧耳(pleurotussp.)，已于2014年4月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmccno.9060。
所述中药微生物发酵制剂可制成散剂、片剂、丸剂、胶丸、胶囊剂、乳剂、糖浆或口服液。
所述中药微生物发酵制剂的应用：作为制备预防或治疗高血压、脑动脉硬化、脑萎缩、脑血栓、脑梗塞及其后遗症的药物中的应用。
本发明的发酵中药制剂是参照君臣佐使的中药组方原则所设计的现代中药。采用的原料药的功效如下所示：
川穹中的川穹嗪能扩张冠状动脉，增加冠状动脉血流量，改善心肌的血氧供应，并降低心肌的耗氧量；可扩张脑血管，降低血管阻力，显著增加脑及肢体血流量，改善微循环；能降低血小板表面活性，抑制血小板凝集，预防血栓的形成。
天麻可镇静、降压、增加冠状动脉血流量、促进脑血流、降低脑血管阻力，增加耐缺氧力和对心肌缺血有保护作用。天麻尤其对多种原因所致眩晕有良效，同时治疗老年人多发的高血压。
上述中药中川穹，丹参，三七，天麻，白芷，银杏叶，葛根，蚕蛹，安息香和石菖蒲作为主药，其他药物作为辅药；主要和辅药混合可更有效的提高各自成分的作用；同时可将辅药中各类成分按照6:4:2的质量比例混合，即辅药1：辅药2：辅药3为6:4:2，其中辅药1为僵蚕，郁金，羚羊角，人工牛黄，罗布麻，茯苓，桂枝，甘草，毛冬青，地龙和牛膝；辅药2为姜黄，桃仁，蔓刑子，黄芪，路路通，人参，黄苓，独活和石斛；辅药3为冰片，穿山甲，血谒，水蛭，珍珠，大黄，琥珀，麻黄，朱砂，远志，全蝎和麝香；将中药按照10:6:4:2的科学配伍比例，可有效将各中药成分间的相辅相成作用发挥极致，进而再将微生物在其中进行发酵，所得发酵物在经侧耳发酵后吸取中药同时发酵产生的有益物质能够更好的作为预防或治疗高血压、脑动脉硬化、脑萎缩、脑血栓、脑梗塞及其后遗症的药物；所述后遗症指偏瘫(半身不遂)、四肢麻木、语言障碍、头痛、头晕、眼花、耳鸣、失眠、反应迟钝、应激差、记忆力减退等。
本发明的有益效果在于：
1.本发明提供的中药微生物发酵制剂具有活血化瘀、温经通络、消肿降压、镇静安神、扶正固本中和调理的作用。
2.本发明为纯发酵微生物中药制剂，无毒无副作用，安全可靠；另外，本发明在继承中药炮制学发酵法基础上，结合现代生物工程的发酵技术，利用侧耳对中药材进行发酵处理，增加了药物的疗效和利用率。
3.多味药材科学配伍，温寒互补，能调养五脏，净化血液，充盈气血，清除血管垃圾并能有效预防复发。
具体实施方式
以下实施例用于进一步详细描述本发明，但不构成对本发明的限制，本发明的具体数据绝非仅限于这些实施例。
一、药物制备
实施例1
1.按重量份数计，取川穹50份，丹参50份，三七50份，天麻50份，白芷50份，银杏叶50份，葛根50份，蚕蛹50份，安息香50份，石菖蒲50份，僵蚕30份，郁金30份，羚羊角30份，人工牛黄30份，罗布麻30份，茯苓30份，桂枝30份，甘草30份，毛冬青30份，地龙30份，牛膝30份，姜黄20份，桃仁20份，蔓刑子20份，黄芪20份，路路通20份，人参20份，黄苓20份，独活20份，石斛20份，冰片10份，穿山甲10份，血谒10份，水蛭10份，珍珠10份，大黄10份，琥珀10份，麻黄10份，朱砂10份，远志10份，全蝎10份，麝香10份的中药原料混合粉碎，过100目筛，制成中药混合细粉,待用；
2.侧耳活化：采用接种环挑取侧耳菌丝接于pda固体培养基,在20℃、培养120小时，得到侧耳纯培养单菌落。
3.将上述活化的侧耳接种到步骤1中药原料中，并在温度为60℃、湿度为98％条件下发酵7天，得到发酵产物，活化的侧耳占中药原料质量的10％。
4.将上述发酵产物烘干、粉碎，过100目筛，所得细粉为中药微生物发酵制剂。
所述侧耳(pleurotussp.)，已于2014年4月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmccno.9060，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2
1.按重量份数计，取川穹100份，丹参100份，三七100份，天麻100份，白芷100份，银杏叶100份，葛根100份，蚕蛹100份，安息香100份，石菖蒲100份，僵蚕60份，郁金60份，羚羊角60份，人工牛黄60份，罗布麻60份，茯苓60份，桂枝60份，甘草60份，毛冬青60份，地龙60份，牛膝60份，姜黄40份，桃仁40份，蔓刑子40份，黄芪40份，路路通40份，人参40份，黄苓40份，独活40份，石斛40份，冰片20份，穿山甲20份，血谒20份，水蛭20份，珍珠20份，大黄20份，琥珀20份，麻黄20份，朱砂20份，远志20份，全蝎20份，麝香20份的中药原料混合粉碎，过110目筛，制成中药混合细粉,待用；
2.侧耳活化：采用接种环挑取侧耳菌丝接于pda固体培养基,在35℃、培养70小时，得到侧耳纯培养单菌落。
3.将上述活化的侧耳接种到步骤1中药原料中，并在温度为65℃、湿度为98％条件下发酵5天，得到发酵产物，活化的侧耳占中药原料质量的5％。
4.上述发酵产物烘干、粉碎，过100目筛，所得细粉为中药微生物发酵制剂。
所述侧耳(pleurotussp.)，已于2014年4月14日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为cgmccno.9060，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
二、临床前试验
1.急性毒性试验(小白鼠最大耐受量)：
观察本实验提供的中药微生物发酵制剂以小白鼠所能接受的最大剂量灌胃给药产生的毒性反应和死亡情况，测定小白鼠的最大耐受剂量，为临床用药的安全性体统动物急性毒性实验参考。
受试药物为上述实施例1制备的散剂，将其用蒸馏水配制成37.5％浓度(g/ml)供试验用。受试动物为昆明种封闭群小白鼠，体重18-22g，由中国医科大学实验动物中心提供，实验动物合格证号：辽实条合字1号与辽实质合字008。
(1)取小白鼠20只，雌雄各半，禁食不禁水17小时，称体重；
(2)按剂量1ml/20gbw的容积24小时内给药两次，间隔8小时，相当每次剂量为18.75g/kg，日累积剂量为37.5g/kg，给药后常规饲养，观察7天；
结果受试动物健康，未发现受试动物死亡或由药物中毒引起的异常变化。即表明本发明提供的制剂小白鼠灌胃给药的最大耐受量大于或等于37.5g/kg·日，大于或等于临床承认每日试用量0.2g/kg·日的187.5倍，参照中药急性毒性实验要求(中华人民共和国卫生部：新药审批办法《有关中药部分的修订和补充规定》，1992年9月1日起施行)，临床试用4g/次，日服2-3次是安全的。
2.小白鼠凝血时间的影响的测定：
受试药物与受试动物同上，受试药物用蒸馏水配置成20％浓度(g/ml)供试验用。
(1)取雄性小白鼠44只，4禁食不禁水17小时，称体重，随机分为4组，每组11只；
(2)按下表1剂量灌胃给药，每天一次，连续给药3天(不超过动物所能接受的最大容积1ml/20g)；
(3)末次给药后1小时，剪尾尖取血(徐叔云等，药理实验方法字，人民卫生出版社，1982第一版，835)，取血前禁食不禁水17小时，干棉球拭去第一滴血，再以清洁载玻片取一大滴血液，直径约5-10mm，立即开始计时，2min后，每隔30s，用洁净干燥的针头，自血滴边缘向中心轻轻挑动血滴一次，并观察有无纤维蛋白丝被挑起，直至有纤维蛋白丝被挑起为止，记录自血液流出至有纤维蛋白丝被挑起的时间为凝血时间。同时取血，常规方法做血小板计数，以各组平均凝血时间和平均血小板数分别以调和平均法和t检验法进行统计，比较各组的差异显著性。
表1中药微生物发酵制剂对小白鼠凝血时间及血小板数的影响检测结果
***p＜0.001(与对照组比较)
由上表可见，本发明所提供的中药微生物发酵制剂能非常明显地降低血小板数，并有一定延长凝血时间的倾向。目前实验室多以抗凝血作用和对血小板数目的影响作为防治脑血栓等疾病药物的辅助药效学指标，本实施例结果表明，本发明提供的中药微生物发酵制剂能非常明显的降低血小板数目，并有一定的抗凝血倾向(延长了凝血时间)。
三、临床试验
受试药物为实施例1制备的散剂，4g/次，每天2次，饭前温开水冲服，治疗期间患者均未使用其他治疗手段。受试患者为脑血栓(或多发性，伴随或不伴随脑梗塞或脑萎缩)患者200例，患者均不同程度伴随偏瘫(半身不遂)、四肢麻木、语言障碍、头痛、头晕、眼花、耳鸣、失眠、反应迟钝、应激差、记忆力减退、高血压等症状。
临床疗效：按下述临床疗效判断标准，200例患者中，153例患者治愈，其中150例患者2月内治愈，另外3例患者3-4月治愈；显效41例，有效2例，无效4例；治愈率76.5％，有效率98.0％，且用药过程中和回访中均未发现明显副作用、无复发。
血栓临床疗效判断标准：①临床治愈：临床症状消失，功能活动恢复正常；②显效：临床症状明显好转；③有效：临床症状部分好转；④无效：临床症状体征无改变。
四、典型病例
病例1
高某，女，农民，患脑血栓，半身不遂，伴随头痛头晕耳鸣，四肢麻木等症，服药四个月后头痛头晕、四肢麻木、半身不遂症状消失，血栓消失，一年未复发。
病例2
李某，女，58岁，小学教师，患有脑动脉硬化，脑血栓，伴随头痛、头晕眼花、记忆力减退、反应迟钝，用药三个月后血栓消失，头痛、头晕眼花症状消失，记忆力有所提高，大脑思维活动能力明显好转，能够正常工作。
病例3
孙某，男，60岁，工人，多发性脑血栓，脑萎缩，脑梗塞，伴随头痛、头晕、失眠，大脑应激差，半身不遂，口眼歪斜，用药2个月后复诊精神状态良好，自感精力充沛，睡眠得到改善，头痛头晕症状消失，血栓、萎缩消失，连续服药3个月后，大脑应激明显改善，病症基本消失，可以做到生活自理。