一种高强度曲率胶原膜的制备方法与流程

本发明涉及胶原膜，尤其涉及一种高强度曲率胶原膜的制备方法。

背景技术：

细胞外基质是生物体不可缺少的一部分，它的作用是把各种组织细胞聚集在一起，形成一个有机整体，同时也维持细胞成长的微环境。在人体中，细胞外基质就起到了维持皮肤、骨头、角膜、肌腱、牙齿、软骨等组织器官完整性的作用。而胶原作为细胞外基质最主要的结构蛋白，在生物体内具有十分重要的作用。胶原在细胞外基质的含量较高，这样才能负担比较大的机械强度。

胶原作为细胞外基质的一种，具有极好的生物相容性。胶原膜是一种很好的组织工程工具，它具有坚韧、透明、组织相容性好等特点，可以作为细胞片载体，对组织器官损伤进行修复。平面的胶原膜可以较好的修复一些损伤，不过某些具有特殊形状的器官，如角膜，平面的膜就不能与曲面的角膜很好地契合，使细胞移植效率大大降低。而与角膜曲率一致的胶原膜就能完美的与角膜相契合，与平面胶原膜相比，有曲率的胶原膜提高了角膜损伤修复的效率，而且不会影响角膜的屈光性。

平面胶原膜cv（collagenvitrigel），是一种具有高生物相容性的薄膜。cv在组织工程的应用十分广泛，尤其是角膜的组织修复中。角膜上皮、基质和内皮细胞都可以通过cv载体进行移植。cv可以较好的修复一些损伤，不过某些具有特殊形状的器官，如角膜，平面的膜就不能与曲面的角膜很好地契合，使细胞移植效率大大降低。而与角膜曲率一致的胶原膜就能完美的与角膜相契合，与平面胶原膜相比，有曲率的胶原膜提高了角膜损伤修复的效率，而且不会影响角膜的屈光性。传统cv在角膜上应用比较受限制，这是因为cv是平面的，而角膜是有一定曲率的球面。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高强度曲率胶原膜的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下方案实现：

一种高强度曲率胶原膜的制备方法，包括如下步骤：

s1：将胶原溶液制作成胶原凝胶；

s2：将步骤s1制作的胶原凝胶置于环形固定环中；

s3：将环形固定环连同其中的胶原凝胶置于下模具上，后利用上模具对胶原凝胶进行压缩；所述下模具包括具有曲率的凹陷部，所述上模具包括具有曲率的与凹陷部相适应的突出部，通过突出部和凹陷部的相配合实现对胶原凝胶的压缩；

s4：压缩完成后，取下下模具，对附着在上模具上的胶原膜进行吹干，即得高强度曲率胶原膜。

通过压力变化压缩胶原凝胶的方法，快速排出水分，达到快速成型的目的，节省了制作时间，两小时内即可完成制作。

进一步的，步骤s1中，于胶原溶液中加入dmem培养基进行震荡离心，对离心后的混合液进行冰浴，防止胶原凝胶凝结，后温育培养。具体的，步骤s1中，于2~10mg/ml的胶原溶液中加入10×dmem（10倍浓度）培养基1ml，震荡混匀后离心，对离心后的混合液进行冰浴，防止胶原凝胶凝结，后温育培养。

上述方案中，温育培养的条件为：37℃的温度下温育30~60min。

胶原凝胶加入了10×dmem培养基，可以使胶原蛋白分子在生理离子强度和ph值下，在37℃发生交联，形成结构稳定的整体，保证了胶原膜的强度。在压缩阶段，胶原凝胶便能快速成型，模具去除后，吹干水分即可。由于是先形成结构稳定的胶原凝胶，再进行压缩，通过均衡的压力施加，能使得制得的胶原膜结构强度更高。

进一步的，步骤s2中，所述环形固定环为尼龙环，其为弹性材质，无生物毒性，制备方便，成本较低。环形固定环能更好的控制胶原膜的成型，使其不会发生不必要的形变，比如折叠等。

进一步的，步骤s3中，压缩操作中压力10~50n，压缩时间20~40min。本发明中是通过将胶原凝胶圧缩成型制备出胶原膜，通过对压力和压缩时间的优化，使得压缩后的胶原膜不易复原，更好的控制胶原成型，而且在吹干蒸发水分的时候，胶原膜能贴紧模具，确保在蒸发水分的过程中不变形，缩短胶原膜成型的时间。

进一步的，所述上模具和下模具为3d打印特氟龙模具。通过3d打印技术制作的特氟龙模具，简化了制作流程，同时，可以打印出不同直径的特氟龙模具，这样便能制作不同曲率半径的胶原膜，节约了模具的成本。

细胞和细胞外基质在结构上的有序排列具有重要的意义，细胞的有序排列可以增强细胞之间对的相互作用，而细胞外基质的有序排列可以增强组织对的相关特性。通过将所述上模具的突出部和下模具的凹陷部设有有序排列的沟和脊，使得制备的胶原膜表面实现了有序排列，满足胶原膜作为载体以构建不同种类组织细胞。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：通过控制压力变化压缩胶原凝胶的方法，快速排出了水分，节省了制作时间，两小时内即可完成胶原膜的制作；圧缩过程中使用环形固定环进行固定，防止胶原膜出现弯曲、折叠；利用3d打印技术制作的特氟龙模具，简化了制作流程；利用3d打印技术可以制作不同直径的特氟龙模具，可以制作不同曲率半径的胶原膜，节约了模具的成本；制作的胶原膜具有有序排列条纹，满足不同种类的组织细胞。

附图说明

图1为压缩示意图。

具体实施方式

为了让本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步阐述。

实施例1

胶原凝胶的制作：将5mg/ml的胶原溶液9ml加入离心管中，再加入10×dmem培养基1ml，充分震荡混匀。2000rpm离心2min后，将离心管进行冰浴，防止胶原凝胶凝结。用移液器将液体小心吸出，置于6cm培养皿中，注意不要产生气泡。将皿置于37℃培养箱中，温育30min。

控制压力进行高浓度胶原凝胶压缩脱水和成型：将上一步的胶原凝胶从皿中取出，将胶原凝胶400置于尼龙环300中，再将胶原凝胶400平置于下模具200上（所述下模具200包括具有曲率的凹陷部210），然后把上模具100置于胶原凝胶400上（上模具100包括具有曲率的与凹陷部210相适应的突出部110），如图1所示，进行压缩，控制30n压力和30min压缩时间。压缩后，小心取下下模具200，确保胶原膜在上模具100上保持完整形状并紧贴在上模具100，然后用吹风机将胶原膜吹干，用镊子小心揭下胶原膜，即完成球形胶原膜的制作。经过机械性能测试，胶原膜的应变可以达到10~15%，应力可以达到15~20mpa。

技术特征：

技术总结
本发明涉及胶原膜，公开了一种高强度曲率胶原膜的制备方法，包括如下步骤：S1：将胶原溶液制作成胶原凝胶；S2：将步骤S1制作的胶原凝胶置于环形固定环中；S3：将环形固定环连同其中的胶原凝胶置于下模具上，后利用上模具对胶原凝胶进行压缩；所述下模具包括具有曲率的凹陷部，所述上模具包括具有曲率的与凹陷部相适应的突出部，通过突出部和凹陷部的相配合实现对胶原凝胶的压缩；S4：压缩完成后，取下下模具，对附着在上模具上的胶原膜进行吹干，即得高强度曲率胶原膜。本发明通过压缩胶原凝胶的方法，快速排出了水分，节省了制作时间，制备的曲率胶原膜强度高，能与曲面的角膜很好的契合，提高角膜损伤修复的效率，而且不会影响角膜的屈光性。

技术研发人员：陈建苏;崔泽凯;张军
受保护的技术使用者：暨南大学
技术研发日：2017.05.16
技术公布日：2017.09.29