一种抑制瘢痕增生的脂质体凝胶制剂及其制备和用途的制作方法

本发明涉及一种脂质体凝胶制剂，特别是一种咪喹莫特脂质体凝胶制剂，本发明还提供了所述制剂的制备方法及其用途，属于医学制药领域。

背景技术：

增生性瘢痕(hypertrophicscars,hs)是一种渐进性、病理性并难以逆转的皮肤疾病，常发生在深度创伤（如手术、烧烫伤）修复过程中，由大量微细血管生成、成纤维细胞增殖、胶原过度沉积导致真皮过度纤维化引起。在增生性瘢痕的治疗方案中，目前临床常用手术切除和药物治疗手段。手术治疗通常需要进行植皮和放射线或激光照射辅助治疗，且平均复发率达50%以上。治疗药物主要有类固醇类激素（局部注射或涂抹）、抗代谢药物（局部注射或口服)）和硅制剂（涂抹或喷雾），其中激素类药物显效快，但长期应用会出现局部副作用和全身反应，如皮肤萎缩、局部毛细血管扩张及色素沉着等；抗代谢药物一般为抗癌制剂，毒副作用突出，影响正常皮肤组织细胞的代谢和活性；硅制剂无副作用且病人顺从性好，但只对保持压力的部位（如四肢）有效。

咪喹莫特(imiquimod)是咪唑喹啉类药物，是人工合成小分子化合物中唯一的干扰素诱导免疫反应调节剂，具有抗病毒、抗肿瘤免疫调节作用。咪喹莫特作用独特，不具有直接抗病毒活性，也不会引起直接的、非特异性细胞溶解破坏作用，而是通过降低toll样受体tlr7和tlr8的竞争抑制作用，刺激多种免疫细胞产生一系列细胞素，诱导生成多种细胞因子，从而增强免疫调节作用。咪喹莫特临床主要用于治疗瘢痕疙瘩、尖锐湿疣、生殖器疣等。由于咪喹莫特溶解性能差，可供制成的剂型有限，目前市售的产品仅有霜剂、乳膏。

脂质体具有降低药物毒性、靶向定位、粒径小、与生物膜具有很好的相容性等特性，将药物制备成脂质体，增加了药物的稳定性及在器官中的滞留量，使药物疗效更显著。凝胶剂是一类含有溶解、混悬或乳液状态药物的半固体制剂，能在较长时间内与作用部位紧密豁附，具有较好的生物豁附性，并且制备简单、使用舒适。凝胶剂系指药物与能形成凝胶的辅料制成均一、混悬或乳状液型的稠厚液体或半固体制剂。其具有透气性佳、生物利用度高、稳定性好、不良反应少和使用方便等特点。脂质体凝胶将脂质体与凝胶基质混合，从而增加脂质体的稳定性，提高脂质体作为外用剂型的适用性，并且能够提供包裹药物的缓释和控释。脂质体作为常见纳米给药载体，脂质体皮肤给药具有独特的优势，可促进瘢痕异质化表皮的药物渗透能力，增强药物真皮滞留性能，水性给药环境满足伤口愈合对o2的需求。本研究将咪喹莫特制备成脂质体凝胶剂，一方面增加了咪喹莫特的溶解性能，另一方面增加咪喹莫特在真皮层中的滞留量，更好地发挥咪喹莫特抑制瘢痕的作用。目前尚无有关咪喹莫特脂质体凝胶制剂的文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种用于抑制瘢痕增生的脂质体凝胶制剂，其中所述脂质体凝胶制剂包括脂质体、凝胶材料和甘油，所述脂质体包封有咪喹莫特原料药，所述脂质体包括磷脂、胆固醇和维生素e。

在优选的实施方式中，所述磷脂是由选自蛋黄卵磷脂、脑磷脂､肌醇磷脂、丝氨酸磷脂、核苷酸磷脂、大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油、氢化大豆卵磷脂、十六烷基磷脂酰胆碱中的一种或多种磷脂组成的。优选地，所述磷脂是由蛋黄卵磷脂和氢化大豆卵磷脂中的一种或两者的混合物组成的。通过实验发现，各种磷脂材料的相变温度不同，制备温度需高于相变温度。实验优选使用蛋黄卵磷脂、氢化大豆卵磷脂中的一种或两者的混合物。

在优选的实施方式中，所述凝胶材料选自泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、卡波姆934和卡波姆980中的一种或多种。

在优选的实施方式中，所述脂质体微粒的粒径为100至1000nm。

在优选的实施方式中，胆固醇和磷脂重量份数比为1~3:2~6，咪喹莫特原料药和脂质体质量份数比（药脂比）为1:10~60，维生素e用量占总质量分数为2~7%。

本发明另一方面提供一种用于抑制增生性瘢痕的咪喹莫特脂质体凝胶制剂的制备方法。

本发明人先测定咪喹莫特的透皮吸收性能，并探讨咪喹莫特的油水分配系数与其透皮吸收速率间的关系，再以包封率、粒径和形态为考察指标，筛选出合理的处方工艺以及投料比，优选出包封率较高的咪喹莫特脂质体，最后将其制备成脂质体凝胶。

本发明人前期从注入法、薄膜分散法、ph梯度法、超声注入法-ph梯度法和薄膜分散法-ph梯度法等方法中进行筛选脂质体制备方法，发现其中薄膜分散法-ph梯度法最为适宜工业化生产，且制成的脂质体溶液粒径适宜（100～1000nm），包封率较高（>80％）。

本发明提供的方法包括以下步骤：

(a)精密称取一定量的咪喹莫特原料药、磷脂材料、胆固醇和维生素e，加入三氯甲烷，搅拌使各成分溶解，得到澄清透明溶液；

(b)将步骤(a)得到的澄清透明溶液置于容器中，减压旋转蒸发出溶剂，使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜，加入磷酸盐缓冲液，水化过夜，呈乳白色混悬液后，以碱性溶液调整ph值形成ph梯度差，孵育，冰浴下超声，得到咪喹莫特脂质体；

(c)将步骤（b）得到的脂质体过滤（先过0.8µm微孔滤膜滤，滤液再过0.45µm微孔滤膜，重复3次）得到脂质体溶液；

(d)将高分子凝胶材料加入所述脂质体溶液中，溶胀完全后，加入甘油，研磨均匀即得。

在优选的实施方式中，在上述方法步骤（b）中，温度50℃，转速30r·min^-1进行所述减压旋转蒸发，所述旋转的时间为15~45分钟，放置2小时使使胆固醇充分溶胀水合，所述磷酸盐缓冲液ph为6.0-7.0，所述碱性溶液为1mol/lnaoh，冰浴下超声的时间为15~45分钟，得到咪喹莫特脂质体。更优选地，在上述方法步骤（b）中，温度50℃，转速30r·min^-1进行所述减压旋转蒸发，所述旋转的时间为30分钟，放置2小时使使胆固醇充分溶胀水合，冰浴下超声的时间为30分钟，得到咪喹莫特脂质体。

在优选的实施方式中，在上述方法中，胆固醇和磷脂重量份数比为1~3:2~6，咪喹莫特原料药和脂质体质量份数比（药脂比）为1:10~60，维生素e用量占总质量分数为2~7%，孵育温度为30~70℃，孵育时间为20~100分钟，ph梯度差为1~5，凝胶材料和甘油质量比为1～50：1~5；优选地，胆固醇和磷脂质量比为1:3~5，药脂比为1:20~40，维生素e用量为4~6%，孵育温度为40~60℃，孵育时间为50~90分钟，ph梯度差为1~3，凝胶材料和甘油质量比为1～20：1~2；最优选地，胆固醇和磷脂质量比为1:5，药脂比为1:20，维生素e用量为6%，孵育温度为50℃，孵育时间为70分钟，ph梯度差为3，凝胶材料和甘油质量比3:1。

本发明再一方面提供本发明的脂质体凝胶制剂在制备抑制增生性瘢痕的药物中的用途。

本发明的脂质体凝胶制剂临床应用时直接贴敷在瘢痕增生部位，尤其是手术、烧烫伤后、没有或兼有炎症的深度创伤部位。由于该咪喹莫特透皮凝胶制剂应用人体生理相容性好的磷脂等材料包封药物，能有效地改善咪喹莫特的溶解度，增加咪喹莫特在真皮层中的滞留量，更好地发挥咪喹莫特抑制瘢痕的作用，与报道的其他抗瘢痕增生药物制剂或治疗方案相比，复发率低，降低毒副作用发生率，并可应用于身体任何瘢痕增生的部位。

此外，本发明提供的用于抑制增生性瘢痕的脂质体凝胶制剂的制备方法具有以下优点：1）制剂无有毒溶剂残留，不含可能引起皮肤刺激性或其他不良反应的辅料；2）与市场上现售的抗瘢痕增生药物相比，毒副作用小，病人顺应性好，透皮速率理想，有效调节皮肤免疫细胞因子；3）制备技术可工业化实施，制成的脂质体凝胶粘度适宜，稳定性好，符合药典要求。

附图说明

图1是本发明的一个实施方式中透皮速率常数和lgp拟合曲线示意图，p为咪喹莫特的油水分配系数，在ph4.5~7.4溶剂介质下，咪喹莫特的透皮性能和其油水分配系数密切相关，可以通过测定药物的油水分配系数预测药物的透皮性能。

图2是本发明的一个实施方式中脂质体凝胶制剂形成过程中脂质体微粒的透射电镜图，从图中可看出微粒大小均一，外缘呈圆形，形态规整。

图3是本发明的一个实施方式中脂质体凝胶制剂形成过程中脂质体粒径分布图，可见平均粒径为约335nm，符合正态分布。

图4是本发明的一个实施方式中脂质体凝胶制剂与常规咪喹莫特凝胶的经皮渗透动力学曲线，其中◇代表本发明的脂质体凝胶制剂；□代表常规凝胶，可见本发明的脂质体凝胶制剂的释药曲线明显优于常规的咪喹莫特凝胶。

具体实施方式

本发明提供的脂质体凝胶制剂包括脂质体、凝胶材料和甘油等，该脂质体包封有以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：咪喹莫特表观油水分配系数及其与透皮吸收速率常数的相关性研究

正辛醇置于具塞锥形瓶中，分别用ph4.5,5.0,5.8,6.5,7.4的缓冲盐饱和，33±0.5℃震摇24h，3500r·min^-1离心20min，分离正辛醇与缓冲液。精密称取咪喹莫特1.5mg，用不同ph的缓冲液预饱和过的正辛醇溶解，置于25ml的容量瓶中，定容，得系列浓度为60µg·ml^-1。取被正辛醇饱和过的缓冲溶液和咪喹莫特正辛醇溶液，按1:1比例体积，置于锥形瓶中，封口。将一部分锥形瓶内的溶液置于33±0.5℃恒温摇床内摇晃72h，另一部分锥形瓶涡旋40min，然后置于33±0.5℃恒温水浴中静置72h，取出，以3500r·min^-1离心20min，取缓冲盐层，定容。用高效液相测定测定缓冲盐相的浓度，计算油水分配系数，结果见表1。

p=(c-cw)/cw公式1

其中，p为咪喹莫特的表观油水分配系数；c为缓冲溶液饱和正辛醇中初始药物的浓度，cw为平衡后缓冲溶液中药物的浓度。

使用tp-6透皮扩散仪，将鼠皮放在两个半池中间，皮肤角质层朝上，夹紧，防止液体漏出，有效渗透面积为2.25cm²，接收池体积为15ml，温度为33±0.5℃，搅拌速度350r·min^-1，在1,2,4,6,8,12,24h取样，每次取样量1ml，同时补足1ml，以ph=6.5的缓冲盐为接受液。计算得qn，绘制qn-t方程，结果见表2。

公式2

其中，qn：第n小时单位面积累积透过药量；cn：第n小时取样的浓度；v：接收液体积；a：扩散池有效扩散面积。

表1咪喹莫特在正辛醇-不同ph缓冲溶液的油水分配系数的测定结果

p为咪喹莫特的表观油水分配系数

实验结果表明，咪喹莫特在ph5.8~7.3范围内，1﹤lgp﹤3，表明该药物亲脂性较好，水溶性较差，且摇床法和涡旋法所测得的lgp差异不明显，当溶剂介质ph在4.5~7.4之间时，lgp随ph值增大而增大。

表2透皮吸收速率常数的测定结果，斜率为透皮速率常数（j）

由表2可得，在ph5.8附近，咪喹莫特的透皮吸收速率常数最大。

咪喹莫特油水分配系数与透皮速率常数相关性研究，结果见图3，本发明人通过实验研究发现，在ph4.5~7.4溶剂介质下，咪喹莫特的透皮性能和其油水分配系数密切相关，可以通过测定药物的油水分配系数预测药物的透皮性能。

实施例2：咪喹莫特脂质体的处方筛选

以脂质体包封率为考察指标，选用l9(3⁴)因素水平正交设计进行脂质体处方优化，制备工艺为孵育温度40℃，孵育时间50min，ph梯度差为3，考察磷脂/胆固醇质量比（a）、药脂比(b)、以及ve用量（%）（c），采用薄膜分散-ph梯度法制备咪喹莫特脂质体，进行正交试验从而确定各组分的最佳投料比，处方因素水平表见表3。

表3：处方因素水平

精密称取一定量的咪喹莫特原料药、磷脂材料、胆固醇和维生素e，加入适量三氯甲烷，搅拌使各成分溶解，得到澄清透明溶液；将溶液置于500ml茄形瓶中，温度50℃，转速30r·min^-1，减压旋转蒸发出溶剂，使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜，加入ph为6.5的磷酸盐缓冲液旋转30分钟，水化过夜，呈乳白色混悬液后，以1mol/lnaoh溶液调整ph值形成ph梯度差，孵育，冰浴下超声，得到咪喹莫特脂质体，将得到的脂质体先过0.8µm微孔滤膜滤，滤液再过0.45µm微孔滤膜，重复3次，得到脂质体溶液。正交试验及结果见表4，方差分析结果见表5。

表4：正交试验及结果

表5：方差分析结果

由表4和表5实验结果得，咪喹莫特制备脂质体时，处方中a和b因素对其有显著性影响，可知b>a>c，最优组合为a3b1c3，即磷脂:胆固醇为5:1，药脂比为20:1，ve用量为6%。

实施例3：制备工艺的优选

在磷脂:胆固醇为5:1，药脂比为20:1，ve用量为6%的条件下，选用l9(3⁴)因素水平正交设计对处方工艺进行筛选，工艺因素主要有孵育温度(a)、孵育时间(b)、ph梯度差（c），因素水平表见表6。

表6：制备工艺的正交因素水平

表7：方差分析结果

表8：制备工艺的正交试验及结果

由表7和表8实验结果得，a与b因素对制备工艺具有显著性影响，按偏差平方和排序的a>b>c，最优组合为a2b2c3，即温度为50℃，孵育时间为70min，ph梯度差为3。

最佳工艺验证：按照优选处方进行了5次重复验证试验，制备了5批脂质体。精密称取胆固醇50mg、磷脂（s100）200mg，ve用量为6%，咪喹莫特10mg，加入20ml三氯甲烷，搅拌使各成分溶解，得到澄清透明溶液；将溶液置于500ml茄形瓶中，温度50℃，转速30r·min-1，减压旋转蒸发出溶剂，使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜，加入ph为6.5的磷酸盐缓冲液旋转30分钟，放置2小时使胆固醇充分溶胀水合，以1mol/lnaoh溶液调整ph值形成ph梯度差为3，50℃孵育70min，冰浴下超声30分钟，得到咪喹莫特脂质体，将得到的脂质体先过0.8µm微孔滤膜滤，滤液再过0.45µm微孔滤膜，重复3次，得到脂质体溶液。所得的咪喹莫特脂质体溶液呈乳白色半透明状，色泽均匀，略带乳光，流动性好。结果表明制得的5批脂质体粒径呈正态分布，平均粒径355nm，包封率(87.86±0.0153)%，其rsd为0.96%。

实施例4：咪喹莫特脂质体的渗漏率考察

在最优制备工艺下，将制备好的咪喹莫特脂质体分别放置于4℃冰箱、25℃室温保存，并分别于0d,30d,60d取样测定脂质体的含量，并按下式计算贮存过程中的渗漏率p。每组实验重复三次，求其平均值。其中，w1、w2分别为制备时的包封量和贮存一定时间后的包封量。结果见表9。

表9：咪喹莫特脂质体渗漏率

实施例5：咪喹莫特脂质体凝胶制剂的含量测定及稳定性初步考察

咪喹莫特脂质体凝胶剂及普通凝胶制剂的制备：称取卡波姆9400.3g、尼泊金乙酯0.002g，加入上述制备好的脂质体溶液中，溶胀完全后，加入甘油0.1g，研磨均匀，即得咪喹莫特脂质体凝胶制剂。称取咪喹莫特10mg，加入ph6.5缓冲溶液使溶解，并定容至10ml；加入卡波姆0.3g、尼泊金乙酯0.002g，溶胀完全后，加入甘油0.1g，研磨均匀，即得咪喹莫特普通凝胶剂。

咪喹莫特脂质体凝胶制剂的含量测定：精密称取咪喹莫特脂质体凝胶制剂及普通凝胶制剂各0.3g，置于25ml容量瓶中，加入10ml甲醇溶液，溶解后超声5min，蒸馏水定容至刻度。滤过，精密吸取滤液，于高效液相色谱仪上进行含量测定。测定结果表明，咪喹莫特脂质体凝胶制剂含量(3.03±0.25)mg·g^-1(n=3)，平均加样回收率96.54%(n=9,rsd值4.91%)。稳定性试验rsd值为3.85%，重现性试验rsd值为2.16%。

咪喹莫特脂质体凝胶制剂稳定性初步考察:

性状：本凝胶剂呈浅白色、均匀、细腻半透明状，无黏性块状物，常温保持胶状，不干涸或液化，涂展性能好。

粘度：本凝胶剂粘度适中。

ph值：取本品3g，加10ml蒸馏水稀释，搅拌均匀，ph值测定值在6.0～7.0之间。

离心试验：取3批样品各5g，4500r·min^-1离心30min，均匀，无凝聚、分层现象发生。

上述一项或多项验证试验结果表明咪喹莫特脂质体凝胶制剂制备工艺条件稳定可靠。

实施例6:咪喹莫特脂质体凝胶制剂体外经皮渗透动力学考察

离体皮肤制备:雄性昆明种小鼠(18～22g)断颈处死后，剥取腹部皮肤，刮净腹部鼠毛，剔除多余的脂肪、结缔组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干，将皮肤铺平，-20℃冰箱保存，一周内用完。

透皮吸收实验：将离体鼠皮恢复至室温，用生理盐水冲洗后，用滤纸吸干表面液体，置于franz扩散池(有效释药面积为1.766cm²，接收池体积为15ml)的供给室与接收室之间，角质层朝向供给室。扩散池的，接收室中加满含30%乙醇的ph值为6.5磷酸盐缓冲液，排尽气泡，使接收介质与皮肤紧密接触。接收介质温度为(33±0.5)℃，磁力搅拌速度350r·min^-1。各组在供给室中分别加入0.3g咪喹莫特脂质体凝胶制剂和咪喹莫特凝胶，分别于试验后1,2,4,6,8,10,12,24h从接收室取样管精密吸取1ml接受液(同时补充等量等温接受液)，接受液经0.22µm微孔滤膜过滤后，取20µl滤液进样测定。将峰面积带入标准曲线计算药物浓度，按式(2)计算各时间点的单位面积累积透过量(qn,µg·cm^-2)，绘制qn-t方程，平行实验6次，取平均值。结果见图4。

(2)

其中，qn第n小时单位面积累积透过药量；cn第n小时取样的浓度；a扩散池有效扩散面积。

实施例7：咪喹莫特脂质体透皮凝胶制剂

配方：胆固醇50mg、蛋黄卵磷脂（s100）200mg，维生素e16mg，咪喹莫特10mg，磷酸盐缓冲液10ml(ph=6.5)，卡波姆9400.3g、尼泊金乙酯0.002g，甘油0.1g。

制备方法：精密称取胆固醇50mg、蛋黄卵磷脂（s100）200mg，维生素e16mg，咪喹莫特10mg，加入20ml三氯甲烷，搅拌使各成分溶解，得到澄清透明溶液；将溶液置于500ml茄形瓶中，温度50℃，转速30r·min-1，减压旋转蒸发出溶剂，使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜，加入ph为6.5的磷酸盐缓冲液旋转30分钟，水化过夜，呈乳白色混悬液后，以1mol/lnaoh溶液调整ph值至10，40℃孵育30分钟，冰浴下超声，得到咪喹莫特脂质体得到咪喹莫特脂质体，将得到的脂质体先过0.8µm微孔滤膜滤，滤液再过0.45µm微孔滤膜，重复3次，得到脂质体溶液。称取卡波姆9400.3g、尼泊金乙酯0.002g，加入制备好的脂质体溶液中，溶胀完全后，加入甘油0.1g，研磨均匀，分装，涂于裱褙材料上，灭菌，即得咪喹莫特脂质体凝胶制剂。

实施例8：咪喹莫特脂质体透皮凝胶制剂

配方：胆固醇50mg、氢化大豆卵磷脂（s100）200mg，维生素e16g，咪喹莫特10mg，磷酸盐缓冲液10ml(ph=6.5)，卡波姆9400.3g、尼泊金乙酯0.002g，甘油0.1g。

制备方法：精密称取胆固醇50mg、氢化大豆卵磷脂（s100）200mg，维生素e16g，咪喹莫特10mg，加入20ml三氯甲烷，搅拌使各成分溶解，得到澄清透明溶液；将溶液置于500ml茄形瓶中，温度50℃，转速30r·min^-1，减压旋转蒸发出溶剂，使磷脂在容器壁上形成一层均匀薄膜，加入ph为6的磷酸盐缓冲液旋转30分钟，水化过夜，呈乳白色混悬液后，以1mol/lnaoh溶液调整ph值至9，50℃孵育45分钟，冰浴下超声，得到咪喹莫特脂质体得到咪喹莫特脂质体，将得到的脂质体先过0.8µm微孔滤膜滤，滤液再过0.45µm微孔滤膜，重复3次，得到脂质体溶液。称取卡波姆9400.3g、尼泊金乙酯0.002g，加入制备好的脂质体溶液中，溶胀完全后，加入甘油0.1g，研磨均匀，分装，涂于裱褙材料上，灭菌，即得咪喹莫特脂质体凝胶制剂。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。