长链非编码RNARP11‑224O19.2抑制剂的用途的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种长链非编码rnarp11-224o19.2抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
背景技术：
：肝癌是一种具有转移率高、病死率高、预后差的高度恶性肿瘤，对人类健康和生命造成严重威胁。肝癌的病因至今尚不完全明确，一般认为诱因包括慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、酒精滥用、毒物污染食物的摄入等。目前，肝癌的主要治疗手段有肝移植、手术切除、放疗、化疗和靶向治疗，肝癌患者的短期存活率有一定增加，但总体死亡率和术后复发率仍然居高不下。长链非编码rna(longnoncodingrna，lncrna)是一类内源性长度超过200个核苷酸的非编码rna分子，起初它被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。越来越多的证据表明，lncrna是一类具有重要生物学功能的rna，能够在表观遗传、转录和转录后水平通过介导dna甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等生物学过程来发挥调控功能。rp11-224o19.2是一种长链非编码rna，位于第1号染色体chr1:218517538-218519020，hg19，基因序列长度为1483bp，转录本长度为557bp。目前rp11-224o19.2的功能尚未见报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种长链非编码rnarp11-224o19.2抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途及治疗肿瘤的药物。rp11-224o19.2抑制剂：为抑制rp11-224o19.2表达的物质，包括阻断和/或干扰rp11-224o19.2表达的化合物、核苷酸序列等。本发明提供了一种长链非编码rnarp11-224o19.2抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。其中，所述治疗肿瘤的药物为抑制rp11-224o19.2表达的药物。进一步地，所述抑制rp11-224o19.2表达的药物为sirna药物。其中，所述sirna的核苷酸序列如seqidno：1所示。sirna为双链分子，其中，seqidno：1所示的序列为正向序列。seqidno：2所示的序列为反向序列。seqidno：1：gcaugacucugcagccauattseqidno：2：uauggcugcagagucaugctt其中，所述治疗肿瘤的药物为治疗肝癌的药物。本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物，它是以rp11-224o19.2抑制剂为活性成分，加上学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。其中，所述rp11-224o19.2抑制剂为抑制rp11-224o19.2表达的药物。其中，所述抑制rp11-224o19.2表达的药物为sirna药物。和/或，所述治疗肿瘤的药物为治疗肝癌的药物。其中，所述sirna的核苷酸序列如seqidno：1所示。本发明还提供了一种sirna分子，序列如seqidno：1所示。本发明还提供了检测rp11-224o19.2表达的试剂在制备肝癌筛查和/或肝癌预后诊断的试剂中的用途。本发明还提供了一种肝癌筛查和/或肝癌预后诊断的试剂盒，它包含任选的用于检测rp11-224o19.2表达水平的试剂。本研究发现，抑制rp11-22o19.2表达能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡，降低tgfb2表达水平，从而达到治疗肿瘤的效果，尤其对肝癌治疗效果显著，小分子rp11-224o19.2sirna可以作为靶向肿瘤的药物，应用前景良好。另外，通过检测rp11-224o19.2的表达水平，可以筛查待检人群患肝癌的风险，及对肝癌患者的预后情况做出预测，可用于临床肝癌的辅助诊断及预后判断。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明图1下调rp11-224o19.2的表达抑制hepg2细胞的增殖、克隆形成并诱导凋亡。a：转染sirna后显著地下调rp11-224o19.2的表达，b：下调rp11-224o19.2抑制hepg2细胞的增殖，c：下调rp11-224o19.2抑制hepg2细胞的克隆形成，d：下调rp11-224o19.2诱导hepg2细胞的凋亡图2下调rp11-22o19.2的表达抑制hepg2细胞的迁移和侵袭。细胞划痕实验(a)和transwell细胞迁移实验(b)表明hepg2细胞的迁移能力在rp11-224o19.2下调后被抑制了，c：transwell细胞侵袭实验表明下调rp11-224o19.2的表达抑制hepg2细胞的侵袭。图3rp11-224o19.2调控机制的初步研究。a：gse77314数据集的分析结果表明tgfb2在肝癌中上调，b：tcga数据集验证了tgfb2的上调，c：tgfb2的表达量在rp11-224o19.2被干扰后显著地下调了图4rp11-224o19.2在肝癌组织中表达上调并与肿瘤大小密切相关。gse77509(a)和tcga(b)数据集的分析结果表明rp11-224o19.2在肝癌组织中上调，gse77509(c)和tcga(d)数据集的分析结果表明rp11-224o19.2能作为生物标记物将肝癌组织和正常组织区分开，e：根据rp11-224o19.2的相对表达量将50个临床病例分为高表达和低表达组，f：高表达的rp11-224o19.2与更高阶的肿瘤大小分期相关。具体实施方式下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。实施例1靶向于rp11-224o19.2的sirna设计及筛选1、靶向于rp11-224o19.2的sirna设计与合成靶向于rp11-224o19.2的sirna及其相应的对照sirna(negativecontrolsirna)由我们自行设计，序列见表2，然后委托公司合成双链的sirna序列。2、实验分组及细胞转染实验分组：根据不同的处理条件将细胞分为3组，实验组(rp11-224o19.2-sirna组)为转染了干扰效率高的sirna的hepg2细胞；阴性对照组(negativecontrolsirna组)为转染了阴性对照sirna的hepg2细胞；空白组(control组)为不进行任何处理的hepg2细胞。hepg2细胞常规培养操作如下：1)细胞复苏：肝癌hepg2细胞由本实验室保存，从液氮罐中小心地取出冻存的hepg2细胞冻存管，迅速置于37℃的恒温水浴锅(金城国胜实验仪器厂)中，将冻存管缓慢摇晃使其迅速解冻。解冻完成后迅速将细胞转移到含有5ml10％fbs(法国biowest公司)dmem培养基(美国gibco公司)的10ml离心管中，用5ml移液枪(美国thermo公司)轻轻吹打细胞悬液使其充分混匀。将10ml离心管放入高速冷冻离心机(德国hermle公司)中以1200r/min离心5min。离心后小心地将上清液吸弃，用5ml10％fbsdmem培养液重悬沉淀的细胞，转移至10cm的细胞培养板(美国corning公司)中并补齐培养液至10ml，将培养板置于37℃含有5％co2的恒温细胞培养箱(日本panasonic公司)中培养，次日更换细胞培养液，继续培养。2)细胞传代：当在倒置显微镜(日本olympus公司)下观察到hepg2细胞的生长密度达到80％-90％时，细胞需要进行传代，将所有仪器设备准备完毕后，将细胞培养板置于超净工作台。首先将培养板中的旧培养基吸弃，用4ml无菌的pbs洗2次后加入1ml0.25％的胰酶(美国thermo公司)后迅速置于恒温培养箱中进行消化。消化1min后在倒置显微镜下观察细胞形态，当观察到细胞变圆并漂浮流动时，立即用5ml10％fbsdmem培养液终止消化，用5ml移液枪充分吹下细胞并将其转移到10ml离心管中，放入高速冷冻离心机中以1200r/min离心5min。离心后小心地吸弃上清液，用5ml10％fbsdmem培养液重悬沉淀的细胞，将细胞悬液一分为二后转移至10cm的细胞培养板中并补齐培养液至10ml，将培养板置于37℃含有5％co2的恒温细胞培养箱中培养。细胞转染：操作步骤如下：1)将生长状态良好并处于对数生长期的肝癌hepg2细胞消化计数后，按3×105个/孔的接种密度将细胞接种于6孔板中，置于恒温细胞培养箱中培养；2)第二天待细胞密度达到80％左右时，吸弃旧培养基，用pbs洗2次，每孔加入1.5ml无双抗的10％fbsdmem培养基；3)转染试剂配置：对于每一个孔的转染试剂的配置，取两个洁净无菌的1.5mlep管，先用250μl无双抗的dmem培养基稀释5μl浓度为100μm的sirna并轻轻混匀，然后再用250μl无双抗的dmem培养基稀释5μllipofectaminetm6000转染试剂(上海碧云天生物公司)并轻轻混匀，在室温环境下静置5min；4)静置5min后，将sirna稀释后加入到含有lipofectaminetm6000转染试剂的培养基中并轻轻混匀，在室温环境下静置20min；转染时，保证sirna的终浓度为50nm，lipofectamine6000的用量取决于sirna的用量，保证lipofectamine6000的体积和sirna的体积一样；5)静置20min后，将混匀后的混合物均匀地加入到各孔中，轻轻摇晃混匀，放入恒温细胞培养箱中培养；6)培养6h后，先将旧培养基吸弃，用pbs洗2次，每孔加入2ml含双抗的10％fbsdmem培养基，置于恒温细胞培养箱中继续培养48h；7)转染好的细胞用于后续的实验。3、提取各组的总rna并逆转为cdna总rna提取：转染48h后收集细胞。用提前预冷的depc(江苏凯基生物公司)处理的pbs洗2次，之后6孔板中每孔都加入1mltrizol试剂(美国invitrogen公司)并反复吹打充分裂解细胞，随后将细胞裂解液转入无菌无酶的1.5mlep管中。按照trizol试剂的使用说明书进行总rna的提取，提前将高速冷冻离心机预冷至4℃。首先向1.5mlep管中加入200μl氯仿(成都科龙化工)，加入后立即上下颠倒并用力摇晃，混匀后将ep管放在冰山静置10min。接下来将ep管放入高速冷冻离心机中以4℃、12000r/min离心15min，离心后ep管中液体分为三层。用移液枪小心地吸取400μl的水相rna到另一无酶的1.5mlep管中，注意枪头不要伸的太下，防止dna污染。以等体积的比例加入异丙醇(成都科龙化工)400μl，上下颠倒几次而充分混匀，冰上放置10min。将1.5mlep管放入高速冷冻离心机中以4℃、12000r/min离心10min。弃上清液，加入提前预冷的1ml75％的乙醇，冰上放置10min，充分洗涤沉淀。将1.5mlep管放入高速冷冻离心机中以4℃、12000r/min离心5min，用枪头将上清液吸弃。敞开ep管，室温晾干后加入30μl的depc处理水，室温下充分溶解沉淀。rna纯度、浓度检测：取1μlrna在酶标仪上进行rna纯度和浓度的检测，本底为depc水，rna纯度以od260/od280＝1.8-2.0为合格，将rna纯度和浓度数据保存好。rna完整性检测：提前将制胶模具和梳子用二次蒸馏水洗好并组装好，待模具干燥后组装起来，加入提取制好的1％琼脂糖凝胶(已加核酸染料)，待凝胶凝固后放入电泳槽中(北京六一仪器厂)，加入0.5×tbe电泳液(北京天根生物公司)没过胶面。取1μlrna和1μl10×loadingbuffer(北京天根生物公司)以及1μldepc水混匀，用移液枪将混匀后的rna加入到样品槽中，用电压80v电泳20min。电泳完成后在genegenius凝胶成像分析系统(美国syngene公司)中观察电泳条带并拍照。rna逆转录：rna逆转录使用美国invitrogen公司的m-mlv第一链合成试剂盒，根据试剂盒的使用说明选择建立20μl的反应体系(可逆转录1ng-5μg总rna)，并按照试剂盒使用说明书进行实验操作。将以下组分加入无核酸酶的微量pcr离心管中：各组分加入后立即瞬离混匀，然后将微量pcr管放入pcr仪(美国appliedbiosystems公司)以65℃孵育5min，完成后迅速置于冰上冷却2min以上。之后在每个微量pcr管中加入如下组分：各组分加入后瞬离混匀，在37℃下孵育2min，随后加入1μlm-mlv逆转录酶，再瞬离混匀。将微量pcr管放入pcr仪中并设置好如下程序，先在25℃孵育10min，然后在37℃孵育50min，最后在70℃加热15min以终止反应。将逆转好的cdna放于-80℃冰箱保存。4、荧光定量pcr检测sirna荧光定量pcr引物设计：利用ncbi网站的引物设计软件“primerblast”对rp11-224o19.2以及内参gapdh的引物进行设计，tm值均设定在60℃左右。引物详细信息如表1。表1rp11-224o19.2和gapdh的qrt-pcr引物rp11-224o19.2的相对定量：将转染了不同sirna的各组的cdna模板稀释1倍作为实时荧光定量pcr的cdna模板(三个重复孔)，选择三步扩增法进行实验，退火温度均为60℃，设置40个循环，每个样品三次平行重复，荧光定量pcr实验所用的试剂盒为faststartessentialdnagreenmaster(瑞士罗氏公司)。反应体系如下(反应体系为14μl)：实时荧光定量pcr的程序设置如下：5、sirna筛选结果在靶向于rp11-224o19.2的sirna的筛选中，我们发现转染了其中一组sirna的rp11-224o19.2的表达量(数值为0.319385312±0.133813761)较阴性对照组(表达数值为1.000000003±0.082696094)显著下降了(下调了70％，见图1a)，表明这条sirna对rp11-224o19.2的干扰效率达到70％，干扰效果良好，因此我们将其命名为rp11-224o19.2-sirna(见表2)。表2筛选得到的sirna和相应的对照sirna的序列因此，本发明设计的sirna序列对rp11-224o19.2的干扰效率高，可用于高效抑制rp11-224o19.2表达。实施例2靶向于rp11-224o19.2的sirna用于治疗肝癌本实验采用转染sirna的方式抑制rp11-224o9.2的表达，验证其对肝癌的作用。一、抑制rp11-224o19.2对肝癌细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响1、cck8实验检测hepg2细胞增殖实验步骤如下：1)将转染好的实验组和阴性对照组的hepg2细胞以及未处理的空白组的hepg2细胞按照3000个/孔的铺板密度铺板于96孔板中，每个96孔板设置6孔实验组、6孔阴性对照组和6孔空白组，另设6孔只加培养基进行调零，一共接种5个96孔板，铺板完成后将96孔板放入培养箱中培养；2)按照预定的实验计划，细胞分别培养24h、48h、72h、96h和120h后，取出96孔板，吸弃旧培养基，每孔避光加入含有10％cck8的新鲜培养基100μl，放入培养箱中孵育1.5h；3)孵育完成后，使用酶标仪在450nm处检测各孔的吸光度(od450值)；4)每组都先用调零孔的平均od450值进行调零，然后计算每组的平均od450值，细胞存活率＝实验组(阴性对照组)平均od450值/空白组平均od450值×100％。实验结果见表3和图1b。表3rp11-224o19.2-sirna对hepg2细胞增殖的影响可见，与空白组和阴性对照组相比，转染了rp11-224o19.2-sirna的hepg2细胞的增殖能力在转染铺板后的第3天开始被显著抑制，随着时间的延长，抑制作用更加显著，差异具有统计学意义(p<0.05)，说明了hepg2细胞的增殖能力在转染了rp11-224o19.2-sirna后被显著削弱。因此抑制rp11-224o19.2可以显著抑制肝癌细胞的增殖，rp11-224o19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。2、平板克隆形成实验检测hepg2细胞形成克隆的能力实验步骤如下：1)将转染好的实验组和阴性对照组的hepg2细胞以及未处理的空白组的hepg2细胞按照200个/孔的铺板密度分别铺板于不同的6孔板中，每个实验分组接种1个6孔板；2)铺板完成后，每孔补加培养基至5ml，轻轻摇晃培养板使细胞均匀分散，放于培养箱培养2-3周；3)每隔3天观察一次，当每个孔板出现肉眼可见的克隆时终止培养，吸弃旧培养基，用pbs洗2次；4)用4％多聚甲醛固定30min，吸弃固定液；5)每孔加入1ml的0.1％结晶紫进行染色，染色时间为20min；6)染色完成后，吸弃染色液，用pbs冲洗，室温下干燥；7)拍照，对肉眼可见的克隆数目进行统计。实验结果见表4和图1c。表4rp11-224o19.2-sirna对hepg2细胞克隆形成的影响组别克隆数空白对照组control21±2.915475947阴性对照组negativecontrol18.6±3.209361307rp11-224o19.2-sirna组11.6±1.341640786可见，与空白组和阴性对照组相比，转染了rp11-224o19.2-sirna的hepg2细胞所形成的克隆数量显著减少，差异具有统计学意义(p<0.05)，这说明hepg2细胞在转染了rp11-224o19.2-sirna后其增殖能力明显减弱。因此抑制rp11-224o19.2可以显著抑制肝癌细胞的克隆形成能力，进而抑制肝癌细胞的增殖，rp11-224o19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。3、细胞凋亡实验检测hepg2细胞凋亡实验步骤如下：细胞凋亡使用流式细胞仪(美国beckmancoulter公司)进行检测，所用的凋亡试剂盒为annexin-v-fluosstainingkit(瑞士roche公司)，本次检测由成都里来生物公司协助完成。将处于对数生长期的hepg2细胞以3×105个/孔的密度铺于6孔板中，待细胞长至80％左右时进行细胞转染，空白组不处理，阴性对照组转染negativecontrolsirna，实验组转染rp11-224o19.2-sirna，转染48h后分别收集各组细胞。将各组细胞以1200r/min离心5min，吸弃上清；各组细胞加入500μlpbs洗涤，以1200r/min离心5min，吸弃上清。将annexin-v-fluos、碘化丙啶(pi)、bindingbuffer缓冲液以1:1:48混匀，避光放置，作为工作液；取空白组、阴性对照组和实验组分别加入100μl工作液，避光孵育10min；再加入300μlbindingbuffer重悬，上机检测。实验结果见表5和图1d。表5rp11-224o19.2-sirna对hepg2细胞凋亡的影响组别克隆数空白对照组control10.02333333±4.084242076阴性对照组negativecontrol12.86333333±2.181291666rp11-224o19.2-sirna组23.87333333±0.657292426可见，与空白组和阴性对照组相比，转染了rp11-224o19.2-sirna的hepg2细胞凋亡率显著提高，差异具有统计学意义(p<0.05)，这说明rp11-224o19.2表达下调后可促进hepg2细胞凋亡。因此抑制rp11-224o19.2可以显著促进肝癌细胞的凋亡，rp11-224o19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。二、抑制rp11-224o19.2对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响1、细胞划痕实验检测hepg2细胞的体外迁移能力实验步骤如下：将转染好的实验组和阴性对照组的hepg2细胞以及未处理的空白组的hepg2细胞以3×105个/孔的铺板密度铺于6孔板中，每个实验分组铺1个6孔板。待细胞长至90％左右时，用10μl的无菌枪头在每个孔中均匀地划3条直线，用pbs轻轻的洗去划落的细胞，加入2ml不含血清的培养基进行培养。分别在划痕后0h、24h和48h在倒置显微镜(日本olympus公司)下观察并拍照，计算不同细胞分组的相对迁移距离，相对迁移距离＝0h划痕的宽度-24h(48h)划痕的宽度。实验结果见表6和图2a。表6细胞划痕实验考察对hepg2细胞体外迁移能力的影响可见，与空白组和阴性对照组相比，rp11-224o19.2表达被抑制后能显著地抑制hepg2细胞的体外迁移能力，差异具有统计学意义(p<0.001)，这说明hepg2细胞在转染了rp11-224o19.2-sirna后其迁移能力明显减弱。因此抑制rp11-224o19.2可以显著地抑制hepg2细胞的体外迁移，rp11-224o19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。2、transwell细胞迁移实验检测hepg2细胞的体外迁移能力实验步骤如下：将转染好的实验组和阴性对照组的hepg2细胞以及未处理的空白组的hepg2细胞用无血清的培养基重悬，并将其密度调整为5×104个/ml，取200μl细胞悬液加入到transwell小室(美国corning公司)的上室中，并在下室中加入500μl含20％fbs的培养基，在培养箱中培养24h后取出。先将小室中的旧培养基吸弃，用pbs洗几次，然后用干净棉签轻轻地擦去上室中未迁移的细胞。接下来在室温环境下用4％多聚甲醛固定30min，固定后用0.1％结晶紫染色20min，再用pbs洗几次。最后在倒置显微镜下观察并拍照，计算迁移到下室的细胞个数。实验结果见表7和图2b。表7transwell细胞迁移实验考察对hepg2细胞迁移的影响组别迁移细胞数空白对照组control236±13.11487705阴性对照组negativecontrol232.6666667±11.01514109rp11-224o19.2-sirna组126±6可见，在rp11-224o19.2表达下调后，hepg2细胞的体外迁移能力与空白组和阴性对照组相比被明显地削弱了，差异具有统计学意义(p<0.01)，这说明hepg2细胞在rp11-224o19.2表达下调后其体外迁移能力明显减弱了。因此抑制rp11-224o19.2可以显著地抑制hepg2细胞的体外迁移，rp11-224o19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。3、transwell细胞侵袭实验检测hepg2细胞的体外侵袭能力实验步骤如下：提前将基质胶matrigel(美国bd公司)放入4℃冰箱中过夜融化，将matrigel按1:8的比例用dmem稀释，每个transwell小室中加入100μl稀释后的matrigel进行包被，放入培养箱中孵育过夜。将转染好的实验组和阴性对照组的hepg2细胞以及未处理的空白组的hepg2细胞用无血清的培养基重悬，并将其密度调整为5×104个/ml，取200μl细胞悬液加入到transwell小室的上室中，并在下室中加入500μl含20％fbs的培养基，在培养箱中培养24h后取出。先将小室中的旧培养基吸弃，用pbs洗几次，然后用干净棉签轻轻地擦去上室中未迁移的细胞。接下来在室温环境下用4％多聚甲醛固定30min，固定后用0.1％结晶紫染色20min，再用pbs洗几次。最后在倒置显微镜下观察并拍照，计算侵袭到下室的细胞个数。实验结果见表8和图2c。表8transwell细胞侵袭实验考察对hepg2细胞体外侵袭能力的影响组别侵袭细胞数空白对照组control256±14.4222051阴性对照组negativecontrol251±13rp11-224o19.2-sirna组109.3333333±4.163331999可见，实验结果表明与空白组和阴性对照组相比，hepg2细胞的体外侵袭能力在rp11-224o19.2表达下调后被显著地抑制了，差异具有统计学意义(p<0.01)，这说明hepg2细胞在rp11-224o19.2表达下调后其侵袭能力明显减弱。因此抑制rp11-224o19.2可以显著地抑制hepg2细胞的体外侵袭，rp11-224o19.2的抑制剂可以用于治疗肝癌。综上，靶向rp11-224o19.2的sirna可以有效抑制rp11-224o19.2表达，进而抑制肝癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡，rp11-224o19.2的抑制剂对肝癌的治疗效果显著。三、抑制rp11-224o19.2对tgfb2的表达水平影响1、tgfb2在肝癌中的表达tgfb2的表达量分别提取自数据集gse77314和tcga数据库中肝癌的rna-seq表达量文件。通过对下载的rna-seq表达量文件比较分析发现，tgfb2在肝癌组织中的表达量显著高于正常组织(图3a)。此外，筛选自tcga数据库中肝癌的rna-seq表达量文件的分析结果进一步证实了tgfb2在肝癌组织中表达上调(图3b)。2、荧光定量pcr方法检测rp11-224o19.2表达量下调后的tgfb2表达量取按照实施例1方法提取的rna制备的两种cdna，即转染rp11-224o19.2-sirna的hepg2细胞组和转染了negativecontrolsirna的阴性hepg2细胞对照组。然后荧光定量pcr方法检测tgfb2表达水平。引物设计：利用ncbi网站的引物设计软件“primerblast”对tgfb2以及内参gapdh的引物进行设计，引物详细信息如表9。表9tgfb2和gapdh的qrt-pcr引物tgfb2的相对定量：将不同分组的cdna模板稀释1倍作为实时荧光定量pcr的cdna模板(三个重复孔)，选择三步扩增法进行实验，退火温度均为60℃，设置40个循环，每个样品三次平行重复，荧光定量pcr实验所用的试剂盒为faststartessentialdnagreenmaster(瑞士罗氏公司)。反应体系如下(反应体系为14μl)：实时荧光定量pcr的程序设置如下：3、rp11-224o19.2抑制后的tgfb2的表达水平结果见图3c。可见，阴性对照组的tgfb2表达量为1±0.052835971，，在rp11-224o19.2表达被抑制后，tgfb2的表达量下调了88％(数值为0.118222992±0.004975651)，差异具有统计学意义(p<0.05)。tgfb2基因属于tgfβ超家族，文献报道下调tgfb2的表达能显著地抑制肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和转移等生物学功能。本实验结果表明，抑制rp11-224o19.2的表达可以显著下调tgfb2表达，从而抑制肿瘤的发生发展，达到治疗肿瘤的效果。实施例3rp11-224o19.2表达水平与肝癌的关系分析rp11-224o19.2在肝癌中的表达：数据分析方法如下：所有实验数据使用spss19.0软件(ibmspss)进行分析，以student'st-test计算的组间p<0.05作为统计学差异阈值，作图用origin8.0和graphpadprism5软件完成。按照rp11-224o19.2的表达量倍数变化(foldchange)对50个肝癌临床病例进行分类，rp11-224o19.2的表达量倍数变化与临床病理参数的相关性分析由spss19.0软件完成，两个样本间分析采用非参数检验中的mann-whitneyutest方法，三个样本间分析采用非参数检验中的kruskal-wallistest方法，p<0.05作为统计学差异阈值。实验结果：通过对20对肝癌与正常组织样本的rna-seq表达量进行分析，我们发现rp11-224o19.2在肝癌组织中的表达量明显高于正常组织(p＝0.0146)(图4a)。对另一项50对肝癌与正常组织样本的rna-seq表达量进行分析，同样证实rp11-224o19.2在肝癌组织中表达上调(p＝0.00148,图4b)。另外，通过不同组数据的分析表明，rp11-224o19.2的表达量表现出对肝癌组织较高的诊断准确性(p＝0.00065，见图4c；p＝0.00034，见图4d)。可见，rp11-224o19.2的表达水平与肝癌呈正相关，rp11-224o19.2的高表达会显著提高患肝癌的可能性，因此，可以通过检测待检人群的rp11-224o19.2的表达水平，将肝癌的易感人群筛查出来，用于临床肝癌的辅助诊断。已知肝癌细胞的迁移、侵袭和转移会导致门静脉血栓(pvtt)，并使肝癌患者有差的预后状况。数据分析表明，rp11-224o19.2在pvtt中的表达量高于肿瘤组织，说明rp11-224o19.2与肝癌的侵袭转移正相关(图4a)。为了进一步探究rp11-224o19.2的表达量与肝癌患者的预后关系，我们将50个肝癌临床病例按照rp11-224o19.2的表达量倍数变化分为两类，31个高表达病例是指rp11-224o19.2的foldchange≥2，19个低表达病例是指rp11-224o19.2的foldchange<2，并且高表达组的rp11-224o19.2的表达量倍数变化值显著比低表达组高(p＝3.94e-09，mann-whitneyutest)(图4e)。我们将rp11-224o19.2表达量与肝癌的临床病理特征进行相关性分析，得到的结果如表10所示。此外，高表达的rp11-224o19.2与肝癌患者的晚期肿瘤分期密切相关(p＝0.029，kruskal-wallistest)(图4f)。可见，rp11-224o19.2的表达量可以用于预测肝癌患者预后状况，rp11-224o19.2表达量越高，肝癌患者的预后情况越差。表10rp11-224o19.2表达量与临床病理特征的相关性备注：有些临床数据缺失，p<0.05作为统计学差异阈值因此，通过检测rp11-224o19.2的表达水平，可以筛查待检人群患肝癌的风险，及对肝癌患者的预后情况做出预测，可用于临床肝癌的辅助诊断及预后判断。综上，抑制rp11-22o19.2表达能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡，降低tgfb2表达水平，从而达到治疗肿瘤的效果。另外，通过检测rp11-224o19.2的表达水平，可以筛查待检人群患肝癌的风险，及对肝癌患者的预后情况做出预测，可用于临床肝癌的辅助诊断及预后判断。sequencelisting<110>西南交通大学<120>长链非编码rnarp11-224o19.2抑制剂的用途<130>gy138-17p1197<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>rp11-224o19.2-sirna正义链<400>1gcaugacucugcagccauatt21<210>2<211>21<212>dna<213>rp11-224o19.2-sirna反义链<400>2uauggcugcagagucaugctt21<210>3<211>21<212>dna<213>阴性对照sirna正义链<400>3uucuccgaacgugucacgutt21<210>4<211>21<212>dna<213>阴性对照sirna反义链<400>4acgugacacguucggagaatt21<210>5<211>20<212>dna<213>rp11-224o19.2正向引物<400>5cgaaccgttgagggagtgtg20<210>6<211>20<212>dna<213>rp11-224o19.2反向引物<400>6aggccccatacacaactgaa20<210>7<211>19<212>dna<213>gapdh正向引物<400>7gttggtatcgtggaaggac19<210>8<211>18<212>dna<213>gapdh反向引物<400>8aaaggtggaggagtgggt18<210>9<211>20<212>dna<213>tgfb2正向引物<400>9ccaaagggtacaatgccaac20<210>10<211>25<212>dna<213>tgfb2反向引物<400>10cagatgcttctggatttatggtatt25当前第1页12