抑制PCSK9基因表达的药物组合物的制作方法

文档序号:11185215阅读:978来源:国知局
抑制PCSK9基因表达的药物组合物的制造方法与工艺

本发明涉及一种药物组合物,尤其涉及一种抑制pcsk9基因表达的药物组合物。



背景技术:

高脂血症(hyperlipidemia,hl)是指血脂高于正常参考值的上限的现象,是由多种原因导致脂蛋白合成与清除平衡紊乱所致。越来越多的研究发现,一些基因缺陷或表达失衡,使参与脂蛋白合成、转运和代谢的受体、酶或载脂蛋白异常,导致血脂升高。高脂血症是引起动脉粥样硬化、脑中风等心脑血管疾病的重要原因,利用药物控制血脂水平,可以减少心脑血管疾病的发病率,具有重要的临床意义。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9,pcsk9)基因是近十年来发现的一种新的致病基因,该基因编码一种前蛋白转化酶,名为神经细胞凋亡调节转化酶1(neuralapoptosis-regulatedconvertasel,narc-1),可介导低密度脂蛋白受体(low-densitylipoproteinreceptor,ldlr)降解,升高血浆中低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoproteincholesterol,ldl-c)的水平,该基因的各种突变会导致异常胆固醇血症。他汀类是目前临床上最常用的降脂药物,降脂效果得到认可,但也存在部分副作用。新近的研究发现,他汀类药物在降脂的同时,能增强pcsk9表达,从而增强ldlr降解,从而导致ldlr数量减少,进而影响到循环中ldl-c的清除,导致ldl-c水平升高,使他汀类药物降脂效果受到抑制。

黄芪性甘,微温,是传统中药材,以玉屏风散、防己黄芪汤等经典方剂为代表,黄芪在我国的使用有着悠久的历史,有补气、利尿、生肌、脱毒等功效。黄芪的主要药学活性物质基础为皂苷类、黄酮类及多糖类,另外含有有机酸类、微量元素、氨基酸、叶酸、甜菜碱等化学成分。黄酮类及异黄酮类成分是黄芪属植物中重要的药理性成分,其中黄酮类成分主要促进细胞增殖活性,以及显著的抗氧化特性;异黄酮类具有抗菌、降血脂、抗氧化性、类雌激素样作用等作用。

二硝酸异山梨醇酯可通过扩张外周血管,特别是增加静脉血容量,减少回流量,降低心脏前后负荷,而减少心肌耗氧量。主要药理作用是松弛血管平滑肌,释放一氧化氮,一氧化氮与内皮释放的舒张因子相同,激活鸟苷酸环化酶,使环鸟苷酸增加,肌酸蛋白轻链去磷酸化,从而松弛血管平滑肌,扩张冠状动脉,增加冠脉血流量;扩张外周动脉,降低外周血管阻力,降低血压。

针对高脂血症的治疗,为了在获得显著降脂效果的同时取得有效预防或改善其他心血管疾病的疗效,发明人根据高血脂临床治疗的最新研究进展情况和高血脂患者的疾病发展趋势,创造性地将黄芪异黄酮提取物与二硝酸异山梨醇酯联用治疗高血脂,协同降低血脂,目前未见报道。



技术实现要素:

针对现有技术中存在的技术问题,本案提供一种抑制pcsk9基因表达的药物组合物。

为实现上述目的,本案通过以下技术方案实现:

一种药物组合物,其中,所述的药物组合物包括黄芪异黄酮提取物及二硝酸异山梨醇酯。

优选的是,所述的药物组合物,其中,所述的黄芪异黄酮提取物中异黄酮总含量为20~95%。

优选的是,所述的药物组合物,其中,所述的黄芪异黄酮提取物包括毛蕊异黄酮-7-o-β-d-葡萄糖苷、芒柄花素-7-o-β-d-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素。

优选的是,所述的药物组合物,其中,所述的黄芪异黄酮提取物中异黄酮总含量为20~95%,其中毛蕊异黄酮的含量为5~16%。

优选的是,所述的药物组合物,其中,所述黄芪异黄酮类提取物和二硝酸异山梨醇酯的重量比为10-35:1。

优选的是,所述的药物组合物,其中,所述的药物组合物中还含有可药用载体或赋形剂,如羧甲基纤维素、淀粉、β-环糊精的一种或多种。

优选的是,所述的药物组合物,其中,所述的药物组合物为胶囊剂、片剂、颗粒剂或溶液剂。

一种药物组合物在pcsk9基因表达抑制剂中的应用。

本发明的有益效果是:

(1)该药物组合物能够抑制肝脏pcsk9基因表达,增加ldlr表达量。

(2)该药物组合物显示了优异的降低血中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的作用,因此作为用于降低血中ldl胆固醇的药物是有用的。

附图说明

图1为药物组合物对高血脂模型大鼠肝脏pcsk9和ldlr的mrna表达

与空白对照组比较,*p<0.02;与高脂模型组比较,&p<0.02;与联合用药组比较,#p<0.02。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1:黄芪异黄酮提取物的制备

取黄芪药材,粉碎,以80%乙醇回流提取两次(2小时,1小时)过滤,合并两次乙醇提液,减压回收溶剂,浓缩至含0.8g生药/ml,再以2ml/min速度通过20gh-107型大孔树脂,上样量不超过3g生药/ml树脂,依次用6倍柱体积纯水,6倍柱体积30%乙醇,8倍柱体积80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱部分,洗脱液减压回收溶剂,60℃干燥,粉碎,即得。

共制备3批样品,其黄芪异黄酮总含量(以毛蕊异黄酮计算)及毛蕊异黄酮的含量分别见表1:

表1黄芪异黄酮提取物的制备结果

将3批样品混合得到黄芪异黄酮提取物,作为下面的生物学试验的样品。

实施例2:黄芪异黄酮提取物和二硝酸异山梨醇酯组合物对高脂血症大鼠模型pcsk9基因表达的影响

1、分组及模型建立

spf级雄性sd大鼠60只,体重(150±20)g,分笼喂养于室温下明暗各24h的动物饲养室内,饮水不限。大鼠适应性喂养(喂食普通饲料)1周后,随机分为空白对照组、高脂模型组、二硝酸异山梨醇酯组、黄芪异黄酮组和黄芪异黄酮与二硝酸异山梨醇酯联合用药组5组。根据人体实验剂量和成人与大鼠的体重折算系数折算成大鼠用药量。造模同时灌胃给黄芪异黄酮和二硝酸异山梨醇酯,黄芪异黄酮剂量为每天100mg/kg,二硝酸异山梨醇酯剂量为每天5mg/kg,联合用药组以两者联合剂量给药;空白对照组和高脂模型组每天灌服0.1%的羧甲基纤维素钠,每周称重1次用以调整灌胃量,连续给药10周。

2、动物处置及标本采集

实验末次给药后,禁食24h,不禁水,称体重,7%水合氯醛皮下麻醉,腹主动脉采血10ml。将大鼠处死后,迅速剥取其全部肝脏,用预冷5℃的生理盐水反复冲洗,直到未见淤血,用滤纸吸干,做好标记并称重、拍照。标本采集完后,所剩动物尸体按有关要求进行处置。

3、大鼠血脂的测定

将采集的大鼠血液5℃、3500r/min离心10min,分离血清,全自动生化分析仪测定tc(总胆固醇)和ldl-c。

4、real-timepcr检测大鼠肝脏pcsr9和ldlr的mrna表达

在冰上将肝脏组织用trizol试剂匀浆至无明显组织颗粒,并按trizol试剂盒操作要求提取肝脏总rna,按rt-pcr试剂盒操作进行反转录。扩增的cdna加入至20μl的反应体系中。pcsk9的上游引物序列为5’-acgatgcctgcctcactcc-3’,下游引物序列为5’-gcctgtgatgtcccactctgt-3’;ldlr的上游引物序列为5’-gattggctatgagtgcctatgtc-3’,下游引物序列为5’-gtgaagagcagaaaccctatgg-3’;gapdh的上游引物序列为5’-caaggtcatccatgacaactttg-3’,下游引物序列为5’-gtccaccaccctgttgctgtag-3’,以gapdh作为内参照,目的基因pcsk9的表达根据经real-timepcr仪器检测的ct值,通过公式2-△△ct计算相对表达量。

5、westernblot法检测大鼠肝脏pcsk9和ldlr蛋白的表达

在冰上将肝脏组织用细胞裂解液匀浆至无明显组织颗粒,静置充分裂解,离心后取上清,用bca法测定蛋白浓度,蛋白定量100μg,煮沸10min,上样于5%sds-page胶电泳2h,全湿式电转将分离胶上的蛋白转移到pvdf膜上。室温下用含5%脱脂奶粉封闭2h。加入i抗(兔抗鼠pcsk9,1:1000;兔抗鼠β-actin抗体,1:5000)及ⅱ抗(1:5000),化学发光检测目的条带,在凝胶成像系统上观察分析并拍照。用目的蛋白与内参蛋白的灰度值之比计算蛋白的相对表达量。

6、统计学处理

实验数据以均值±标准差(mean±sd)表示,采用spss17.0软件进行统计分析,资料经正态性及方差齐性检验后,进行单因素方差分析,组间两两比较,采用snk-q检验法,以p<0.02表示差异有统计学显著性。

7、结果

7.1药物组合物对高血脂模型大鼠血清血脂水平的影响

各组大鼠血脂水平见表2,结果显示与正常对照组比较,高脂模型组大鼠血清tc和ldl-c水平均明显升高,差异有统计学显著性(p<0.02),与模型组大鼠比较,二硝酸异山梨醇酯组、黄芪异黄酮组和黄芪异黄酮与二硝酸异山梨醇酯联合用药组tc、ldl-c水平均明显下降,差异有统计学显著性(p<0.02),二硝酸异山梨醇酯组、黄芪异黄酮组比较,以上指标差异均无统计学显著性;而与两者单独用药比较,黄芪异黄酮与二硝酸异山梨醇酯联合用药组大鼠血清tc、ldl-c水平均明显降低(p<0.02)。

表2各组大鼠血脂水平对比(n=12)

注:与空白对照组比较,*p<0.02;与高脂模型组比较,&p<0.02;与联合用药组比较,#p<0.02。

7.2药物组合物对高血脂模型大鼠肝脏pcsk9和ldlr的mrna表达的影响

各组大鼠肝脏pcsk9和ldlr的mrna表达见图1,与正常对照组比较,高脂模型组pcsk9的mrna表达明显升高,ldlr的mrna表达明显降低,差异均有统计学显著性(p<0.02)。与高脂模型组比较,二硝酸异山梨醇酯组pcsk9和ldlr的mrna表达升高,差异有统计学显著性(p<0.02);黄芪异黄酮组pcsk9的mrna表达降低不明显,差异有统计学显著性(p<0.02),ldlr的mrna表达升高不明显,差异有统计学显著性(p<0.02);联合用药组pcsk9的mrna表达明显降低,ldlr的mrna表达则明显升高,差异均有统计学显著性(p<0.02)。

7.3药物组合物对高血脂模型大鼠肝脏pcsk9和ldlr蛋白表达的影响

各组大鼠肝脏pcsk9和ldlr蛋白的表达见表3,结果显示与正常对照组比较,高脂模型组pcsk9的蛋白表达明显升高,ldlr的蛋白表达明显降低,差异有统计学显著性(p<0.02)。与高脂模型组比较,二硝酸异山梨醇酯组的pcsk9蛋白表达差异无统计学显著性,ldlr蛋白表达明显升高,差异有统计学显著性(p<0.02);黄芪异黄酮组的pcsk9蛋白表达明显降低,ldlr蛋白表达明显升高,差异均有统计学显著性(p<0.02);联合用药组的pcsk9蛋白表达明显降低,ldlr蛋白表达明显升高,差异均有统计学显著性(p<0.02)。联合用药组pcsk9蛋白表达均低于单独黄芪异黄酮组合和二硝酸异山梨醇酯组的蛋白表达值差异有统计学显著性(p<0.02);联合用药组ldlr蛋白表达均高于黄芪异黄酮组和二硝酸异山梨醇酯组的蛋白表达值,差异有统计学显著性(p<0.02)。

表3各组大鼠pcsk9和ldlr蛋白表达水平(n=12)

注:与空白对照组比较,*p<0.02;与高脂模型组比较,&p<0.02;与联合用药组比较,#p<0.02。

尽管本发明的实施方案已公开如上,但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用,它完全可以被适用于各种适合本发明的领域,对于熟悉本领域的人员而言,可容易地实现另外的修改,因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下,本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

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