一种光辉霉素纳米颗粒悬浮液及其制备方法与流程

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一种光辉霉素纳米颗粒悬浮液及其制备方法与流程

【技术领域】

本发明属于药物递送技术领域。更具体地,本发明涉及一种光辉霉素纳米颗粒悬浮液,还涉及所述光辉霉素纳米颗粒悬浮液的制备方法。



背景技术:

光辉霉素(mithramycina,mit),又名普卡霉素,是一种天然生成的聚酮类抗肿瘤抗生素,属于金霉酸家族。光辉霉素被批准临床应用以来,其作为一种化疗药物先后被用于治疗睾丸胚胎癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤。光辉霉素能够通过与dna上gc富集区的小沟结合,最主要的作用机制是竞争性抑制转录因子sp1与基因调控元件的结合,继而影响dna-蛋白复合物的形成,并调控相关基因的表达。sp1是一种具有锌指结构的转录因子,其在多种肿瘤细胞中过表达并且参与调控癌症发生发展过程中多个方面的基因表达,包括扩增、分化、dna损伤修复、凋亡、血管生成、癌细胞的侵袭和转移。光辉霉素能够通过抑制sp1转录调节功能,调控下游基因的表达,如启动子中包含sp1结合位点的癌基因c-myc和c-src在光辉霉素处理后表达量明显下降。同时,光辉霉素还能够下调p53负调控因子mdm2的转录水平,从而激活p53通路并引起细胞周期阻滞和凋亡过程。光辉霉素也被证明能够通过多个途径逆转癌细胞的药物阻抗,比如降低异元生物质泵abcg2和多药耐药基因mdr1的表达量。已有研究表明,光辉霉素能够通过抑制dna甲基化转移酶dnmt和组蛋白乙酰化酶hdac影响表观遗传。临床前研究已经证明,光辉霉素能够抑制肺癌、肉瘤、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胃癌和前列腺癌等多种肿瘤的发生和发展。近些年,光辉霉素的临床前研究成果也促使其用于治疗癌症的多个i/ii期临床试验相继开展。由此可见,光辉霉素在肿瘤治疗方面的临床应用可能会有一个更大的发展。然而,光辉霉素在临床用于肿瘤治疗时需要较高剂量,而其产生的系统性毒性限制了治疗效果。为了增强其安全性和疗效,开发新的光辉霉素递送系统是一种可行的方法。

纳米技术依靠其独有的特性已经被广泛应用于药物递送系统的开发,特别是在癌症治疗方面。使用纳米颗粒作为载体靶向输送化疗药物被认为能够很好地改善生物利用度以及减少系统毒性。与小分子药物本身相比,载药纳米颗粒能够避免肾清除继而延长在血浆中的半衰期。同时,由于肿瘤组织中异常的微血管壁以及被抑制的淋巴管外排功能,使得纳米尺度的物质能够依靠epr效应(enhancedpermeabilityandretention)在肿瘤部位积累。由机体内天然分子共聚形成的多聚物材料均有生物可降解和生物相容的特性,并且已被用于多种方式的临床治疗。多聚物能够保护包载物不被降解并可控释放,广泛用于制备多种药物递送系统。其所制备的药物载体中药物释放速度受到多聚物在体内降解速度以及药物在基质中扩散速度影响,从而发挥控制释放的作用。纳米颗粒能够通过修饰表面延长血浆半衰期,从而更好的发挥被动靶向作用。

基于以上现有技术状况,本发明人通过大量实验研究与总结分析,终于完成了本发明。



技术实现要素:

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种光辉霉素纳米颗粒悬浮液。

本发明的另一个目的是提供所述光辉霉素纳米颗粒悬浮液的制备方法。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一种光辉霉素纳米颗粒悬浮液的制备方法。

本发明光辉霉素纳米颗粒悬浮液的制备方法步骤如下:

a、制备二嵌段共聚物溶液

将二嵌段共聚物溶于乙酸乙酯溶剂中,得到浓度为30~40mg/ml的二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液;

b、制备光辉霉素有机相

按照以毫升计乙酸乙酯溶液与以毫克计光辉霉素的比1:1.0~3.0,把光辉霉素加到上述二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液中,振荡溶解,得到一种含有光辉霉素的有机相;

c、制备乳化剂溶液

将乳化剂溶于水中,得到浓度为以重量计0.5~5%的乳化剂溶液;

d、混合

在使用剪切力均质机对步骤c制备的乳化剂溶液进行均质的条件下,滴加在步骤b得到的有机相,滴加结束后立即将混合液置于冰浴中,继续使用探头超声仪进行超声乳化;

e、后处理

步骤d得到的乳化液使用真空旋转蒸发仪在室温下除去其中含有的有机溶剂;接着使用millipore公司截留分子量为30000da的超滤管除去其中含有的未包载游离药物,使用双蒸水对悬液进行连续超滤清洗,然后通过0.22μm针头滤器过滤,得到光辉霉素纳米颗粒悬浮液。

根据本发明的一种优选实施方式,在步骤a中,所述的二嵌段共聚物是由两种选自聚乳酸乙醇酸共聚物、聚乙二醇、左旋聚乳酸、右旋聚乳酸、外消旋聚乳酸、聚酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚己内酯、聚氨基几丁聚糖、聚氧化乙烯、醋酸纤维素、聚[(r)-3-羟基丁酸]、聚多糖或聚2-羟乙基甲基丙烯酸的生物相容性聚合物组成的。

根据本发明的另一种优选实施方式,在步骤a中,所述的乙酸乙酯由选自二氯甲烷、三氯甲烷或乙醚的有机溶剂代替。

根据本发明的另一种优选实施方式,在步骤b中,光辉霉素由选自光辉霉素sk、光辉霉素sdk或ec-8042的光辉霉素结构改造化合物代替。

根据本发明的另一种优选实施方式,在步骤c中,所述的乳化剂选自泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、pva、聚氧乙烯蓖麻油、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯、聚乙烯马来酸酐、胆酸钠、磺基琥珀酸二辛酯钠、十六烷基三甲基溴化铵、皂苷、糖酯、吐温20或吐温80。

根据本发明的另一种优选实施方式,在步骤d中,所述的混合液在30~50%振幅的条件下超声乳化2~6min。

根据本发明的另一种优选实施方式,在步骤d中,所述的光辉霉素纳米颗粒悬浮液在温度4℃下储存。

本发明还涉及所述制备方法制备得到的光辉霉素纳米颗粒悬浮液。

根据本发明的一种优选实施方式,光辉霉素纳米颗粒具有下述物理特性:

平均粒径为20.4~29.6nm;多聚物分散性指数为0.252~0.282;表面电荷为-15.0~24.2mv。

根据本发明的另一种优选实施方式,所述光辉霉素纳米颗粒具有下述化学特性:

该光辉霉素纳米颗粒的载药量为1.60~2.62%;包封率为22.28~36.68%;在透析管中,在100mlph7.4pbs溶液中,在温度37℃与转速150rpm的磁力搅拌下5天总释放率为59.4~65.4%。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一种光辉霉素纳米颗粒悬浮液的制备方法。

本发明光辉霉素纳米颗粒悬浮液的制备方法步骤如下:

a、制备二嵌段共聚物溶液

将二嵌段共聚物溶于乙酸乙酯溶剂中,得到浓度为30~40mg/ml的二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液;

在本发明中,二嵌段共聚物的主要作用是作为载体材料包载药物并且控制药物释放,延长药物的血浆半衰期。

根据本发明,所述的二嵌段共聚物是由两种选自聚乳酸乙醇酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide),plga]、聚乙二醇[poly(ethyleneglycol),peg]、左旋聚乳酸[poly(l-lacticacid),plla]、右旋聚乳酸[poly(d-lacticacid),pdla]、外消旋聚乳酸[poly(d,l-lacticacid),pdlla]、聚酰胺(polyamide,pa)、聚异丙基丙烯酰胺[poly(n-isopropylacrylamide),pnipa]、聚乙烯亚胺(polyethylenimine,pei)、聚乙烯醇(polyvinylalcohol,pva)、聚乙酸乙烯酯(polyvinylacetate,pvac)、聚己内酯[poly(e-caprolactone),pcl]、聚氨基几丁聚糖(chitosan)、聚氧化乙烯[poly(ethyleneoxide),peo]、醋酸纤维素(celluloseacetate,ca)、聚[(r)-3-羟基丁酸]{poly[(r)-3-hydroxybutyricacid],phb}、聚多糖(polysaccharide)、聚2-羟乙基甲基丙烯酸[poly(2-hydroxyethylmethacrylate),phema]的生物相容性聚合物组成的。例如,本发明使用的二嵌段共聚物都是目前市场上销售的产品,例如由济南岱罡生物工程有限公司以商品名聚乙二醇聚乳酸乙醇酸共聚物销售的peg-plga二嵌段共聚物、由济南岱罡生物工程有限公司公司以商品名聚乙二醇聚己内酯二嵌段共聚物销售的peg-pcl二嵌段共聚物、由济南岱罡生物工程有限公司以商品名聚乙二醇左旋聚乳酸销售的peg-plla二嵌段共聚物、由济南岱罡生物工程有限公司以商品名聚乙二醇右旋聚乳酸销售的peg-pdla二嵌段共聚物。

根据本发明,使用的乙酸乙酯溶剂可以由选自二氯甲烷、三氯甲烷或乙醚的有机溶剂代替。本发明使用的溶剂可以是其中一种上述溶剂或多种上述溶剂的混合物,这些溶剂都是目前市场上销售的产品。当然,凡是具有与所述有机溶剂相近性能,同时对光辉霉素纳米颗粒悬浮液没有不利影响的其它有机溶剂也可以应用于本发明,这些溶剂也都在本发明的保护范围之内。

根据本发明,如果二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液的浓度小于30mg/ml,则包封率下降;如果二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液的浓度大于40mg/ml,则粒径增加并且载药量下降;因此,二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液的浓度为30~40mg/ml是合理的;优选地是32~38mg/ml。

b、制备光辉霉素有机相

按照以毫升计乙酸乙酯溶液与以毫克计光辉霉素的比1:1.0~3.0,把光辉霉素加到上述二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液中,振荡溶解,得到一种含有光辉霉素的有机相;

本发明使用的光辉霉素是目前市场上销售的产品,例如由sigma-aldrich公司以商品名mithramycin销售的光辉霉素。

本发明使用的光辉霉素可以由选自光辉霉素sk、光辉霉素sdk或ec-8042的光辉霉素结构改造化合物代替。这些光辉霉素结构改造化合物是光辉霉素糖链以及糖配基基团修饰和改造产物,它们是与光辉霉素具有相似结构和作用机制的化合物。例如光辉霉素sk、光辉霉素sdk是由文献jamchemsoc.2003may14;125(19):5745-53报道的与光辉霉素具有相似作用的衍生物;光辉霉素ec-8042是由clincancerres.2016aug15;22(16):4105-18报道的与光辉霉素具有相似作用的衍生物。

在本发明中,如果乙酸乙酯溶液与光辉霉素的比大于1:1.0,则载药量降低;如果乙酸乙酯溶液与光辉霉素的比小于1:3.0,则包封率降低;因此,乙酸乙酯溶液与光辉霉素的比为1:1.0~3.0是恰当的,优选地是1:1.4~2.6;更优选地是1:1.8~2.2。

c、制备乳化剂溶液

将乳化剂溶于水中,得到浓度为以重量计0.5~5%的乳化剂溶液;

在本发明中,乳化剂的主要作用是降低有机相与水相之间的表面张力并降低有机相在水相中所形成液滴的大小,因此,本发明使用的乳化剂是水包油类型的乳化剂。在本发明中,凡是具有这些作用,同时对光辉霉素纳米颗粒悬浮液不会产生不良影响的乳化剂都可以应用于本发明,也都在本发明的保护范围之内。

根据本发明,所述的乳化剂选自泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、pva、聚氧乙烯蓖麻油(cremophorel)、维生素e聚乙二醇琥珀酸酯(vitamine-tpgs)、聚乙烯马来酸酐[poly(ethylene-alt-maleicanhydride),pema]、胆酸钠(cholicacidsodiumsalt,cha)、磺基琥珀酸二辛酯钠(dioctylsulfosuccinatesodium,dss)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammoniumbromide,ctab)、皂苷(saponin)、糖酯(sugaresterd1216)、吐温20或吐温80。

本发明使用的这些乳化剂都是目前市场上销售的产品,例如由gibco公司以普朗尼克f-68商品名销售的泊洛沙姆188、由百灵威公司以聚乙烯醇商品名销售的pva、由medchemexpress公司以维生素e聚乙二醇琥珀酸酯商品名销售的vitamine-tpgs、由德国巴斯夫公司销售的cremophorel。

d、混合

在使用剪切力均质机对步骤c制备的乳化剂溶液进行均质的条件下,滴加在步骤b得到的有机相,滴加结束后立即将混合液置于冰浴中,继续使用探头超声仪进行超声乳化;

本发明首先使用剪切力均质机进行均质的作用是使有机相初步形成乳滴;然后使用探头超声仪进行超声乳化的作用是进一步乳化并使乳滴减小并均一化;

使用剪切力均质机在22000rpm条件下对步骤c制备的乳化剂进行均质。本发明使用的剪切力均质机例如是由大龙兴创实验仪器(北京)有限公司以商品名手持式均质机销售的产品。

优选地,使用探头超声仪让所述的混合液在30~50%振幅的条件下超声乳化2~6min。本发明使用的探头超声仪例如是由sonics&materials公司以商品名探头超声仪销售的产品。

根据本发明,所述的光辉霉素纳米颗粒悬浮液在温度4℃下储存,这是因为避免药物在储存过程中释放并且该纳米颗粒混悬剂在4℃下稳定。

e、后处理

步骤d得到的乳化液使用真空旋转蒸发仪在室温下除去其中含有的有机溶剂;接着使用millipore公司截留分子量为30000da的超滤管除去其中含有的未包载游离药物,使用双蒸水对悬液进行连续超滤清洗,然后通过0.22μm针头滤器过滤,得到光辉霉素纳米颗粒悬浮液。

使用真空旋转蒸发仪在室温减压条件下除去有机溶剂,以达到乳化液中的有机溶剂含量为以重量计0.01%以下。

本发明使用的真空旋转蒸发仪例如是由上海亚荣生化仪器厂以商品名旋转蒸发器销售的产品。

本发明使用超滤管除去未包载游离药物时,乳化液中未包载游离药物的含量为以重量计0.01%以下。

本发明使用双蒸水连续超滤清洗的目的是去除游离药物以及过量的乳化剂。

本发明还涉及所述制备方法制备得到的光辉霉素纳米颗粒悬浮液。

按照下述方法检测本发明光辉霉素纳米颗粒的粒径、表面电位与形态:

将制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液使用双蒸水稀释十倍,加到样品池中,再置于由布鲁克海文公司销售的zetaplus粒度仪中,在温度25℃下采用动态光散射法检测颗粒粒径和表面电位。

为了观察颗粒形态,取50ul10μg/ml光辉霉素纳米颗粒悬浮液滴加在铝箔上,在室温下挥干,然后固定于铜块上并喷金膜,然后使用扫描电镜检测。

另将10μg/ml光辉霉素纳米颗粒悬浮液滴加至覆盖碳膜的200目铜网上,用滤纸吸取多余液体,在铜网上保留一层液膜,自然干燥。使用以重量计2%磷钨酸溶液负染样品15min,然后用蒸馏水洗去游离磷钨酸并晾干,置于透射电镜检测。检测结果显示(参见附图2),本发明方法制备的光辉霉素纳米颗粒平均粒径为20.4~29.6nm;多聚物分散性指数为0.252~0.282;表面电荷为-15.0~24.2mv。电镜照片显示纳米颗粒为近球形。

按照下述方法检测本发明光辉霉素纳米颗粒的载药量和包封率:

取1ml光辉霉素纳米颗粒悬液置于温度-70℃预冻,然后冻干24h。冻干纳米颗粒称重,并加入1ml二甲基亚砜溶解。使用超声浴处理30min,再在12000xg条件下离心15min,上清液采用hplc检测,并由光辉霉素标准曲线计算纳米颗粒中所包药物含量。载药量和包封率计算公式如下:

检测结果显示,光辉霉素纳米颗粒的载药量为1.60~2.62%;包封率为22.28~36.68%。

光辉霉素纳米颗粒体外药物释放速率检测:

取1ml超滤的光辉霉素纳米颗粒悬液置于透析管中,然后将透析管放入100mlpbs(ph7.4)中,在温度37℃下以150rpm低速磁力搅拌pbs。在多个时间点取出1ml透析管外侧液体进行hplc检测其光辉霉素浓度,同时再补充1ml新鲜pbs。检测结果列于图3。

图3结果显示,所制备的光辉霉素纳米颗粒在初始的48h内,有一个较快地释放速度,而后光辉霉素保持一个相对持续地缓慢释放,5天后总释放率为59.4~65.4%。

本发明通过乳化溶剂挥发技术建立了一种制备光辉霉素纳米颗粒的方法,该方法能够有效地提高两性化合物光辉霉素的载药量和包封率,并具有粒径小的特点,有效改善了静脉给药问题。目前,尚未见有利用相似方式制备光辉霉素纳米颗粒的报道。

[有益效果]

本发明的有益效果是:本发明光辉霉素纳米颗粒的平均粒径为20.4~29.6nm;多聚物分散性指数为0.252~0.282;表面电荷为-15.0~24.2mv。该光辉霉素纳米颗粒的载药量为1.60~2.62%;包封率为22.28~36.68%;在透析管中,在100mlph7.4pbs溶液中,在温度37℃与转速150rpm的磁力搅拌下5天总释放率为59.4~65.4%。

本发明通过乳化溶剂挥发法制备包载光辉霉素的纳米颗粒,改善药物的释放动力学,减缓药物的体内降解过程,改变药物循环时间,增加药物在肿瘤部位富集,以及避免机体的药物阻抗机制。本发明制备的光辉霉素纳米颗粒能够较好地保留光辉霉素的药理学活性,而且本发明使用的材料为生物相容性材料,具有应用安全性特点,表现出良好的应用前景。同时,所述光辉霉素纳米颗粒能够有效在裸鼠移植瘤部位富集,并展现了对人胰腺癌细胞bxpc-3裸鼠移植瘤显著地治疗效果。

【附图说明】

图1是本发明光辉霉素纳米颗粒悬浮液制备流程图;

图2是本发明光辉霉素纳米颗粒形态电镜观察图;

图3是本发明光辉霉素纳米颗粒体外药物释放检测结果图;

图4是肿瘤细胞摄取本发明光辉霉素纳米颗粒的激光共聚焦显微镜观察图;

图5是肿瘤细胞摄取本发明光辉霉素纳米颗粒的流式细胞术检测结果图;

图中:

5a-相对荧光强度-细胞数曲线图;5b-时间-相对荧光强度柱状图。

图6是采用srb法检测光辉霉素(mit)和本发明光辉霉素纳米颗粒(mit-np)抑制肿瘤细胞增殖作用结果图;

图7是活体成像实验观察本发明光辉霉素纳米颗粒在裸鼠移植瘤模型中的体内分布情况;

图中:

7a-不同时间点荷瘤小鼠的荧光图像;

7b-注射168h后离体瘤块以及多种器官(1-瘤块;2-肝;3-心;4-肺;

5-胃;6-小肠;7-结肠;8-肾;9-胰腺;10-脾;11-股骨)的荧光图像;

图7a中bxpc-3栏右侧标尺自下而上的数值分别是1.0、1.2、1.4、1.6

(×1010)

图7a中miapaca-2栏右侧标尺自下而上的数值分别是2.0、2.5、3.0、

3.5、4.0(×1010)

图7b中bxpc-3栏右侧标尺自下而上的数值分别是4.0、4.5、5.0、5.5、

6.0、6.5、7.0(×1010)

图7b中miapaca-2栏右侧标尺自下而上的数值分别是0.8、1.0、1.2、

1.4、1.6、1.8、2.0(×1010);

图8是本发明光辉霉素纳米颗粒抑制人胰腺癌bxpc-3裸鼠移植瘤的生长情况;

图中:

8a-移植瘤生长曲线图;8b-荷瘤小鼠体重曲线图。

图9是本发明光辉霉素纳米颗粒组(2mg/kg)和对照组裸鼠多种器官切片的h&e染色图(胰腺、骨髓、脾、肝、肺、心、肾、小肠)。

图10是免疫组化检测肿瘤组织中ki-67表达状况图。

【具体实施方式】

通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

实施例1:制备光辉霉素纳米颗粒悬浮液

利用乳化溶剂挥发法制备光辉霉素纳米颗粒基本过程参见附图1。

该实施例的实施步骤如下:

a、制备二嵌段共聚物溶液

将由济南岱罡生物工程有限公司销售的mpeg-plga二嵌段共聚物(peg分子量5000da;plga分子量15000da;乳酸与乙醇酸摩尔比:50/50)溶于乙酸乙酯溶剂中,得到浓度为30mg/ml的二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液;

b、制备光辉霉素有机相

按照以毫升计乙酸乙酯溶液与以毫克计光辉霉素的比1:2.2,把由sigma-aldrich公司以商品名mithramycin销售的光辉霉素加到上述二嵌段共聚物乙酸乙酯溶液中,振荡溶解,得到一种含有光辉霉素的有机相;

c、制备乳化剂溶液

将泊洛沙姆188乳化剂溶于水中,得到浓度为以重量计2.0%的泊洛沙姆188乳化剂溶液;

d、混合

在使用由大龙兴创实验仪器(北京)有限公司以商品名手持式均质机销售的剪切力均质机在5档(22000rpm)条件下对步骤c制备的乳化剂溶液进行均质的条件下,滴加在步骤b得到的有机相,滴加结束后立即将混合液置于冰浴中,继续使用由sonics&materials公司销售的探头超声仪在30%振幅的条件下进行超声乳化2min;

e、后处理

步骤d得到的乳化液使用上海亚荣生化仪器厂销售的旋转蒸发器在室温下除去其中含有的有机溶剂;接着使用millipore公司截留分子量为30000da的超滤管除去其中含有的未包载游离药物,使用双蒸水对悬液进行连续超滤清洗,然后通过0.22μm针头滤器过滤,得到光辉霉素纳米颗粒悬浮液。所述的光辉霉素纳米颗粒悬浮液在温度4℃下储存。

按照本说明书描述的方法检测了该实施例制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液的物理与化学性能。

在该实施例制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液中,光辉霉素纳米颗粒的平均粒径为27.3nm;多聚物分散性指数为0.252;表面电荷为-21.9mv。该光辉霉素纳米颗粒的载药量为1.83%;包封率为36.68%;在透析管中,在100mlph7.4pbs溶液中,在温度37℃与转速150rpm的磁力搅拌下5天总释放率为59.4%。

实施例2:制备光辉霉素纳米颗粒悬浮液

该实施例的实施步骤如下:

a、制备二嵌段共聚物溶液

将由济南岱罡生物工程有限公司销售的peg-plla二嵌段共聚物(peg分子量3000da;plla分子量15000da)溶于二氯甲烷溶剂中,得到浓度为40mg/ml的二嵌段共聚物二氯甲烷溶液;

b、制备光辉霉素有机相

按照以毫升计二氯甲烷溶液与以毫克计光辉霉素sk的比1:1.0,把由.由文献jamchemsoc.2003may14;125(19):5745-53报道的光辉霉素sk加到上述二嵌段共聚物二氯甲烷溶液中,振荡溶解,得到一种含有光辉霉素sk的有机相;

c、制备乳化剂溶液

将乳化剂pva溶于水中,得到浓度为以重量计5%的pva乳化剂溶液;

d、混合

在使用由大龙兴创实验仪器(北京)有限公司以商品名手持式均质机销售的剪切力均质机在6档(30000rpm)条件下对步骤c制备的乳化剂溶液进行均质的条件下,滴加在步骤b得到的有机相,滴加结束后立即将混合液置于冰浴中,继续使用由sonics&materials公司销售的探头超声仪在50%振幅的条件下进行超声乳化4min;

e、后处理

步骤d得到的乳化液使用上海亚荣生化仪器厂销售的旋转蒸发器在室温下除去其中含有的有机溶剂;接着使用millipore公司截留分子量为30000da的超滤管除去其中含有的未包载游离药物,使用双蒸水对悬液进行连续超滤清洗,然后通过0.22μm针头滤器过滤,得到光辉霉素纳米颗粒悬浮液。所述的光辉霉素纳米颗粒悬浮液在温度4℃下储存。

按照本说明书描述的方法检测了该实施例制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液的物理与化学性能。

在该实施例制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液中,光辉霉素纳米颗粒的平均粒径为20.4nm;多聚物分散性指数为0.282;表面电荷为-15.0mv。该光辉霉素纳米颗粒的载药量为1.60%;包封率为33.08%;在透析管中,在100mlph7.4pbs溶液中,在温度37℃与转速150rpm的磁力搅拌下5天总释放率为63.9%。

实施例3:制备光辉霉素纳米颗粒悬浮液

该实施例的实施步骤如下:

a、制备二嵌段共聚物溶液

将由济南岱罡生物工程有限公司销售的peg-pdla二嵌段共聚物(peg分子量5000da;pdla分子量20000da)溶于三氯甲烷溶剂中,得到浓度为34mg/ml的二嵌段共聚物三氯甲烷溶液;

b、制备光辉霉素有机相

按照以毫升计三氯甲烷溶液与以毫克计光辉霉素sdk的比1:1.6,把由文献jamchemsoc.2003may14;125(19):5745-53报道的光辉霉素sdk加到上述二嵌段共聚物三氯甲烷溶液中,振荡溶解,得到一种含有光辉霉素sdk的有机相;

c、制备乳化剂溶液

将乳化剂胆酸钠溶于水中,得到浓度为以重量计1.0%的胆酸钠乳化剂溶液;

d、混合

在使用由大龙兴创实验仪器(北京)有限公司以商品名手持式均质机销售的剪切力均质机在4档(18000rpm)条件下对步骤c制备的乳化剂溶液进行均质的条件下,滴加在步骤b得到的有机相,滴加结束后立即将混合液置于冰浴中,继续使用由.sonics&materials公司销售的探头超声仪在36%振幅的条件下进行超声乳化6min;

e、后处理

步骤d得到的乳化液使用上海亚荣生化仪器厂销售的旋转蒸发器在室温下除去其中含有的有机溶剂;接着使用millipore公司截留分子量为30000da的超滤管除去其中含有的未包载游离药物,使用双蒸水对悬液进行连续超滤清洗,然后通过0.22μm针头滤器过滤,得到光辉霉素纳米颗粒悬浮液。所述的光辉霉素纳米颗粒悬浮液在温度4℃下储存。

按照本说明书描述的方法检测了该实施例制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液的物理与化学性能。

在该实施例制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液中,光辉霉素纳米颗粒的平均粒径为29.6nm;多聚物分散性指数为0.274;表面电荷为-24.2mv。该光辉霉素纳米颗粒的载药量为2.62%;包封率为25.88%;在透析管中,在100mlph7.4pbs溶液中,在温度37℃与转速150rpm的磁力搅拌下5天总释放率为65.4%。

实施例4:制备光辉霉素纳米颗粒悬浮液

该实施例的实施步骤如下:

a、制备二嵌段共聚物溶液

将济南岱罡生物工程有限公司公司销售的peg-pcl二嵌段共聚物(peg分子量5000da;pcl分子量10000da)溶于乙醚溶剂中,得到浓度为38mg/ml的二嵌段共聚物乙醚溶液;

b、制备光辉霉素有机相

按照以毫升计乙醚溶液与以毫克计光辉霉素ec-8042的比1:3.0,把由clincancerres.2016aug15;22(16):4105-18报道的光辉霉素ec-8042加到上述二嵌段共聚物乙醚溶液中,振荡溶解,得到一种含有光辉霉素的有机相;

c、制备乳化剂溶液

将聚乙烯马来酸酐乳化剂溶于水中,得到浓度为以重量计3.5%聚乙烯马来酸酐乳化剂溶液;

d、混合

在使用由大龙兴创实验仪器(北京)有限公司以商品名手持式均质机销售的剪切力均质机在5档(22000rpm)条件下对步骤c制备的乳化剂溶液进行均质的条件下,滴加在步骤b得到的有机相,滴加结束后立即将混合液置于冰浴中,继续使用由sonics&materials公司以商品名探头超声仪销售的探头超声仪在在42%振幅的条件下进行超声乳化4min;

e、后处理

步骤d得到的乳化液使用由上海亚荣生化仪器厂以商品名旋转蒸发器销售的真空旋转蒸发仪在室温下除去其中含有的有机溶剂;接着使用millipore公司截留分子量为30000da的超滤管除去其中含有的未包载游离药物,使用双蒸水对悬液进行连续超滤清洗,然后通过0.22μm针头滤器过滤,得到光辉霉素纳米颗粒悬浮液。所述的光辉霉素纳米颗粒悬浮液在温度4℃下储存。

按照本说明书描述的方法检测了该实施例制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液的物理与化学性能。

在该实施例制备的光辉霉素纳米颗粒悬浮液中,光辉霉素纳米颗粒的平均粒径为25.0nm;多聚物分散性指数为0.259;表面电荷为-17.3mv。该光辉霉素纳米颗粒的载药量为1.86%;包封率为22.28%;在透析管中,在100mlph7.4pbs溶液中,在温度37℃与转速150rpm的磁力搅拌下5天总释放率为60.9%。

试验实施例1:本发明光辉霉素纳米颗粒的体外细胞内吞实验

i、激光共聚焦显微镜观察细胞摄取光辉霉素纳米颗粒的能力

采取激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞在体外对荧光染料cy5标记的光辉霉素纳米颗粒的内吞过程。其步骤如下:将处于对数生长期的人胰腺癌细胞系bxpc-3和miapaca-2细胞用胰酶消化成单细胞悬液,细胞计数并调整其浓度,按每孔2×104细胞的密度接种于8孔腔室盖玻片(thermofisher公司)。在温度37℃下培养24h,吸弃培养基,并加入300μl用培养基稀释的本发明光辉霉素纳米颗粒(1mg/ml),继续培养0.5-2h时,吸弃培养基,用pbs润洗3次,每次5min。再加入dii(细胞膜红色荧光探针,碧云天生物技术研究所)于室温下避光处理15min,再用pbs润洗3次,每次5min。使用以重量计4%多聚甲醛固定30min,用pbs润洗3次,每次5min,接着加入包含dapi的抗淬灭封片剂。使用激光共聚焦显微镜观察。其观察结果表明,bxpc-3和miapaca-2细胞均能快速摄取本方法制备的光辉霉素纳米颗粒(参见附图4)。

ii、流式细胞仪检测细胞摄取本发明光辉霉素纳米颗粒的能力

取对数生长期的bxpc-3和miapaca-2细胞,消化并计数,配制成单细胞悬液,以每孔3×105细胞加入6孔板,常规培养至细胞汇合度约70%。吸弃培养基,加入2ml包含1mg/mlcy5标记光辉霉素纳米颗粒的新鲜培养基。避光处理0.25-2h,再使用胰酶消化并收集,用pbs洗3次。然后使用facscalibur流式细胞仪检测。检测结果显示,处理15min后本发明光辉霉素纳米颗粒即可进入细胞,随时间延长细胞内荧光强度快速增加,说明肿瘤细胞能快速摄取纳米颗粒(参见附图5)。

试验实施例2:本发明光辉霉素纳米颗粒对肿瘤细胞的体外抑制活性

采用srb法检测光辉霉素及其纳米颗粒在体外对于肿瘤细胞的抑制作用。其步骤如下:取对数生长期的人胰腺癌细胞系bxpc-3、miapaca-2、aspc-1和panc-1细胞,胰酶消化并计数,以3000-7000/孔接种于96孔板中,于温度37℃下培养24h。然后,加入不同浓度的光辉霉素和本发明光辉霉素纳米颗粒,每个药物浓度设置5个平行孔。于温度37℃下孵育24-72h,吸弃培养基并加入100μl浓度为以重量计10%的三氯乙酸溶液。在温度4℃固定1h,用蒸馏水冲洗5次,自然晾干。加入100μl浓度以重量计0.4%的srb溶液(含1%乙酸),染色5min,用蒸馏水冲洗5次,自然晾干。最后,每孔加入100μl10mmtris溶液(ph10.5)溶解结合的srb,使用酶标仪测量570nm的吸光度值。

按照下述公式计算细胞的存活率:

细胞存活率=(加药组a570值-空白组a570值)/(对照组a570值-空白组a570值)×100%

式中:

加药组a570值表示测量加药组的570nm吸光度值;

对照组a570值表示测量对照组的570nm吸光度值;

空白组a570值表示测量空白组的570nm吸光度值;

这些试验结果显示,光辉霉素和本发明光辉霉素纳米颗粒对于4种肿瘤细胞均具有浓度依赖性和时间依赖性的抑制作用(参见附图6)。而且对比同等药物剂量的光辉霉素和本发明光辉霉素纳米颗粒对细胞存活率的影响可以看出两者的抑制作用并无明显差别,表明纳米颗粒制备过程并未影响光辉霉素的肿瘤抑制活性。

试验实施例3:cy5标记的光辉霉素纳米颗粒在活体中靶向肿瘤组织的能力

将人胰腺癌bxpc-3和miapaca-2细胞以1×107/只皮下接种至balb/c裸鼠右侧腋下。当肿瘤体积至300-400mm3,将cy5标记的纳米颗粒通过尾静脉注射入小鼠体内。利用ivis活体成像系统(perkinelmer公司)进行观察。于不同时间点,采用医用麻醉剂异氟烷进行处理,然后观测荷瘤小鼠体内光辉霉素纳米颗粒靶向肿瘤组织的情况。

附图7显示,本发明制备的光辉霉素纳米颗粒能较好地靶向bxpc-3和miapaca-2裸鼠移植瘤部位。从注射后2h,肿瘤部位即出现应激信号,12h左右荧光强度最强,其后逐渐减弱,直至168h在肿瘤部位仍有高于其他位置的荧光信号。于注射后168h将小鼠处死并分离出主要器官进行荧光成像显示,肿瘤组织具有明显强于其他器官的荧光信号。因此,以上结果说明本发明所制备的光辉霉素纳米颗粒能够在肿瘤部位富集。

试验实施例4:本发明光辉霉素纳米颗粒对裸鼠移植瘤bxpc-3的生长抑制作用

将处于对数生长期的bxpc-3细胞胰酶消化并计数,配制成1×108/ml细胞悬液。取体重为18-20g的雌性balb/c裸鼠建立移植瘤模型,每只接种1×107个细胞。待瘤块达到约100mm3时,按照裸鼠的瘤体积进行分组,每组6只。按照下述给药方案处理:生理盐水组,空白纳米颗粒(未含药物)组,光辉霉素组(1mg/kg)和光辉霉素纳米颗粒组(1mg/kg和2mg/kg)。尾静脉注射,每周一次,连续4周给药。第一针给药后,每4天对裸鼠体重和肿瘤体积进行测量。根据公式v=ab2/2计算肿瘤体积(a:肿瘤长径,b:肿瘤短径)。于接种肿瘤后29天,处死小鼠并解剖取出瘤块、胰腺、股骨、脾、肝、肺、心、肾以及小肠。然后采用10%福尔马林固定,石蜡包埋,切片,然后分别进行苏木精-伊红(h&e)染色,以及对瘤组织进行核增值抗原ki-67的免疫组化检测。结果表明:光辉霉素对bxpc-3移植瘤生长的抑制能力较弱,抑制率为51%,而等剂量的本发明光辉霉素纳米颗粒组(1mg/kg)的抑制率为86%(图8)。同时,2mg/kg本发明光辉霉素纳米颗粒组抑制率为96%,并未见小鼠主要脏器出现损伤(参见附图9)。免疫组化结果显示,本发明光辉霉素纳米颗粒能够降低瘤组织中核增值抗原ki-67的表达(参见附图10)。

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