具有减肥降脂作用的几丁质纳米纤维组合物及其应用的制作方法

本发明涉及减肥降脂药物或者保健品
技术领域：
，具体涉及一种具有减肥降脂作用的几丁质纳米纤维组合物及其应用。
背景技术：
：高血脂症是人类健康的重要威胁，可以导致动脉粥样硬化等心血管疾病。很多现代人有身材肥胖、体制过多的问题，不仅影响形象，还有增加身体负担和患病机率等诸多危害。壳聚糖，已被证明具有降低血浆胆固醇的作用，可能在心血管疾病的预防和治疗中发挥重要作用的影响，动物实验显示，由于带正电的壳聚糖与带负电的脂质通过静电作用，减少了动物胃肠道对脂质的吸收，从而降低血清胆固醇。目前，评估壳聚糖的降血脂效果所采用的灌胃剂量为2～5g/kg·d。1997年，日本健康、劳动与福利部门将壳聚糖作为一种特殊的健康功能食品，规定人体口服剂量为每天0.5～3g。几丁质纳米纤维与壳聚糖相比而言，虽然其表面氨基含量较低(约0.06～0.35)，但具有高密度的电荷。其中，经脱乙酰处理后几丁质纳米纤维表面具有高密度正电荷的特性(zeta-电位约+20～70mv)，而氧化几丁质纳米纤维表面具有高密度负电荷的特性(zeta-电位约﹣60mv左右)。同时几丁质纳米纤维还兼具结晶度高和纳米尺度效应，能够形成纤维网络结构。这些优异的特性为几丁质纳米纤维实现对脂质的静电吸附和包埋提供了可能。因此，开发一种基于几丁质纳米纤维的减肥降脂产品是十分有必要的。技术实现要素：发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种具有减肥降脂作用的几丁质纳米纤维组合物，将具有减肥降脂作用的几丁质纳米纤维组合物应用，能够缓解高脂血症，有望开发成为新的减肥降脂药物或保健食品。技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种具有减肥降脂作用的几丁质纳米纤维组合物，由以下质量百分比的原料组成：水分97～99.95％，几丁质纳米纤维0.05～3％。所述的几丁质来源为节肢动物如蟹、虾的外骨骼，鱿鱼顶骨，昆虫的角质层以及某些真菌的细胞壁。所述的几丁质纳米纤维的制备方法为直接机械分散法或化学脱乙酰基法(浓碱热解脱乙酰基法)或化学氧化法(tempo-naclo-nabr氧化法)或酶法氧化法(tempo-漆酶-o2氧化法)。所述几丁质纳米纤维的脱乙酰度为0.06～0.35。所述的几丁质纳米纤维组合物的ph为1～10。所述的几丁质纳米纤维组合物在制备减肥药物或减肥保健品中的应用。所述的几丁质纳米纤维组合物在制备降脂药物或保健品中的应用。一种具有减肥降脂作用的几丁质纳米纤维组合物，由以下质量百分比的原料组成：水分，几丁质纳米纤维0.05～3％，0.1ppm～10％的ph调节剂，各组分质量百分比之和为100％；所述的ph调节剂选自醋酸、盐酸、具有不同解离常数的羟基酸(果酸系列)、维生素c、一元羧酸、多元羧酸、烯烃基酸、氨基酸以及其他无机酸。该几丁质纳米纤维组合物的ph至1～5。所述的几丁质纳米纤维组合物在制备减肥药物或减肥保健品中的应用。所述的几丁质纳米纤维组合物在制备降脂药物或保健品中的应用。本发明的具有减肥降脂作用的几丁质纳米纤维组合物的应用，对小鼠进行灌胃，剂量为5～100mg/kg·d。本发明的预防和治疗方案如下：预防肥胖型实验：(1)将小鼠分成三组，空白对照组(blank)，高脂对照组(control)，实验组(chns)，实验周期为30天。(2)检测(1)小鼠的部分生化指标。应用性能检测如下：体重、体脂、血脂、器官、肝组织检查。预防方案中的步骤(1)中的几丁质纳米纤维分散液，均是对小鼠进行灌胃，剂量为5～100mg/kg·d；过程中均选用昆明小鼠，spf级，单一性别，雄性，体重18～20g，由湖北省实验动物中心提供。预防方案中的步骤(1)中各分组小鼠的处理方案如下：空白对照组(blank)：饲喂普通饲料；高脂对照组(control)：饲喂高脂饲料；实验组(chns)：饲喂高脂饲料和几丁质纳米纤维分散液灌胃(剂量为5～100mg/kg·d)。治疗肥胖型实验：(1)肥胖模型造模：正常组喂食普通饲料，造模组喂食高脂饲料，每天记录小鼠体重，30天后，计算肥胖度，造模组每只小鼠实际体重－正常组平均体重)/正常组平均体重×100％。当肥胖度大于20％，肥胖模型建立成功。(2)将肥胖造模成功小鼠分成两组：对照组(control)：饲喂高脂饲料；实验组(chns)：饲喂高脂饲料和几丁质纳米纤维分散液灌胃(剂量为5～100mg/kg·d)，实验周期为60天。(3)检测(1)小鼠的部分生化指标。应用性能检测如下：体重、体脂、血脂、器官、肝组织检查。治疗方案中的步骤(1)中的几丁质纳米纤维分散液，均是对小鼠进行灌胃，剂量为5～100mg/kg·d；过程中均选用昆明小鼠，spf级，单一性别，雄性，体重18～20g，由湖北省实验动物中心提供。治疗方案中的步骤(1)中各分组小鼠的处理方案如下：对照组(control)：饲喂高脂饲料；实验组(chns)：饲喂高脂饲料和几丁质纳米纤维分散液灌胃(剂量为5～100mg/kg·d)。有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：1)本发明几丁质纳米纤维产品具有天然、无毒、可再生、可生物降解、减肥效果明显等优点，因此可以开发成为新的减肥降脂药物或保健食品。2)本发明的几丁质纳米纤维的脱乙酰度为0.06～0.35，与壳聚糖(脱乙酰度＞0.7)相比，部分脱乙酰基过程更简易，制备工序更加绿色环保。而且，几丁质纳米纤维拥有更高的结晶度以及优良的纳米尺度效应，能够形成独特的纤维网络结构。3)本发明的几丁质纳米纤维分散液灌胃剂量为5～100mg/kg·d，与壳聚糖灌胃剂量2～5g/kg·d相比，几丁质纳米纤维分散液的剂量极低，因此该几丁质纳米纤维组合物作为减肥降脂产品更加经济环保。附图说明图1是高脂对照组小鼠肝组织切片照片图；图2是几丁质纳米纤维组小鼠肝组织切片照片图。具体实施方式：下面通过实例对本发明进一步详细说明。实施例1(1)几丁质的来源及纯化：蟹壳(portunustrituberculatus)，产自中国南通，蟹壳几丁质的纯化方法：1)蟹壳剪成1cm2大小，1mol/lnaoh浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除蟹壳中的蛋白质；2)1mol/lhcl浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除蟹壳中的钙盐等成分；3)重复以上步骤2～3次，用蒸馏水洗涤至中性，接下来用0.5％的naclo2、冰醋酸调节ph5.0、70℃水浴进行漂白2h(要先预热一下实际达到2.5h)，间歇搅拌(如漂白不彻底，洗涤至中性后进行二次漂白)；4)漂白后的样品用蒸馏水洗涤至中性，而后用榨汁机粉碎，称重放入封口袋存放于4℃冰箱保存，2天后测定含水量。(2)部分脱乙酰氨基几丁质的制备：采用浓碱热解脱乙酰基法制备部分脱乙酰基几丁质：将干重1g蟹壳几丁质浸泡于25ml35wt％naoh溶液中，90℃水浴，不断搅拌4h。反应结束后，用蒸馏水清洗部分脱乙酰几丁质至中性，留下水不溶物于4℃冰箱保存，24h后测定含水量，作为部分脱乙酰氨基几丁质湿样待用。(3)几丁质纳米纤维组合物：取干重部分脱乙酰基几丁质1g，几丁质的脱乙酰度(氨基含量)为0.29，加入蒸馏水，用醋酸调节组合物ph3.5，均质、超声成功制备出含几丁质纳米纤维0.1％的组合物。(4)将昆明小鼠分成三组，空白对照组(blank)：饲喂普通饲料，0.9％生理盐水灌胃；高脂对照组(control)：饲喂高脂饲料，ph3.5左右的醋酸溶液灌胃；实验组(dechns)：饲喂高脂饲料，醋酸分散几丁质纳米纤维分散液(ph3.5左右)灌胃，剂量为5mg/kg·d。过程中均选用昆明小鼠，spf级，单一性别，雄性，体重18～20g，由湖北省实验动物中心提供，实验周期为30天。用本发明所得的几丁质纳米纤维组合物灌胃的昆明小鼠，对其部分生化指标进行检测。(5)体重及体重增量的检测：对小鼠体重的影响，实验组(dechns)与高脂对照组(control)体重在第一周发生变化，且有显著性差异，第六天，dechns组小鼠体重增重2.96％，control组小鼠体重增重10.35％，说明在喂食高脂饲料的情况下，几丁质纳米纤维组合物显著延缓了小鼠体重的增加。经过18天的喂养，小鼠空白对照组体重和高脂对照组体重的增长率分别为41.48％、32.60％，而实验组的增长率为30.50％(表1和表2)，说明长期的几丁质纳米纤维喂养，小鼠适应了饮食环境，且剂量为5mg/kg·d的几丁质纳米纤维具有一定的延缓小鼠体重增长的作用。表1几丁质纳米纤维组合物预防组昆明小鼠体重变化分组第2天(g)第6天(g)第10天(g)第14天(g)第18天(g)blank26.98730.08433.28935.36236.827control26.58428.10330.93932.59233.769dechns26.84827.07429.38632.77634.316表2几丁质纳米纤维组合物预防组昆明小鼠体重增量分组第2天第6天第10天第14天第18天blank3.68％15.57％27.89％35.85％41.48％control4.39％10.35％21.49％27.98％32.60％dechns2.10％2.96％11.76％24.65％30.50％实施例2(1)几丁质的来源及纯化：鱿鱼顶骨，鱿鱼顶骨几丁质的纯化方法：1)鱿鱼顶骨在1mol/lnaoh浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除鱿鱼顶骨中的蛋白质；2)1mol/lhcl浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除鱿鱼顶骨中的钙盐等成分；3)重复以上步骤2～3次，用蒸馏水洗涤至中性，接下来用0.5％的naclo2、冰醋酸调节ph5.0、70℃水浴进行漂白2h(要先预热一下实际达到2.5h)，间歇搅拌(如漂白不彻底，洗涤至中性后进行二次漂白)；4)漂白后的样品用蒸馏水洗涤至中性，而后用榨汁机粉碎，称重放入封口袋存放于4℃冰箱保存，2天后测定含水量。(2)几丁质纳米纤维组合物，直接机械分散法制备几丁质纳米纤维：取干重鱿鱼顶骨几丁质1g，几丁质的脱乙酰度(氨基含量)为0.11，加入蒸馏水，用衣康酸调节组合物ph4.0，均质、超声成功制备出含几丁质纳米纤维0.2％的组合物。(3)将昆明小鼠分成三组，空白对照组(blank)：饲喂普通饲料，0.9％生理盐水灌胃；高脂对照组(control)，饲喂高脂饲料，ph4.0左右的衣康酸溶液灌胃；实验组(dechns)：饲喂高脂饲料，衣康酸分散几丁质纳米纤维分散液(ph4.0左右)灌胃，剂量为60mg/kg·d。过程中均选用昆明小鼠，spf级，单一性别，雄性，体重18～20g，由湖北省实验动物中心提供，实验周期为30天。用本发明所得的几丁质纳米纤维组合物灌胃的昆明小鼠，对其部分生化指标进行检测。(4)器官重量及体脂含量的检测：对小鼠器官的影响，空白对照组(blank)、高脂对照组(control)与实验组(dechns)小鼠各器官占体重的比例差别不大，说明各组小鼠器官发育正常，小鼠正常生长(表3)。高脂对照组(control)小鼠肾脏周边脂肪、睾丸周边脂肪和肠系周边脂肪含量比空白对照组(blank)高，说明喂食高脂饲料导致了小鼠的肥胖，肥胖模型建立成功。与高脂对照组相比，实验组(dechns)小鼠体脂含量明显降低，说明几丁质纳米纤维对昆明小鼠具有一定的预防肥胖的作用(表4)。表3几丁质纳米纤维组合物预防组昆明小鼠器官重量表4几丁质纳米纤维组合物预防组昆明小鼠体脂重量实施例3(1)几丁质的来源及纯化：虾壳，虾壳几丁质的纯化方法：1)虾壳在1mol/lnaoh浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除虾壳中的蛋白质；2)1mol/lhcl浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除虾壳中的钙盐等成分；3)重复以上步骤2～3次，用蒸馏水洗涤至中性，接下来用0.5％的naclo2、冰醋酸调节ph5.0、70℃水浴进行漂白2h(要先预热一下实际达到2.5h)，间歇搅拌(如漂白不彻底，洗涤至中性后进行二次漂白)；4)漂白后的样品用蒸馏水洗涤至中性，而后用榨汁机粉碎，称重放入封口袋存放于4℃冰箱保存，2天后测定含水量。(2)氧化几丁质的制备：tempo-漆酶-o2氧化法制备氧化几丁质：配制0.1mph6.8磷酸缓冲液，以缓冲液配制50mmol/ltempo溶液，称取干重1g虾壳几丁质加入100mltempo溶液，在30℃水浴环境中进行氧化，每隔24h分批添加漆酶，总添加漆酶酶活约500u，总氧化时间为4d。氧化结束后，tempo溶液回收(勿稀释)，氧化几丁质用蒸馏水清洗至电导率接近蒸馏水，留下水不溶物于4℃冰箱保存，24h后测定含水量，作为tempo-漆酶氧化的几丁质湿样待用。(3)几丁质纳米纤维组合物：取干重氧化几丁质1g，几丁质的脱乙酰度(氨基含量)为0.12，羧基含量为0.662mmol/g，加入蒸馏水，均质、超声成功制备出含几丁质纳米纤维0.3％的组合物。(4)将昆明小鼠分成三组，空白对照组(blank)：饲喂普通饲料，0.9％生理盐水灌胃；高脂对照组(control)：饲喂高脂饲料，0.9％生理盐水灌胃；实验组(tochns)：饲喂高脂饲料，几丁质纳米纤维分散液灌胃，剂量为20mg/kg·d。过程中均选用昆明小鼠，spf级，单一性别，雄性，体重18～20g，由湖北省实验动物中心提供，实验周期为30天。用本发明所得的几丁质纳米纤维组合物灌胃的昆明小鼠，对其部分生化指标进行检测。(5)体重增量及体脂含量的检测：对小鼠体重的影响，空白对照组(blank)与高脂对照组(control)体重在第一周发生变化，且有显著性差异，第六天，blank组小鼠体重增重15.37％，control组小鼠体重增重10.33％，说明在喂食高脂饲料的情况下，衣康酸延缓了小鼠体重的增加。此外，实验组(tochns)的小鼠体重增重为2.09％，喂食几丁质纳米纤维，小鼠的体重增长率显著降低。经过18天的喂养，小鼠空白对照组体重和高脂对照组体重的增长率分别为40.48％、32.63％，而几丁质纳米纤维组的增长率为31.11％(表5)，说明长期的几丁质纳米纤维喂养，小鼠适应了饮食环境，且剂量为20mg/kg·d的几丁质纳米纤维有一定的延缓小鼠体重增长的作用。高脂对照组(control)小鼠肾脏周边脂肪、睾丸周边脂肪和肠系周边脂肪含量比空白对照组(blank)高，说明喂食高脂饲料导致了小鼠的肥胖，肥胖模型建立成功。与高脂对照组相比，实验组(tochns)小鼠体脂含量明显降低，说明几丁质纳米纤维对昆明小鼠具有一定的预防肥胖的作用(表6)。表5几丁质纳米纤维组合物预防组昆明小鼠体重增量分组第2天第6天第10天第14天第18天blank3.67％15.37％27.88％35.65％40.48％control4.38％10.33％21.39％27.88％32.63％tochns2.09％2.94％12.76％23.65％31.11％表6几丁质纳米纤维组合物预防组昆明小鼠体脂重量实施例4(1)几丁质的来源及纯化：蝉蜕，蝉蜕几丁质的纯化方法：1)蝉蜕于1mol/lnaoh浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除蝉蜕中的蛋白质；2)1mol/lhcl浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除蝉蜕中的钙盐等成分；3)重复以上步骤2～3次，用蒸馏水洗涤至中性，接下来用0.5％的naclo2、冰醋酸调节ph5.0、70℃水浴进行漂白2h(要先预热一下实际达到2.5h)，间歇搅拌(如漂白不彻底，洗涤至中性后进行二次漂白)；4)漂白后的样品用蒸馏水洗涤至中性，而后用榨汁机粉碎，称重放入封口袋存放于4℃冰箱保存，2天后测定含水量。(2)氧化几丁质的制备：tempo-naclo-nabr氧化法制备氧化几丁质：向100ml蒸馏水(含0.016g，0.1mmoltempo、0.1g，1mmolnabr)中加入干重1g蝉蜕几丁质；加入一定量naclo溶液(干重1g几丁质加5～6mmol/gnaclo)开始氧化；室温下，使用ph滴定仪连续滴加0.5mnaoh溶液保持混合液ph为10；当体系不再消耗碱时，向混合液中滴加少量乙醇终止反应；向混合液中添加0.5mhcl溶液将ph调至7后，离心机10000r/min离心5min，倾倒去除上清液；重复用蒸馏水清洗，离心，倾倒上清液7-8次，留下水不溶物于4℃冰箱保存，24h后测定含水量，作为tempo-naclo-nabr体系氧化的几丁质湿样待用。(3)几丁质纳米纤维组合物：取干重化学氧化几丁质1g，几丁质的脱乙酰度(氨基含量)为0.09，羧基含量为0.685mmol/g，加入蒸馏水，均质、超声成功制备出含几丁质纳米纤维0.6％的组合物。(4)将昆明小鼠分成三组，空白对照组(blank)：饲喂普通饲料，0.9％生理盐水灌胃；高脂对照组(control)：饲喂高脂饲料，0.9％生理盐水灌胃；实验组(tochns)：饲喂高脂饲料，几丁质纳米纤维分散液灌胃，剂量为90mg/kg·d。过程中均选用昆明小鼠，spf级，单一性别，雄性，体重18～20g，由湖北省实验动物中心提供，实验周期为30天。用本发明所得的几丁质纳米纤维组合物灌胃的昆明小鼠，对其部分生化指标进行检测。(5)血脂含量的检测：与高脂对照组(control)小鼠相比，实验组(tochns)小鼠血浆tc(总胆固醇)和hdl(高密度脂蛋白)含量明显降低，说明几丁质纳米纤维对昆明小鼠具有一定的降低血脂的作用(表7)。表7几丁质纳米纤维组合物预防组昆明小鼠体脂重量grouptc(mmol/l)tg(mmol/l)hdl(mmol/l)hdl/tcldl(mmol/l)blank3.5621.3891.6650.46761.266control3.91021.2471.6580.42411.685tochns3.8011.3110.7020.18472.503实施例5(1)几丁质的来源及纯化：蟹壳(portunustrituberculatus)，产自中国南通，蟹壳几丁质的纯化方法：1)蟹壳剪成1cm2大小，1mol/lnaoh浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除蟹壳中的蛋白质；2)1mol/lhcl浸泡12h以上，而后用蒸馏水洗涤至中性，用以去除蟹壳中的钙盐等成分；3)重复以上步骤2～3次，用蒸馏水洗涤至中性，接下来用0.5％的naclo2、冰醋酸调节ph5.0、70℃水浴进行漂白2h(要先预热一下实际达到2.5h)，间歇搅拌(如漂白不彻底，洗涤至中性后进行二次漂白)；4)漂白后的样品用蒸馏水洗涤至中性，而后用榨汁机粉碎，称重放入封口袋存放于4℃冰箱保存，2天后测定含水量。(2)部分脱乙酰氨基几丁质的制备：采用浓碱热解脱乙酰基法制备部分脱乙酰基几丁质：将干重1g蟹壳几丁质浸泡于25ml35wt％naoh溶液中，90℃水浴，不断搅拌2h。反应结束后，用蒸馏水清洗部分脱乙酰几丁质至中性，留下水不溶物于4℃冰箱保存，24h后测定含水量，作为部分脱乙酰氨基几丁质湿样待用。(3)几丁质纳米纤维组合物：取干重部分脱乙酰基几丁质1g，几丁质的脱乙酰度(氨基含量)为0.18，加入蒸馏水，用葡萄糖酸调节组合物ph2.5，均质、超声成功制备出含几丁质纳米纤维0.8％的组合物。(4)将昆明小鼠分成三组，空白对照组(blank)：饲喂普通饲料，0.9％生理盐水灌胃；高脂对照组(control)：饲喂高脂饲料，ph2.5左右的葡萄糖酸溶液灌胃；实验组(dechns)：饲喂高脂饲料，醋酸分散几丁质纳米纤维分散液(ph2.5左右)灌胃，剂量为10mg/kg·d。过程中均选用昆明小鼠，spf级，单一性别，雄性，体重18～20g，由湖北省实验动物中心提供，实验周期为30天。用本发明所得的几丁质纳米纤维组合物灌胃的昆明小鼠，对其部分生化指标进行检测。(5)肝组织细胞检查：图1是高脂对照组小鼠肝组织切片照片，图上的箭头所指的是脂肪粒，即照片上的白点，脂肪粒的大小和数目可以衡量肝组织的脂肪化程度，从而判断小鼠是否肥胖。由图1可以看出，喂食高脂饲料的对照组小鼠的肝组织中含有众多的脂肪颗粒，这表明用高胆固醇和脂类饲料喂养成功形成了酯代谢紊乱动物模型，肥胖造模成功。图2是实验组小鼠肝组织切片照片。由图可以很直观地看出几丁质纳米纤维组小鼠肝组织与高脂对照组小鼠肝组织的差异，切片照片显示几丁质纳米纤维组小鼠的肝组织脂肪粒很少，表明几丁质纳米纤维能够有效阻止脂肪肝的形成，几丁质纳米纤维对小鼠的减肥作用明显，并且能够有效地预防脂肪肝的形成。当前第1页12