同轴静电纺丝制备ICA‑SF/PLCL纳米纤维膜的方法及作为GBR膜的应用与流程

本发明涉及一种ica-sf/plcl复合纳米纤维膜的制备，尤其涉及一种采用同轴静电纺丝技术制备ica-sf/plcl纳米纤维膜的方法；本发明同时还涉及该方法制备的ica-sf/plcl复合纳米纤维膜作为gbr膜的应用，属于复合材料技术领域和医药材料技术领域。

背景技术：

牙种植术目前已成为牙列缺损或缺失的首选修复方法；然而，由炎症（如肉芽组织）引起的骨缺损严重影响手术成功率。越来越多研究表明，引导骨再生（gbr）技术可有效恢复牙槽骨的高度和丰满度，其原理是：通过阻碍成纤维细胞和上皮细胞长入骨缺损区而发挥屏障功能，并使成骨细胞附着、增殖增加，促进骨再生。

目前市场应用于gbr的材料，包括生物不可降解的聚四氟乙烯，该材料需二次手术取出，增加感染和膜暴露几率。因此，越来越多学者致力于生物可降解膜。bio-gide®是一种临床常用的生物可降解膜，研究表明，其具有良好的生物相容性，低抗原性，足够的机械性能和适益的降解性。为更好的诱导骨再生，复合性gbr膜（膜材料与骨诱导物质如生长因子相结合）已成为目前研究的热点。

淫羊藿苷（icariin，ica，c33h40o15，分子量：676.67）是从中药总黄酮中提取的主要活性成分，其具有多种重要的生理活性，如促进成骨细胞的增殖和分化以治疗骨代谢疾病，及免疫调节和抗肿瘤活性。研究发现，ica可治疗绝经后妇女的骨量丧失，通过增加opn、bmp表达促进骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞，最终恢复骨强度。同时，ica明显抑制破骨细胞形成。因此认为，ica可以作为骨组织工程的成骨诱导剂。我们之前的研究发现，ica可以在体内外显著促进人牙周膜干细胞（hpdlscs）的增殖和成骨分化。

聚l-丙交酯(plla)，具有良好的生物相容性和可降解性，使其更适宜在药物控制释放及组织工程等方面中应用。

丝素（sf）是一种天然结构蛋白，具有良好的生物学特性，如良好的细胞粘附性，可控降解率，机械强度，渗透性和抗酶降解性。它已经广泛研究组织工程和控制药物输送系统。

同轴静电纺丝是制备纳米或亚微米纤维支架的简单、有效方法，其在组织工程和药物传递体系得到广泛应用。其具有高的表面积/体积比，可以促进细胞附着，实现药物卸载，并且达到持续和受控的药物局部释放。之前研究已证实，一些生物分子可成功包裹于纳米纤维中，保持生物活性，纤维直径可通过控制同轴静电纺丝过程参数来控制。

因此，本发明采用同轴静电纺丝技术拟制备一种ica-sf/plcl复合纳米纤维膜，并对膜的理化性能、降解、释药及体内和外体对骨再生的作用进行研究，以期成为能持续释放ica，促进骨再生功能的gbr膜。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种采用同轴静电纺丝技术制备ica-sf/plcl复合纳米纤维膜的方法；

本发明的另一目的是提供上述方法制备的ica-sf/plcl复合纳米纤维膜作为诱导骨再生膜（gbr）的应用。

一、ica-sf/plcl复合纳米纤维膜的制备

本发明ica-sf/plcl复合纳米纤维膜的制备，包括以下工艺步骤：

（1）再生丝素蛋白的制备：将蚕茧浸于na2co3溶液中煮沸脱胶，并用蒸馏水洗涤除去丝胶，干燥后在75~85℃下完全溶解于cacl2/ch3ch2oh/h2o的三元溶剂体系中，然后于蒸馏水中室温下透析3~5d，过滤，冷冻干燥，获得再生丝素蛋白。

所述na2co3溶液的质量分数为0.2~0.5%；煮沸脱胶2次，每次0.5~1h；

所述cacl2/ch3ch2oh/h2o三元溶剂体系中，cacl2/ch3ch2oh/h2o的摩尔比为1/2/8。

（2）壳层纺丝液的制备：将上述所得再生丝素蛋白与plcl以1:2.3~1:2.5的质量比溶于六氟异丙醇中，且使再生丝素蛋白与plcl的总质量百分数为5~8%，常温磁力搅拌5~6h，获得壳层纺丝液。plcl的mw在1,000,000以上。

（3）芯层纺丝液的配制：将ica配制成浓度10^-5μmol/l的水溶液作为芯层纺丝液；

（4）同轴静电纺丝制备ica-sf/plcl复合纳米纤维膜：将配制好的芯层纺丝液、壳层纺丝液分别装入注射器中，连接同轴电纺双喷头，并与高压静电发生装置相连接；控制同轴电纺喷头与接收板间电压为12~15kv，距离为12~15cm，芯层纺丝液、壳层纺丝溶液推进速度分别为0.1ml/h和1.0ml/h，在温度25±2℃，相对湿度50±6%的环境下进行电纺，获得电纺丝膜；再使电纺丝膜与戊二醛水溶液于密闭环境下交联反应45~50h，真空干燥，得ica-sf/plcl纳米纤维膜样品。

戊二醛溶液的质量百分数为25%。电纺丝膜的大小12mm×15mm，厚0.3~0.4mm时，戊二醛的用量为10ml。

二、ica-sf/plcl纳米纤维膜表征

1、扫描电镜(sem)

将干燥保存备用的样本(3×3mm)，真空喷金处理60s，应用jsm-4800型扫描电镜(jeol,tokyo,japan)于10kv电压条件下观察。应用imagej图像处理软件(nationalinstitutesofhealth,md,usa)随机选取纤维（n≧100），计算其平均直径，并绘制纤维直径分布图。

ica-sf/plcl纳米维膜sem图像及纤维直径分布图如图2显示，见纤维表面形貌光滑连续，纤维直径均一形成三维立体网状结构，无串珠样结构形成；纤维平均直径为451.57±80.33nm，分布范围为200~700nm，与天然细胞外基质结构相似，且纳米级直径纤维具有高的比表面积，可为细胞的粘附、生长提供理想的微环境，同时纳米级纤维可携载更多药物。

2、透射电镜(tem)

在纺丝过程中，用碳膜喷涂的铜网在电场中小心接取一定量的纤维丝，真空干燥至有机溶剂充分挥发（约需7d）后，在100kv电压条件下，应用feitecnaif3型透射电镜（fei,usa）观察纤维内部结构。

从ica-sf/plcl纳米维膜的透射电镜图（图3）可以看到，沿纤维长轴走向其内部形成明显的芯壳结构。该芯壳结构形成的机理为：在同轴电纺过程中，壳层与芯层纺丝液在喷口处汇合，由于汇合时间短，加上聚合物扩散系数低，因此，芯壳层溶液固化前不会混合。同时，在高压静电场力作用下，芯壳层溶液的复合液滴表面聚集大量电荷，在电场力的作用下拉伸形成具有芯壳结构的纳米纤维。其中，含原子数相对较多的ica在tem检测过程中由于吸收电子相对较多，因此在tem图像上显示为相对较暗的纤维芯层，相对应的，sf/plcl显示为纤维壳层，这暗示着中药单体ica被成功包裹于纤维内部，形成了有效的药物储库型缓释系统。

3、x射线衍射(xrd)测试

制备的ica-sf/plcl纳米纤维膜（15×15mm）采用d/max-2400型x射线多晶衍射仪（rigaku,tokyo,japan）对膜进行晶体结构的检测。测试条件设置为：扫描速度为6°/min，功率为40kv/150ma，扫描范围10~60°。

x射线衍射通过检测材料衍射峰出现的位置，分析材料内部分子或原子结构以确定材料的结构特征。以往的研究关于丝素蛋白和plcl构象表明，silkⅰ在x射线衍射测试中主要衍射峰接近12.2°、19.7°、24.7°和28.2°，plcl静电纺丝膜在23.6°附近出现明显的衍射峰。silkⅰ结构不稳定，构象规整性差；而silkii由于主要由结构稳定性较好的β折叠构成，其构象规整性相对较好，稳定性好。ica-sf/plcl纳米纤维膜的x射线衍射分析结果如图4所示，图像在17.2°左右出现新的衍射峰，而未检测到其他明显的衍射峰存在，说明芯层药物ica的加入，对材料分子结构未产生明显影响。电纺后的膜经2.5%的戊二醛交联，丝素蛋白晶体结构的α螺旋转变为稳定的β折叠，结晶度增强，材料性能稳定性增加。

4、接触角检测

纳米纤维膜（20×30mm）平整固定于亲水角测试仪，吸取30μl去离子水小心低至膜表面，5s后，拍照并测量水滴切线与膜表面间的夹角，作为样本接触角。需在膜表面5个不同测试点分别测量，计算其平均值及标准差。

材料的润湿性与细胞的粘附、增殖和迁移等行为密切相关。研究证实，纯plcl纤维膜的接触角为139.57°，其疏水性较强，表面不利于细胞的黏附、生长。而本研究的ica-sf/plcl载药纤维膜的接触角检测结果（图5）为125.72±4.93°，其亲水性较纯plcl纤维膜增加，因此，芯层药物的加入可以增加膜的亲水性，从而有利于细胞的黏附、生长。

5、拉伸强度测试

样本（10×50mm）两端宽10mm部分小心夹持于anscmt8102型电子万能力学试验机（hounsfield,uk）的夹具上，中间30mm作为测试区。检测前，需用精密游标卡尺测量样本平均厚度。以10n测试力、1mm/min测试速度进行样本的拉伸强度测试，并绘制相应的应力-应变曲线。

gbr膜需足够的机械强度以抵抗周围软组织压力，以维持有效的骨组织生长空间，避免缺损区塌陷，利于骨细胞的增殖分化。sf结构类似天然细胞外基质结构，为天然的细胞支架材料，但其力学性能较差；而plcl机械性能较好，将plcl与sf共混，可改善sf力学性能差的缺点。ica-sf/plcl纳米纤维膜力学性能检测结果（图6）显示，其拉伸强度为（5.54±0.46）mpa，力学性能良好，能满足临床gbr膜的强度要求。

6、体外释药行为检测

将一定量的ica-sf/plcl纳米纤维膜经紫外线正反面消毒各1h后，浸泡于30ml无菌pbs溶液，置于37℃、100rpm的恒温水浴振荡器震荡，分别于测试的1、2、3、4、5、10、15、20、25、30d的同一时间点，取5ml释放液，同时加入同体积的新鲜pbs溶液。从载药膜释放获得的ica的量，通过应用uv2600型紫外分光光度计（shimadzu,japan）在λmax=270nm处检测不同时间点收集的释放液的吸光度值计算得到，绘制药物的累积释放曲线。

药物缓释系统以稳定速率将药物释放于靶位点，可提供局部有效药物浓度，并避免全身药物副作用。ica-sf/plcl载药纤维膜体外释药结果如图7所示，从该药物累积释放曲线可以看出，整个药物释放过程呈现两个阶段：初期的药物快速释放阶段（最初的5d，药物累积释放率达47.54±0.06%）和之后的药物稳定缓慢释放阶段(最终药物累计释放率为82.09±1.86%)。发生这两个阶段的其原因为：在药物从材料释放的初期，靠近载药纤维表面的少量药物首先快速释放于周围介质，之后由于材料在介质中的逐渐降解，纤维表面形成一些微孔，使得芯层药物进一步以扩散的方式稳定、缓慢的释放出来，从而可延长药物从材料中释放的时间，降低释放速率，从而实现药物的缓释，达到发挥药物最大功效的目的。

7、体外降解性能

样本紫外线消毒，20ml无菌pbs（ph=7.4）为本研究的降解介质，置于37℃、100rpm的恒温振荡器连续震荡，分别于测试的0、1、2、4、6周的同一时间点随机取样，蒸馏水冲洗干净，干燥，用扫描电镜及电子万能力学试验机分别对ica-sf/plcl纳米纤维膜表面形貌及力学性能变化进行观察和检测。

理想的可植入材料的降解应与再生组织的生成同步发生。ica-sf/plcl载药纤维膜体外降解结果如图8所示。扫描电镜图片观察发现，降解开始前，膜纤维表面连续光滑，之后由于降解介质的冲刷作用及芯层药物的不断释放，纤维表面开始变得粗糙，出现明显的蚕蚀状空洞，但纤维膜整体结构尚存。同时，从每个时间点相对应的纤维膜的应力-应变曲线（图9）可以看出，随着降解现象的存在，ica-sf/plcl载药纤维膜中的部分纤维断裂，膜整体力学性能降低。说明该载药纤维膜具有生物可降解性。

三、体外实验

1、bmmscs的分离、培养与鉴定

从兰州大学医学实验中心购买3~4周龄雄性生理状况良好的sd大鼠，采用过量麻药（水合氯醛）处死，立即浸泡于盛有体积分数为75%酒精的容器中10min，置于无菌操作台的手术板。严格无菌条件下获得股骨，用含10%双抗的无菌pbs冲洗3~5遍，剪去骨骺端，5ml注射器吸取含1%双抗(gibco)、10%fbs的l-dmem(hyclone,usa)反复冲洗骨髓腔至骨质发白，加入一定量完全培养液，将冲出的骨髓吹打混匀成单细胞悬液，于5%co2、37°c恒温孵箱培养。24h后半量换液，之后每2~3天换液。细胞融合度达80%~90%时传代培养。取第3代细胞进行以下相关实验的研究。应用流式细胞仪（bdfacscanto，usa）检测细胞表面标记，进行细胞鉴定：取p3代生长状态良好的bmmscs，用0.25%胰酶充分消化细胞，1000rpm离心5min，用含1%bsa的pbs清洗细胞3~5次，细胞计数，依次加入单克隆抗体cd34、cd44、cd45和cd90。同时每管设立阴性对照。避光冰上孵育45min，用含1%bsa的pbs再次清洗细胞3~5次，清除未结合抗体，接着，用500μl含1%bsa的pbs将细胞重悬，流式细胞仪进行检测分析。

流式细胞仪检测结果如附图1所示，分离培养的p3代bmmscscd44，cd90阳性表达率较高，阳性率分别为94.9%和98.3%，而cd34，cd45阳性率很低，分别为0.1%和0.7%，综合以上数据，这些细胞是来自骨髓的bmmscs。

2、膜体外成骨性能检测

将制备的ica-sf/plcl纳米纤维膜按100g/l的比例浸泡于含10%胎牛血清的l-dmem培养基内，37℃、5%co2条件下连续浸提72h，离心过滤后获得浸提液。备用。

生长状态良好的p3代bmmscs以1.0×10⁴cells/ml的密度接种于细胞培养皿，加入10ml完全培养液，37℃、5%co2孵箱中孵育；24h后，实验组加入浸提液培养，对照组用普通完全培养液培养，每三天换液。用2%茜素红染液（genmedscientificsinc.,usa）进行钙结节检测。细胞培养14d后，4%多聚甲醛固定，37℃条件下，茜素红染色30min检测钙结节。

生长状态良好的p3代bmmscs胰酶消化后，按1×10⁴个/ml接种于3块96孔板上，37℃、5%co2孵箱中孵育24h后，弃去旧培养液。实验分为2组，每组设6个复孔，实验组加入浸提液，对照组加入普通完全培养液，每3天换液一次。分别于第3、7、14d取一块96孔板，弃培养液，pbs清洗3遍，每孔加入500μl1%的tritonx-100(ambion,bylifetechnologies)，37℃培养箱裂解1h，收集细胞裂解液，按碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京，中国）说明依次加入各试剂，酶联免疫检测仪（elx800,bio-tek,winooski,vt,usa）于520nm处测定各孔alp值，以均值进行统计分析（应用spss17.0软件进行统计学分析，数据以平均值±标准偏差表示。通过单因素方差分析（anova）评价各组间的统计学差异；p<0.05为差异有统计学意义。）。

3、纤维膜体外诱导骨向分化检测

茜素红染色及alp活性检测通常用来成骨分化标志物的检测。生长状态良好的p3代bmmscs经ica-sf/plcl载药纤维膜的浸提液培养14天后，茜素红染色后可观察到，细胞周围出现明显矿化结节，有橘红色区域呈现（图10a）。生长状态良好的p3代bmmscs经ica-sf/plcl载药纤维膜的浸提液分别培养3，7，14d后检测细胞内alp表达活性。发现第3，7，14d，实验组相比较于对照组，alp活性明显升高(p＜0.05)。且在浸提液作用下，3-7d时alp活性增长幅度最大（图10b）。

4、细胞在膜表面形态学观察

ica-sf/plcl纳米纤维膜（10×10mm）紫外线正反面消毒后，用含10%双抗的pbs冲洗3遍，置于无菌24孔板底部，备用。对数生长期的bmmscs经0.25%胰酶消化后，反复吹打成单细胞悬液进行细胞计数，以1×10⁴细胞/孔的密度接种于膜表面，并用消毒钢圈固定，滴加一定量的完全培养液，于37℃、5%co2条件下继续培养，48h全量更换培养液。

细胞接种培养5d后，弃出旧培养基，pbs洗涤3遍，用2.5％的戊二醛固定1h，接着再用pbs冲洗3遍，用已配制好的系列梯度浓度乙醇（30％，50％，70％，90％，95％和100％）进行细胞脱水，细胞脱水结束后进行冷冻干燥6h，喷金处理60s，用扫描电镜(s-3400n;jeol,tokyo,japan)观察细胞在膜表面的黏附情况。

扫描电镜（图11）图像显示，bmmscs接种于ica–sf/plcl载药纤维膜表面5d后，细胞在膜表面粘附、生长良好，细胞突起沿纤维走向广泛伸展，并相互融合。tian报道，细胞在材料表面的粘附随纤维直径的减小而增加（纤维在50nm至10mm范围内）。这种变化可归因于纤维的更大的表面，为细胞粘附提供更多的接触位点。

5、膜细胞毒性检测

采用体外四甲基偶氮唑盐（thiazolylbluetetrazoliumbromide，mtt）法进行ica-sf/plcl载药纤维膜的细胞毒性检测。具体的实验分组包括：实验组、对照组（无ica-sf/plcl载药纤维膜）、空白组（无细胞的培养液），每组均设有6个复孔。分别于接种培养后的1、3、5、7d各取一块24孔培养板，用移液枪每孔加入mtt液(sigma,usa)（质量浓度为5g/l）40μl，继续培养4h后，每孔再滴加dmso400μl，摇床震荡30min，使结晶完全溶解。移液枪按每孔100μl转移至96孔板，用elx800型酶联免疫检测仪(elx800,bio-tek,winooski,vt,usa)在490nm处检测吸光度值。

理想的载药膜应最大化药物治疗作用，同时毒副作用最小。mtt结果（图12）表明，bmmscs接种于ica–sf/plcl载药纤维膜表面培养1、3、5、7d后，实验组和对照组的od值都随时间推移呈增加趋势，说明在有膜和无膜条件下，细胞数量都随时间变化在增多。同时观察发现，各时间点实验组的od值均大于对照组，但差异无统计学意义（p＞0.05）。证实该载药纤维膜不具有细胞毒性，适宜细胞的生长。

四、体内实验

1、动物模型的制作和材料植入

27只健康成年雄性sd大鼠（3–4周龄,80–100g）随机分为三组：i）测试组（ica-sf/plcl纳米纤维膜覆盖骨缺陷区域，n=3）;ii）阴性对照组（sf/plcl膜覆盖骨缺陷区域，n=3）;iii）和空白对照组（骨缺陷区域无膜覆盖，n=3）。无菌手术过程如下：10％水合氯醛（0.35ml/100g体重）腹腔注射麻醉，待麻醉显效后，备皮，局部消毒，颅顶正中作一纵行约2mm切口，分层切开，充分暴露颅骨，在大量生理盐水冲洗冷却下，用打磨机慢速以颅骨正中矢状线为中线，作一直径为8mm的圆形全层骨缺损，勿损伤硬脑膜。分别植入上述三种材料，使其超出骨缺损范围约2mm，软组织复位并逐层严密缝合。生理盐水清洗手术区域，并局部涂布抗生素软膏。术后所有动物在温暖环境中苏醒后，转移至动物房进行术后护理。

2、μ-ct评估骨生成

分别于术后4、8、12周每组分别安乐处死3只动物，获得颅骨，小心剔除附着的软组织，4％多聚甲醛固定24h。应用quantumfx型μ-ct（perkinelmer，hopkinton，ma，usa）进行扫描，其工作条件为：调整电压为90kv、电流为200μa、视野72mm和扫描分辨率为4.5μm。使用μ-ct图像分析软件（skyscan，kontich，belgium）对图像三维重建后进行新骨体积和骨矿物质密度的测量。

为评价ica-sf/plcl纳米纤维膜体内促进成骨作用，本实验制备了大鼠颅骨直径为8mm的完全骨缺损。缺损区植入材料4、8、12周后，通过μ-ct评价新骨生成。实验期间，所有实验动物植入部位均无炎症或坏死。μ-ct三维重建图像（图13）显示，与对照相比，ica-sf/plcl纳米纤维膜组在术后4、8、12周显示更多的新骨生成。

进一步应用μ-ct图像分析软件进行新骨体积和密度的定量分析（图14a，b）。结果显示，术后4周，ica-sf/plcl纳米纤维膜组骨缺损区新骨形成统计结果为：新骨体积和密度分别为1.08±0.48mm³和1.04±0.46％。ica-sf/plcl纳米纤维膜组与sf/plcl组新骨生成量差异无统计学意义（p>0.05），无膜覆盖组几乎观察不到新骨形成。术后8周，所有组均有新骨形成，与sf/plcl组及无膜覆盖组比较，ica-sf/plcl纳米纤维膜组骨缺损愈合显着较快，新骨体积和密度分别为6.09±1.27mm³、6.43±0.17％。sf/plcl组与无膜覆盖组新骨生成体积差异无统计学意义（p>0.05）。术后12周，虽然所有组均显示有新骨生成，但在ica-sf/plcl纳米纤维膜组，新生骨已扩展覆盖大部分缺陷区域，新骨体积和密度分别为约15.95±3.58mm³和14.02±0.93％，显示最快和最多骨形成。而sf/plcl组和无膜覆盖组的新骨形成仅局限于缺损中心或在缺损边缘。因此，我们证实了从ica-sf/plcl纳米纤维膜释放的ica的具有体内成骨分化活性。

3、组织学检测

固定后的样本经脱钙复合液（甲酸12ml、盐酸8ml、甲醛5ml、蒸馏水75ml）脱钙、梯度酒精脱水后，常规石蜡包埋，切片，苏木精和伊红(nanjingjianchengbiotechnologyinstitute)染色，光镜（olympus，ix70，japan）下观察。使用imagej软件（nationalinstitutesofhealth，md，usa）定量分析新骨形成，并计算新骨面积与总缺损面积比。

术后4、8、12周样本进行组织学分析进一步表征新骨形成，并计算新骨面积与总缺损面积的比率（图13）。术后4周，ica-sf/plcl纳米纤维膜组和sf/plcl组均可观察到有新骨生成，但无膜覆盖组其骨缺损区被大量纤维结缔组织填充，几乎无新骨生成。术后8周，ica-sf/plcl纳米纤维膜组显示比sf/plcl组或无膜覆盖组更多的新骨形成。其中无膜覆盖组可观察到大量纤维结缔组织。术后12周，ica-sf/plcl纳米纤维膜组新骨面积显著高于其他组。sf/plcl组是与纤维脂肪组织混合的新骨填充骨缺陷，无膜覆盖组只有一些纤维结缔组织。

综上所述，我们利用同轴静电纺丝成功制备了ica-sf/plcl纳米纤维膜，骨促进生长因子ica可包裹于纤维中而无结构完整性或功能的变化。体外成骨诱导分化和体内应用于骨缺损实验表明，该载药膜可持续、有效地释放ica而显着促进骨生成，且无细胞毒性。因此，应用同轴电纺技术制备的ica-sf/plcl纳米纤维膜是一种有前景的gbr膜。

附图说明

图1为大鼠骨髓间充质干细胞表面标志物的表达。

图2为ica-sf/plcl载药纤维膜sem图（a：×5000，b：×10000）和纤维直径分布图(c)。

图3为ica-sf/plcl载药纤维tem图（×50000）。

图4为ica-sf/plcl载药纤维膜xrd图。

图5为ica–sf/plcl载药纤维膜的亲水角。

图6为ica–sf/plcl纳米纤维膜应力-应变曲线。

图7为ica–sf/plcl纳米纤维膜体外药物释放曲线。

图8为ica–sf/plcl载药纤维膜表面形态（a~e）注：a：降解0周；b：降解1周；c：降解2周；d：降解4周；e：降解6周。

图9为ica–sf/plcl载药纤维膜拉伸强度(a~e)变化。注：a：降解0周；b：降解1周；c：降解2周；d：降解4周；e：降解6周。

图10为bmmscs培养于ica-sf/plcl纳米纤维膜浸提液后的茜素红染色结果（a）及alp分（b）。

图11为观察bmscs与ica-sf/plcl载药纤维膜复合后的细胞形态的sem（左：×1500；右：×3500）

图12为bmscs在ica-sf/plcl载药纤维膜上培养不同时间增殖情况。注：ica代表ica–sf/plcl载药纤维膜组。

图13为颅骨缺损的μ-ct图像。

图14为定量分析骨缺损区的新骨体积（a）j及密度百分比（b）。*与对照相比，骨形成明显增多（注：*p<0.05，**p<0.01。sf表示sf/plcl膜组；ica表示ica-sf/plcl纳米纤维膜组）。

图15为颅骨缺损的新骨形成的组织学分析。（a）颅骨缺损的he染色图像。比例尺=0.2mm。（b）定量分析颅骨缺损中新骨面积百分比。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明采用同轴静电纺丝技术制备ica-sf/plcl纳米纤维膜的方法作进一步的说明。

（1）再生丝素蛋白的制备：将蚕茧（浙江桐庐，中国）浸于质量分数0.5%的na2co3溶液中煮沸脱胶2次，每次1h；并用蒸馏水洗涤3此除去丝胶，50℃干燥12h后，再在80℃下完全溶解于cacl2/ch3ch2oh/h2o的三元溶剂体系中（cacl2/ch3ch2oh/h2o的摩尔比为1/2/8），然后于蒸馏水中室温下透析4d，过滤，冷冻干燥，获得再生丝素蛋白sf。

（2）壳层纺丝液的制备：将上述所得sf与plcl以1:2.3~1:2.5的质量比溶于六氟异丙醇中，且使sf与plcl（mw=1,000,000;naramedicaluniversity,japan）的总质量百分数为8%，常温磁力搅拌6h，获得壳层纺丝液；

（3）芯层纺丝液的配制：将ica配制成浓度10^-5μmol/l的水溶液作为芯层纺丝液；

（4）同轴静电纺丝制备ica-sf/plcl复合纳米纤维膜：将配制好的芯层纺丝液、壳层纺丝液分别装入10ml注射器中，连接同轴电纺双喷头，并与高压静电发生装置（dw-p503-1acdf；北京，中国）相连接；控制同轴电纺喷头与接收板间电压为15kv，距离为15cm，芯层纺丝液、壳层纺丝溶液推进速度分别为0.1ml/h和1.0ml/h，在温度25℃左右，相对湿度50±6%的环境下进行电纺，获得电纺丝膜；再使电纺丝膜用25%的戊二醛（国药化学试剂有限公司，中国）（电纺丝膜的大小12mm×15mm，厚0.3~0.4mm时，戊二醛的用量10ml）作为交联剂置于密闭玻璃干燥皿内交联48h，真空干燥，即得ica-sf/plcl纳米纤维膜样品。