一种京尼平交联脱细胞神经支架及其制备方法与应用与流程

本发明涉及神经支架材料技术领域，具体涉及一种京尼平交联脱细胞神经支架及其制备方法与应用。

背景技术：

周围神经损伤是临床常见的疾病，其对应的肢体运动，感觉功能完全丧失，肌肉萎缩给患者带来极大痛苦并造成社会负担。目前周围神经损伤的修复方法大多采用显微外科技术，即神经缝合术、自体神经移植术、神经植入术等。但是神经缝合及植入往往引起神经黏连和瘢痕形成，并且植入成功修复神经损伤的成功率较低，是神经外科学亟待解决的难题。

大量研究发现，在神经损伤修复中，在吻合处使用生物膜包绕，阻隔外部环境的影响，减少炎性细胞浸润可有效防止黏连和瘢痕形成，并充分发挥远端神经的趋化作用(mackinnon,s.e.anda.r.hudson,clinicalapplicationofperipheralnervetransplantation.plastreconstrsurg,1992.90(4):p.695-9.)。而与使用其他可降解生物材料相比，去细胞神经支架材料在修复神经缺损时表现出更好的生物相容性和生物力学性能，并且更易引导神经再生。

由于自身神经来源受限且异体异种神经具有免疫原性，因此，神经支架材料应去除神经细胞成分并最大程度保留细胞外基质成分(wang,q.,etal.,thepreparationandcomparisonofdecellularizednervescaffoldoftissueengineering.jbiomedmaterresa,2014.102(12):p.4301-8.)。目前证明对异种动物组织采用去细胞技术处理可获得无免疫原性神经支架。现在常用的神经去细胞方法包括化学法和物理法。但是物理法去细胞不彻底，化学法所用化学物质难以完全去除，残留对神经细胞附着再生有影响，因此，急需寻找新的方法改进神经支架的去细胞效果。

本申请人课题组在前期研究中利用一种新型的深海细菌酶——myroilysin处理wistar大鼠坐骨神经，获得了脱细胞神经支架。myroilysin酶具有特异性，除溶解弹力蛋白和膨胀胶原外，不会破坏神经组织中的其他结构与成分，与天然神经细胞外基质非常相似。组织学观察发现，myroilysin脱细胞神经支架具有彻底的脱细胞效果，所保留的神经基底膜结构均匀一致。但在后续的研究中发现，myroilysin酶对其储存的条件要高，而且在储存过程中酶的生物效价会发生变化，导致在制备脱细胞神经支架时需要对酶的加入量和处理时间等制备条件进行重新摸索。若制备条件选择不当，则会导致制备的脱细胞神经支架的强度降低，进而影响脱细胞神经支架材料的机械性能，使其难以满足植入部位的力学要求。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种京尼平交联脱细胞神经支架及其制备方法。

本发明的另一目的是提供上述京尼平交联脱细胞神经支架在作为周围神经损伤修复材料中的用途。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种京尼平交联脱细胞神经支架的制备方法，步骤如下：

将离体动物神经组织用tris-hcl溶液冲洗；将冲洗后的离体动物神经组织浸入myroilysin溶液进行孵育；孵育后加入含有京尼平的tris-hcl溶液进行交联；交联后再用tris-hcl溶液冲洗，即制备得到京尼平交联脱细胞神经支架。

上述制备方法中，冲洗用的tris-hcl溶液的浓度为50mm，ph9.0。

上述制备方法中，所述myroilysin溶液的浓度为0.2-0.8mg/ml；优选为0.4mg/ml。

上述制备方法中，孵育的温度为37℃，孵育的时间为12-48h；优选的，孵育的时间为24h。

上述制备方法中，含有京尼平的tris-hcl溶液中京尼平的浓度为0.2-0.3mg/ml；优选为0.25mg/ml。

上述制备方法中，含有京尼平的tris-hcl溶液中，tris-hcl溶液的浓度为50mm，ph7.2。

上述制备方法中，交联的温度为37℃，交联的时间为12h。

本发明的第二方面，提供上述制备方法制备得到的京尼平交联脱细胞神经支架。

本发明制备的京尼平交联脱细胞神经支架具有极低的免疫原性和良好的生物学特性，可有效降低周围神经黏连和瘢痕形成。而且，经京尼平交联后的脱细胞神经支架与原有的myroilysin脱细胞神经支架相比，受储存过程中myroilysin酶生物效价变化的影响较小，可以固定在优化后的制备条件下进行脱细胞神经支架的制备，无需反复的进行制备条件的摸索。

本发明的第三方面，提供上述的京尼平交联脱细胞神经支架在作为周围神经损伤修复材料中的应用。

体外实验表明，人牙髓干细胞在本发明的京尼平交联脱细胞神经支架上的生长、粘附、增殖状况良好。

将附着神经干细胞的京尼平交联脱细胞神经支架材料在坐骨神经横断动物模型中进行功能验证，观察移植后神经修复、黏连与瘢痕形成情况。结果表明，含神经干细胞的神经支架材料可以有效促进神经修复，缓解神经黏连。

上述技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明通过京尼平对myroilysin脱细胞神经支架进行交联，交联的后脱细胞神经支架克服了myroilysin酶的生物效价变化对神经支架制备条件的影响，经京尼平交联后的脱细胞神经支架的力学性能明显提高；而且交联后对脱细胞神经支架的生物相容性无显著影响。

(2)本发明制备的京尼平交联脱细胞神经支架的生物学特性良好、免疫原性低、能有效促进神经修复、减少神经黏连，为周围神经损伤的临床治疗提供了新的手段。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：去神经wistar大鼠坐骨神经及其结构；图中，a，b，c：周围神经组织支架制备；a取材，b为sondell化学法(左为天然神经，右为脱细胞神经)，c为京尼平交联myroilysin法(左为天然神经，右为脱细胞神经)；

d，e，f：周围神经组织he染色；d为天然神经，e为化学法处理的神经，f为京尼平交联myroilysin法处理的神经(放大倍数为200×)；

g，h，i：周围神经组织masson染色；g为天然神经，h为化学法处理的神经，i为京尼平交联myroilysin法处理的神经(放大倍数为200×)；

j，k，l:神经组织扫描电镜观察；j为天然神经，k为化学法处理的神经，l为京尼平交联myroilysin法处理的神经。

图2：体外细胞相容性试验结果。

图3：体内植入试验结果。

图4：牙髓前体细胞在脱细胞神经支架的生长情况；图中，a为京尼平交联myroilysin组，b为sondell化学组，c为明胶海绵组；(放大倍数为200×)。

图5：支架浸提液对牙髓前体细胞表达神经营养因子的影响试验的试验结果。

图6：坐骨神经横断兔移植含神经干细胞的神经支架后修复情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，myroilysin酶对其储存的条件要高，而且在储存过程中酶的生物效价会发生变化，导致在制备脱细胞神经支架时需要对酶的加入量和处理时间等制备条件进行重新摸索。基于此，本发明提出了一种京尼平交联脱细胞神经支架及其制备方法与应用。

在本申请的一种实施方案中，提供了一种京尼平交联脱细胞神经支架的制备方法，步骤如下：

先将动物神经使用50mmtris-hcl(ph9.0)将神经组织冲洗三遍；再0.4mg/mlmyroilysin溶液在37℃分别匀速震荡孵育24h；使用京尼平0.25mg/ml的tris-hcl(50mm，ph7.2)37℃交联12小时，50mmtris-hcl冲洗后储存于4℃。

需要说明的是，为优化人工神经的理化特性及生物性能，目前已有涉及神经支架材料的重组或改性的报道，可根据不同需要进行一定的化学或生物修饰，如添加交联剂、细胞活性成分等，然而这一材料性能的优化过程中不可避免的增加了材料降解产物生物相容性不佳的可能性。生物降解材料植入体内有可能会释放出大量对人体系统有影响的物质。因此，盲目的对支架材料进行性能优化会提高支架降解后生物相容性不良的风险，这也是目前制约生物支架材料应用的难点所在。

京尼平是传统中药杜仲的活性成分之一，是从京尼平苷中分离、提纯而获得。京尼平含有羟基、羧基等多个活性官能团，可以用于天然生物材料的交联。但是京尼平的交联效果受交联剂的浓度、ph值、温度、交联时间等多种因素的影响；而且，针对不同材料的氨基含量不同，需要对京尼平的交联浓度进行筛选，通过温度、ph值、交联时间、交联浓度等进行精确控制，避免过度交联造成材料力学性能和抗酶解性能的极端化。

本发明在试验过程中对京尼平的交联条件进行了优化，结果发现，使用京尼平0.25mg/ml的tris-hcl(50mm，ph7.2)37℃交联12小时，其交联效果最佳。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：京尼平交联脱细胞神经支架的制备。

(1)坐骨神经的获取

将成年wistar大鼠用3％戊巴比妥钠按1ml/kg耳缘静脉注射麻醉。将实验动物侧卧于手术台上固定，术区备皮、消毒、铺巾。在胭窝上方与臀大肌之间沿后肢外侧正中线剪开皮肤后，在该处肌间隙处分离，寻找并暴露坐骨神经上下端，前行分离坐骨神经体视显微镜下去除神经外膜上附着的结缔组织，修剪为长约2cm的坐骨神经节段。

(2)京尼平交联脱细胞神经支架的制备

将获得的成年wistar大鼠坐骨神经节段用含100u/ml青链霉素的50mmtris-hcl(ph9.0)缓冲液冲洗3次，将神经节段浸入0.4mg/ml的myriolysin(ph9.0，50mmtris-hcl缓冲液)中处理(37℃)，脱色摇床震荡(150转/分)24小时，tris-hcl缓冲液冲洗3次。使用京尼平0.25mg/ml的tris-hcl(50mm，ph7.2)37℃交联12小时，50mmtris-hcl冲洗后储存于4℃中备用。

对比例1：

将成年wistar大鼠坐骨神经节段(坐骨神经节段的制备方法同实施例1)置于灭菌蒸馏水中低渗处理7h；3％tritonx-100浸泡12h；4％脱氧胆酸钠中震荡(150转/分)24小时；重复上述步骤。灭菌pbs冲洗3次。所有步骤均在室温下完成。置于pbs(4℃，10mm，ph7.2)中备用。

对比例2：

将成年wistar大鼠坐骨神经节段(坐骨神经节段的制备方法同实施例1)不做任何处理，获取后立即进行固定。

试验例1：脱细胞神经支架的生物学特性研究

1.去神经鼠坐骨神经及其结构

1.1he染色

取实施例1、对比例1和对比例2处理的坐骨神经节段，10％甲醛固定12小时，梯度酒精脱水，二甲苯透明2小时，浸蜡2小时，石蜡包埋，切片(片厚5μm)，展片，烤片。

切片用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，蒸馏水浸洗3分钟，苏木素染色10分钟，自来水冲洗，1％盐酸酒精分化30秒，自来水冲洗20分钟，伊红染色2分钟，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。结果如图1所示。

1.2masson染色

(1)取实施例1、对比例1和对比例2处理的坐骨神经节段，10％甲醛固定12小时，梯度酒精脱水，二甲苯透明2小时，浸蜡2小时，石蜡包埋，切片(片厚5μm)，展片，烤片。

(2)脱蜡：石蜡切片在二甲苯中脱蜡2次，每次10-15分钟。

(3)梯度入水：95％，70％，30％乙醇各2分钟，蒸馏水2分钟。

(4)温热水漂洗：30-40℃温热水漂洗，每次45秒，共2次。分两缸温热水进行漂洗，直至玻片上除样本以外，其余部分均没有颗粒状小水珠为止。

(5)染色：

染色前先用蒸馏水润湿玻片1分钟；

核染液染色60秒左右，倒丢，冲洗液冲洗1分钟左右；

浆染液染色45秒左右，倒丢，冲洗液冲洗1分钟左右；

分色液分色8分钟；

复染液染色5分钟左右，倒丢，用无水乙醇冲洗干净；

(5)封片、镜检。

结果如图1所示。

1.3扫描电镜观察

将各组神经阶段用2.5％戊二醛固定2小时，用pbs漂洗2次，每次20分钟；1％锇酸固定2小时，pbs漂洗2次，每次20分钟；放入冻干机中进行升华干燥6小时后，将样本放入样品室，按照扫描电镜操作的流程说明，进行镜下观察。

结果如图1所示。

2.细胞毒性

2.1体外细胞相容性试验

将实施例1(京尼平交联myroilysin组)和对比例1(sondell组)制备的脱细胞神经按0.1g/ml比例分别置于α-mem培养液中，于37℃静置72小时制备浸提液。将制备好的牙髓前体细胞的细胞悬液接种于96孔板内，待细胞贴壁后加入每组浸提液，于37℃、5％co2孵箱中分别培养1，2，3，4，5，6，7天，然后向每孔加入10μlcck-8溶液，注意不要生成气包，以免气泡折光影响od值。将培养板在培养箱内孵育2小时。对照组(control组)：与实验组同步，细胞贴壁后加入含20％胎牛血清的α-mem。最后将96孔板周围每孔各加入500μlpbs以免靠近周边的孔蒸发较快影响实验结果。

检测：用酶联免疫检测仪450nm波长测定3组的吸光度。结果见图2。

由图2可以看出，牙髓前体细胞接种3天开始，京尼平交联myroilysin组增殖活性高于sondell组(p<0.05)，差异具有统计学意义(p<0.0001)；接种7天后，3组细胞增殖活性一致(p<0.05)。

2.2体内植入试验

实验动物选用成年新西兰大白兔6只，雌雄不限，适应饲养1周后，进行神经支架材料的植入手术。于兔脊柱两侧3×8cm区域备皮。脊柱中线两侧各取1点作为皮下植入点，两点均距中线约1.5cm，左侧植入点近头侧，右侧植入点近尾侧。1％戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg)，常规无菌条件下依次切开皮肤、筋膜、制备皮下囊，左侧植入长1cm，直径约1mm脱细胞神经支架材料(实施例1制备，作为京尼平交联myroilysin组)，右侧植入约2mm×2mm×2mm明胶海绵(作为明胶海绵组)。缝合后，送回原笼继续喂养，每天观察皮肤手术切口及动物反应变化。于手术后1周、4周时各取3只新西兰大白兔大鼠处死，切开皮肤仔细检查两侧样品及周围组织的情况，进一步制作组织切片，进行he染色，光学显微镜下观察。结果见图3。

图3中a和c分别为京尼平交联myroilysin组术后1周和术后4周的he染色图，由a可以看出：术后1周发现脱细胞神经支架结构仍然清晰完整，支架材料中有少量炎细胞浸润；神经支架与周围结缔组织交界处可见大量炎细胞浸润，以中性粒细胞为主；可见功能活跃的成纤维细胞及其周围粉染的新生胶原；血管内皮细胞生长，血管内皮细胞形成连续的富含红细胞的血管。

由c可以看出：术后4周可见脱细胞神经支架与周围组织界限不明显，炎性细胞已明显减少；成纤维细胞减少，周围可见大量胶原；支架材料中可见沿其排列一致的纤维细胞。

图3中b和d分别为明胶海绵组术后1周和术后4周的he染色图，由b可以看出：术后1周，明胶海绵及其周围结缔组织有大量炎细胞浸润。

由d可以看出，术后4周，明胶海绵已降解，炎性细胞明显减少，结缔组织中可见较多纤维细胞。

2.3牙髓前体细胞在脱细胞神经支架的生长

2.3.1接种及培养

取一皿生长良好的第三代牙髓前体细胞，弃去细胞培养皿中旧培养液，吸取2-3mlpbs洗涤2次，加0.25％胰酶消化牙髓前体细胞制成单细胞悬液，并调整细胞浓度至106个/ml，用移液器将细胞分别均匀接种于实施例1和对比例1制备的脱细胞神经支架和明胶海绵上(96孔板)，37℃、5％co2孵箱中静置1小时，在含20％胎牛血清的α-mem培养液培养4天。

2.3.2edu标记

(1)用α-mem细胞培养液稀释edu溶液(1000:1)，配制成50μmedu培养液。

(2)向各培养孔中加入100μl50μmedu培养液，孵育2小时，弃培养液。

(3)pbs清洗细胞1-2次，每次5分钟。

2.3.3细胞固定

(1)4％多聚甲醛室温固定30分钟，弃固定液。

(2)加入50μl2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟，弃甘氨酸溶液。

(3)加入100μlpbs，脱色摇床清洗5分钟，弃pbs。

(4)加入100μl0.5％tritonx-100，脱色摇床孵育10分钟；pbs清洗1次，5分钟。

2.3.4apollo染色

(1)加入100μl的apollo染色反应液，脱色摇床孵育(避光、室温)30分钟，弃染色反应液。

(2)加入100μl0.5％tritonx-100，脱色摇床清洗2-3次，每次10分钟，弃渗透剂。

(3)每孔每次加入100μl甲醇，清洗1-2次，每次5分钟；pbs清洗1次，每次5分钟。

2.3.5dna染色

(1)配制hoechst33342反应液，避光保存。

(2)加入100μlhoechst33342反应液，脱色摇床孵育(避光、室温)30分钟，弃反应液。

(3)每孔每次加入100μlpbs清洗1-3次。

(4)4℃、避光保存，待检测(不应超过3天)。

2.3.6激光扫描共聚焦显微镜下观察，采集并分析图像。

牙髓前体细胞在脱细胞神经支架的生长情况如图4所示。

2.4支架浸提液对牙髓前体细胞表达神经营养因子的影响

2.4.1接种及培养

分别将实施例1(京尼平交联myroilysin组)和对比例1(sondell组)制备的脱细胞神经按0.1g/ml比例置于α-mem培养液中，于37℃静置72h制备浸提液。将制备好的牙髓干细胞的细胞悬液(10⁴/ml)接种于96孔板内，待细胞贴壁后加入每组浸提液，于37℃、5％co2孵箱中培养4天。对照组仅接种细胞，不添加神经移植物浸提液。

2.4.2totalrna提取

(1)pbs洗涤细胞后，向细胞培养瓶中加入2.5ml的rnaisoplus，水平放置片刻，吹打细胞。将上述混有细胞的裂解液转移至离心管，反复吹吸直至其无明显沉淀。

(2)向上述离心管中加入0.5ml氯仿，剧烈震荡15秒，待溶液无分相现象后，室温静置5分钟。

(3)4℃下12000g离心15分钟。

(4)从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中，加入等体积异丙醇，充分混匀，静置10分钟。

(5)4℃下12000g离心10分钟，试管底部出现沉淀，弃上清，倒置ep管控干水分。

(6)加入75％的乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，4℃下12000g离心5分钟。

(7)弃去上清，控干乙醇，加入20μldepc水，轻轻吹打沉淀，待沉淀溶解置于-80℃保存，作为totalrna待用。

(8)rna定量：吸取lμlrna样品，加depc水至100μl，depc水为空白对照。紫外分光光度计测定总rna的浓度和od260/od280。od比值在1.8-2.2间的总rna可用于后期rt-pcr。

2.4.3反转录反应

(1)基因组dna的除去反应

反应体系：5×gdnaeraserbuffer2.0μl，gdnaeraser1.0μl，totalrna(不超过1μg)，加rnasefreedh2o至10μl。

按上述反应体系配液后42℃孵育2分钟或者室温5分钟。

(2)反转录反应

反应体系：向上述反应液中加入rnasefreedh2o4.0μl和5×primescriptbuffer24.0μl，混合后再添加rtprimermix和primescriptrtenzymemixⅰ,轻轻混匀。

反转录程序设置为37℃,15分钟；85℃，5秒；4℃，5分钟。反转录所获得的cdna需长时间保存时，可保存于-20℃。

(3)rt-pcr反应

(1)pcr反应液配制(冰上操作)：extaqtm10.0μl,pcrforwardprimer(10μm)0.4μl,pcrreverseprimer(10μm)0.4μl,dna模板2.0μl,灭菌蒸馏水7.2μl。

(2)rt-pcr反应

预变性：95℃，30秒，20℃/秒，1cycle；

pcr反应：95℃，5秒，20℃/秒；60℃，20秒，20℃/秒，40cycles；

融解曲线分析：95℃，0秒，20℃/秒；65℃，15秒，20℃/秒；95℃，0秒，0.1℃/秒。

支架浸提液对牙髓前体细胞表达神经营养因子的影响试验的试验结果见图5。

由图5可以看出：京尼平交联myroilysin组gdnf表达明显低于sondell组和空白对照组(p<0.001),sondell组gdnf表达明显低于空白对照组(p<0.01)；myroilysin组bdnf和ngf表达明显低于空白对照组(p<0.001),sondell组与空白对照组bdnf和ngf表达无统计学差异。

实施例2：含神经干细胞神经支架修复周围神经损伤的动物实验

(1)模型建立

实验动物选用3月龄新西兰大白兔12只，雌雄不限，适应饲养1周后，进行神经支架复合物的植入手术。戊巴比妥钠麻醉后于新西兰大白兔手术区域备皮消毒。常规无菌条件下依次切开皮肤、筋膜，分离肌肉，暴露坐骨神经。

选取一侧植入长1cm，直径约1mm复合dpscs的脱细胞神经支架材料，缝合后，送回原笼继续喂养，每天观察皮肤手术切口及动物反应变化。180°自体神经及脱细胞神经支架材料分别作为对照组植入动物体内。于手术后30天、90天时各取3只新西兰大白兔大鼠处死，切开皮肤仔细检查两侧样品及周围组织的情况，进一步制作冰冻组织切片，进行免疫荧光染色，光学显微镜下观察。于90天各取2只新西兰大白兔戊巴比妥钠麻醉后测量神经传导速度。

(2)结果

结果如图6所示，图中，a，b，c，d分别表示：dpscs复合实施例1制备的脱细胞神经组、单纯实施例1制备的脱细胞神经、自体神经移植组和对照组的新西兰大白兔小腿复合神经肌肉动作电位；e，f分别表示：dpscs复合实施例1制备的脱细胞神经组,单纯实施例1制备的脱细胞神经及自体神经移植组的复合神经肌肉动作电位振幅和传导速度比较(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；n＝3).

结果表明：将牙髓前体细胞和实施例1制备的脱细胞异种神经支架复合物植入兔坐骨神经后，获得了良好的神经再生和运动功能，这再次证实了利用京尼平交联myroilysin去细胞方法，可获得一种有效改良细胞生长微环境，促进神经干细胞在体外定向分化，移植后能够促进受损神经纤维重塑的组织工程支架。

实施例3：京尼平交联脱细胞神经支架前后的力学性能测试

1.试验方法：

将交联前脱细胞神经支架组设为a组(与实施例1的区别在于：不用京尼平进行交联)，交联后脱细胞神经支架组设为b组(实施例1制备)，分别将两组样本从冷冻(-80℃)中取出，生理盐水浸泡40min后，将各组样本固定于冰冻卡具中部，5min后旋紧卡具以保证固定的神经已被冻硬，不会向各向滑动；而外露的神经仍为常温，不会影响拉伸实验过程中的力学测试结果。通过wintest力学测试软件将两卡具间的距离固定为8mm，即初始长度为8mm。以1mm/min的速度拉伸神经直至其断裂，应力、应变、位移、及载荷每秒取样10次。测试过程中使用生理盐水保持样本湿润。读出每个点的载荷及相应的位移。按以下公式计算每组神经的生物力学特性：韧度(＝载荷/位移(n/mm)；断裂功耗＝载荷-位移曲线中极限载荷点左侧曲线下的面积；极限应力＝极限载荷/面积(mpa)；弹性模量＝应力/应变(mpa)；极限应变＝极限载荷对应的位移/样本的初长度。

2.试验结果：

两组神经的生物力学测试结果如表1所示。

表1：两组神经的生物力学测试(n＝10，x±s)

交联后脱细胞神经支架极限载荷、韧度、弹性模量、极限应力、断裂功耗增加，仅弹性模量之间的差异有统计学意义(p<0.05)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。