一种治疗肝炎和/或肝纤维化的药物组合物及其制备方法与流程

文档序号:11203908
一种治疗肝炎和/或肝纤维化的药物组合物及其制备方法与流程

本发明涉及一种治疗肝炎和/或肝纤维化的药物组合物及其制备方式和用途。

技术背景

肝炎是指由于各种原因引起的肝细胞坏死,肝功能异常。肝炎类型有急性肝炎和慢性肝炎之分,急性肝炎和慢性肝炎主要区别在于病情是非。急性肝炎是指由于感染肝炎病毒引起肝脏病变,一般病程不超过6个月。慢性肝炎多是由急性乙肝,急性丙肝病程超过半年演变而成。另外,慢性肝炎还包括了那些不是病毒原因引起,但是临床表现为慢性肝炎患者,包括脂肪肝患者、药物性肝炎患者等。肝病患者普遍免疫功能低下,其最明显的表现就是体内的病毒难于完全清除,病情容易反复发作。部分急性肝炎患者在一定情况下还会转变成为慢性肝炎,急性肝炎患者预后大多良好,90%以上的患者在3个月内都可以痊愈,只有不到10%的人可转变为慢性迁延性肝炎或慢性活动性肝炎,仅有1%-2%的患者会演变为肝硬化或肝癌。

肝纤维化是指由多种致病因子所致肝内结缔组织异常增生,导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。它不是一个独立的疾病,许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化。我国是病毒性肝炎流行的高发区,慢性肝炎患者达到数千万,其中又有约1/10-1/3可以发展成为肝硬化。目前认为肝纤维化是可逆的,通过抗纤维化治疗可使肝纤维化程度明显减轻,早期肝硬化者肝脏假小叶消失。

目前国内治疗肝炎、肝纤维化主要采取下列措施:①去除病因、②细胞保护/抗氧化、③抗炎/免疫调节、④抑制肝星状细胞活化、⑤调节ECM合成和降解、⑥促进HSC凋亡、⑦刺激肝细胞再生。其治疗目的是促使基因正常调控,而多数治疗目前仍处于实验研究阶段,肝炎、肝纤维化的治疗仍需不断完善,目前疗效确切和不良反应少的抗纤维化药物很少。并且,慢性肝损伤是肝纤维化及肝硬化发展的必经阶段。研究发现通过有效治疗可逆转已经形成的损伤,所以寻求能够有效阻断肝损伤抑制肝纤维化形成的药物已经成为慢性肝病治疗中的关键问题。

在非专利文献:星点设计—响应面法优选七珠胶囊成型工艺(现代中药研究与实践2016年第30卷第5期)中公开了七珠胶囊组合物使用治疗肝炎的报道,但是经过试验验证,其效果不能满足实际临床的需求。



技术实现要素:

本发明的目的在于提供一种治疗肝炎和/或肝纤维化的中药有效部位组合物及其制备方法。

本发明提供了一种治疗肝炎和/或肝纤维化的药物组合物,它是由如下重量配比的原料药组成:楤木总皂苷0.02-0.10份、海棠总黄酮0.07-0.50份、叶下珠总多酚0.10-0.65份。

优选地,所述组合物在治疗急性肝炎时由如下重量配比的原料药组成:楤木总皂苷0.025-0.05份、海棠总黄酮0.10-0.42份、叶下珠总多酚0.16-0.64份。

进一步优选地,所述组合物在治疗急性肝炎时由如下重量配比的原料药组成:楤木总皂苷0.025份、海棠总黄酮0.10份、叶下珠总多酚为0.32份。

优选地,所述组合物在治疗慢性肝炎和/或肝纤维化时由如下重量配比的原料药组成:楤木总皂苷0.04--0.08份、海棠总黄酮0.075-0.30份、叶下珠总多酚0.11-0.30份。

进一步优选地,所述组合物在治疗慢性肝炎和/或肝纤维化时由如下重量配比的原料药组成:楤木总皂苷0.08份、海棠总黄酮0.30份、叶下珠总多酚为0.22份。

其中,所述楤木总皂苷、海棠总黄酮、叶下珠总多酚是分别用太白楤木、湖北海棠、叶下珠为原材料,采用水或有机溶剂提取制备得到。

其中,所述原料药制备方式包括如下步骤:

取太白楤木,加乙醇回流提取,提取液减压回收乙醇,浓缩,离心,提取液过大孔树脂吸附,水洗除杂,然后乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得;

取叶下珠,加乙醇回流提取,提取液减压回收乙醇,浓缩,离心,取上清液过大孔树脂柱,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得;

取湖北海棠,加乙醇回流提取,提取液减压回收乙醇,浓缩,离心,取上清液过大孔树脂柱,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得。

优选地,楤木总皂苷提取方式是用太白楤木重量的3-15倍的浓度为10%-95%的乙醇回流提取3次,每次1小时,提取浓缩指标为含生药量0.1-0.5g/ml;优选地,乙醇用量为太白楤木重量的13倍的浓度为70%的乙醇,生药含量为0.25g/ml;

叶下珠总多酚提取方式是用叶下珠重量的3-12倍的浓度为10%-95%的乙醇回流提取3次,每次1小时,提取浓缩指标为含生药量0.1-0.5g/ml;优选地,乙醇用量分别是叶下珠重量的10倍、8倍、8倍的浓度为50%的乙醇,生药含量为0.2g/ml;

海棠总黄酮提取方式是用湖北海棠重量的3-12倍的浓度为10%-95%的乙醇回流提取2次,每次150min,提取浓缩指标为含生药量0.1-0.5g/ml;优选地,乙醇用量为湖北海棠重量的8倍的浓度为70%的乙醇,生药含量为0.15g/ml;

优选地,步骤b中,减压回收乙醇条件是70~75℃,-0.07~-0.08MPa。

优选地,步骤b中,分离精制楤木总皂苷、叶下珠总多酚、海棠总黄酮的大孔吸附树脂型号分别为:HPD100型大孔吸附树脂、HPD100型大孔吸附树脂、HPD100型大孔吸附树脂。

其中,楤木总皂苷、叶下珠总多酚、海棠总黄酮的洗脱方式是分别用与提取方式浓度相同的乙醇溶液进行洗脱,洗脱速度分别为:1BV/h、2BV/h、1BV/h。

其中,该药物组合物是由所述原料药为活性成分,加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

其中,所述辅料是乳糖,糖粉,微晶纤维素,糊精,淀粉,聚乙二醇中的一种或多种。

其中,所述剂型为口服制剂。

其中,所述口服制剂为片剂,颗粒剂,胶囊剂,散剂,丸剂,口服液,糖浆剂,煎膏剂。

本发明提供了所述药物组合物的制备方法,它包括如下步骤:

a)称取各重量配比的原料药;

b)加入辅料,干燥,即得。

本发明提供了所述药物组合物在制备具有解毒祛湿、疏肝化瘀功效的药物中的用途。

本发明提供了所述药物组合物在制备治疗肝炎和/或肝纤维化的药物中的用途。

其中,所述肝炎为急性肝炎和/或慢性肝炎。

本发明药物组合物治疗肝炎、肝纤维化的效果非常优良,优于三种组分单独使用,也优于三种药物的组合使用,为临床治疗肝炎、肝纤维化提供了一种新的选择。

根据本发明的上述内容,按照本发明相关领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1各因素交互作用的响应曲面图

图2本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝脏指数的影响

图3本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤血清中ALT、AST的影响

图4本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝组织形态学变化的影响(HE染色,×200)

图5本发明对CCL4致慢性肝损伤大鼠肝组织形态学变化的影响(masson染色,×200)

图6本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝组织SOD,GSH-PX的影响

图7本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝组织MDA的影响

图8本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝组织TNF-α表达的影响(×200)

图9本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝组织NF-kB表达的影响(×200)

具体实施方式

实施例1本发明治疗急性肝炎的药物组合物的制备

1.原料:楤木总皂苷0.025g、海棠总黄酮0.1g、叶下珠总多酚0.32g。

2.原料制备方式:

楤木总皂苷:取太白楤木,加13倍量的浓度为70%的乙醇回流提取3次,每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,提取液过HPD100型大孔树脂吸附,去离子水水洗除杂,然后乙醇洗脱;收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得楤木总皂苷;

叶下珠总多酚:取叶下珠,加浓度为50%的乙醇回流提取3次(乙醇用量:10倍、8倍、8倍),每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔吸附树脂,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得叶下珠总多酚;

海棠总黄酮:取湖北海棠,加8倍量的浓度为70%乙醇,回流提取2次,每次150min,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔树脂柱,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得海棠总黄酮。

3.组合物制备方式:

a)称取各重量配比的原料药;

b)加入辅料(乳糖:糊精=4:1)、辅料用量为浸膏的2倍,用90%乙醇制粒,干燥,即得。

实施例2本发明治疗急性肝炎的药物组合物的制备

1.原料:楤木总皂苷0.05g、海棠总黄酮0.28g、叶下珠总多酚为0.19g。

2.原料制备方式:

楤木总皂苷:取太白楤木,加13倍量的浓度为70%的乙醇回流提取3次,每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,提取液过HPD100型大孔树脂吸附,去离子水水洗除杂,然后乙醇洗脱;收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得楤木总皂苷;

叶下珠总多酚:取叶下珠,加浓度为50%的乙醇回流提取三次(乙醇用量:10倍、8倍、8倍),每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔吸附树脂,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得叶下珠总多酚;

海棠总黄酮:取湖北海棠,加8倍量的浓度为70%乙醇,回流提取2次,每次150min,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔树脂柱,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得海棠总黄酮。

3.组合物制备方式:

a)称取各重量配比的原料药;

b)混匀,填入胶囊,即得。

实施例3本发明治疗急性肝炎的药物组合物的制备

1.原料:楤木总皂苷0.03g、海棠总黄酮0.35g、叶下珠总多酚为0.50g。

2.原料制备方式:

楤木总皂苷:取太白楤木,加13倍量的浓度为70%的乙醇回流提取三次,每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,提取液过HPD100型大孔树脂吸附,去离子水水洗除杂,然后乙醇洗脱;收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得楤木总皂苷;

叶下珠总多酚:取叶下珠,加浓度为50%的乙醇回流提取三次(乙醇用量:10倍、8倍、8倍),每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔吸附树脂,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得叶下珠总多酚;

海棠总黄酮:取湖北海棠,加8倍量的浓度为70%乙醇,回流提取2次,每次150min,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔树脂柱,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得海棠总黄酮。

3.组合物制备方式:

a)称取各重量配比的原料药;

b)加入1倍量淀粉、糊精,混合均匀,90乙醇制粒,压片,即得。

实施例4本发明治疗慢性肝炎、肝纤维化的药物组合物的制备

1.原料:楤木总皂苷0.08g、海棠总黄酮0.30g、叶下珠总多酚为0.25g。

2.原料制备方式:

楤木总皂苷:取太白楤木,加13倍量的浓度为70%的乙醇回流提取三次,每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,提取液过HPD100型大孔树脂吸附,去离子水水洗除杂,然后乙醇洗脱;收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得楤木总皂苷;

叶下珠总多酚:取叶下珠,加浓度为50%的乙醇回流提取三次(乙醇用量:10倍、8倍、8倍),每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔吸附树脂,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得叶下珠总多酚;

海棠总黄酮:取湖北海棠,加8倍量的浓度为70%乙醇,回流提取2次,每次150min,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔树脂柱,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得海棠总黄酮。

3.组合物制备方式:

a)称取各重量配比的原料药;

b)加入1倍量乳糖,混合均匀,包装,即得。

实施例5本发明治疗慢性肝炎、肝纤维化的药物组合物的制备

1.原料:楤木总皂苷0.05g、海棠总黄酮0.20g、叶下珠总多酚为0.11g。

2.原料制备方式:

楤木总皂苷:取太白楤木,加13倍量的浓度为70%的乙醇回流提取三次,每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,提取液过HPD100型大孔树脂吸附,去离子水水洗除杂,然后乙醇洗脱;收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得楤木总皂苷;

叶下珠总多酚:取叶下珠,加浓度为50%的乙醇回流提取三次(乙醇用量:10倍、8倍、8倍),每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔吸附树脂,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得叶下珠总多酚;

海棠总黄酮:取湖北海棠,加8倍量的浓度为70%乙醇,回流提取2次,每次150min,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔树脂柱,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得海棠总黄酮。

3.组合物制备方式:

a)称取各重量配比的原料药;

b)加入1倍量乳糖,微晶纤维素,混合均匀,90%乙醇制粒,压片,即得。

实施例6本发明治疗慢性肝炎、肝纤维化的药物组合物的制备

1.原料:楤木总皂苷0.06g、海棠总黄酮0.25g、叶下珠总多酚为0.15g。

2.原料制备方式:

楤木总皂苷:取太白楤木,加13倍量的浓度为70%的乙醇回流提取三次,每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,提取液过HPD100型大孔树脂吸附,去离子水水洗除杂,然后乙醇洗脱;收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得楤木总皂苷;

叶下珠总多酚:取叶下珠,加浓度为50%的乙醇回流提取三次(乙醇用量:10倍、8倍、8倍),每次1小时,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔吸附树脂,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得叶下珠总多酚;

海棠总黄酮:取湖北海棠,加8倍量的浓度为70%乙醇,回流提取2次,每次150min,提取液减压回收乙醇(70~75℃,-0.07~-0.08MPa),浓缩,离心,取上清液过HPD100型大孔树脂柱,先以水洗脱,再用乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液,回收乙醇、浓缩、干燥,粉碎成细粉,即得海棠总黄酮。

3.组合物制备方式:

a)称取各重量配比的原料药;

b)加入1倍量乳糖、微晶纤维素,混合均匀,制粒,填入胶囊,即得。以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

实验例1本发明抗CCL4致小鼠急性肝损伤

实验以太白楤木总皂苷、湖北海棠总黄酮、叶下珠总多酚三个有效部位为自变量,进行配伍组方,以AST,ALT的综合评分为因变量,将各数据输入软件中,从图上的较佳区域直接读出本发明最佳配比。

1材料与仪器

1.1实验动物

健康清洁级昆明种小鼠136只,雌雄各半,体重20±2g,由西安交通大学动物实验中心提供,动物生产许可证号:SCXK(陕)2012-003。

1.2实验药物

太白楤木药材购于陕西眉县药材公司,经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为五加科(Araliaceae)植物太白楤木(Aralia taibaiensis)的根皮;湖北海棠药材购自湖北神农架药材公司,经陕西中医药大学王继涛老师鉴定为苹果属(Malus Mill.)湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.)Rehd)的干燥叶;叶下珠药材购自陕西昊源中药饮片有限公司;联苯双酯滴丸(浙江医药股份有限公司新昌制药厂,批号:20140818);四氯化碳(天津天士力化学试剂有限公司,批号:20140228);橄榄油(广州花之王化工有限公司,批号:20140528),所用其它试剂均为分析纯。

1.3试剂与仪器

ALT试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20140909),AST试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20140923),BAC蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20140914);Centrifuge 5417R台式冷冻高速离心机(Germany Eppendorf),JJ-2组织捣碎匀浆机(金坛市富华仪器有限公司),HHS-4A电热恒温水浴锅(沪越实验仪器厂),JA2003型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司),BIO-RAD Model680酶标仪(北京伯乐生命科学发展有限公司),JJQ-P2016J生物组织切片机(武汉俊杰电子有限公司),ZEISS显微镜(德国蔡司公司,型号ImagerA1)。

2方法与结果

2.1试验方法

2.1.1实验分组

取昆明种小鼠136只,按照体重均衡随机分组(每组小鼠体重进行方差分析,P>0.5):每组8只,总计17组。将本发明各组分作为考察因子,以太白楤木总皂苷,湖北海棠总黄酮,叶下珠总多酚为因素,每个因素各取3个水平,水平分别在前期实验筛选结果确定的有效剂量范围内均匀选取。

2.1.2造模方法

取洁净级昆明种小鼠136只,雌雄各半,体重20±2g,按体重随机分为17组,每组8只,雌雄分笼饲养,适应性饲养5d。各药物组均按表2所设计剂量进行灌胃给药,联苯双酯组按125mg/kg灌胃给药,空白对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水,连续灌胃给药7天,1次/d。末次给药后2h,除空白对照组外,其余各组将0.1%的CCl4橄榄油溶液按0.1ml/10g进行腹腔注射,建立小鼠急性肝损伤模型,空白对照组腹腔注射等量生理盐水。

2.1.3取材

末次给药后禁食不禁水。16h后摘眼球取血,3500rmp/min离心10min,上清液-20℃保存备用。

2.1.4血清生化指标ALT、AST的测定

均按试剂盒说明书具体步骤进行,用酶标仪测定结果。

2.2配比

三个因素:楤木总皂苷(X1)、海棠总黄酮(X2)、叶下珠总多酚(X3),每个因素在单因素的基础上设三个水平,用代码值-1、0、1来表示。因素水平见表1,实验安排和结果见表2。

表1设计因素与水平表

表2试验设计与结果表

注:1,4,12,14,16号为重复实验

AST、ALT为负向指标,d=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)

通过表2可以看出,实验组2、6~10改善AST水平、ALT水平效果优良,同时,实验组6号为最优组。本发明优选用量配比为:楤木总皂苷:0.025-0.050g/kg、海棠总黄酮:0.10-0.42g/kg、叶下珠总多酚:0.16-0.64g/kg;进一步优选地,最优用量配比为:楤木总皂苷:海棠总黄酮:叶下珠总多酚0.025g/kg:0.10g/kg:0.32g/kg。

2.3本发明药物与单味有效部位及合提药物的比较试验

取洁净级昆明种小鼠48只,雌雄各半,体重20±2g,按体重随机分为8组,每组6只,雌雄分笼饲养,适应性饲养5d。各药物组按照表3设计进行灌胃给药,联苯双酯组按125mg/kg灌胃给药,空白对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水,连续灌胃给药7天,1次/d。末次给药后2h,除空白对照组外,其余各组将0.1%的CCl4橄榄油溶液按0.1ml/10g进行腹腔注射,建立小鼠急性肝损伤模型,空白对照组腹腔注射等量生理盐水。末次给药后禁食不禁水。16h后摘眼球取血,3500rmp/min离心10min,上清液-20℃保存备用。分离肝组织,按试剂盒说明书具体步骤进行,用酶标仪测定血清及肝组织中ALT、AST含量。实验结果见表3、表4。

表3本发明各组分对CCL4致小鼠急性肝损伤血清中ALT、AST的影响

注:与空白对照组相比##P<0.01;与模型组相比*P<0.05,**P<0.01;与本发明配伍组相比ΔP<0.05,ΔΔP<0.01

表4本发明各组分对CCL4致小鼠急性肝损伤肝组织中ALT、AST的影响

注:①与空白对照组相比##P<0.01;与模型组相比*P<0.05,**P<0.01;与本发明配伍组相比ΔP<0.05,ΔΔP<0.01

②三药合提组:为三种原料药加水煎煮提取得到的浸膏粉,最佳配伍组的剂量与三药合提组的剂量均相当于原药材9g。

结果表明,三药配伍后,均可显著降低小鼠血清及肝组织中ALT、AST含量。本发明配伍组与单个有效部位组相比,均具有显著性差异(P<0.01),与三药合提组相比,具有显著性差异(P<0.01)。本发明配伍后,疗效优于三组组分单独使用的疗效,优于三药合提组药物使用疗效,表明活性组分之间发挥了协同增效的作用。

实验例2本发明各组分对慢性肝损伤大鼠保护作用

1.材料和仪器

1.1实验动物

健康清洁级Wistar大鼠90只,雌雄各半,体重200±20g,由西安交通大学动物实验中心提供,动物生产许可证号:SCXK(陕)2012-003。

1.2实验药物

太白楤木药材购于陕西眉县药材公司,经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为五加科(Araliaceae)植物太白楤木(Aralia taibaiensis)的根皮;湖北海棠药材购自湖北神农架药材公司,经陕西中医药大学王继涛老师鉴定为苹果属(Malus Mill.)湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.)Rehd)的干燥叶;叶下珠药材购自陕西昊源中药饮片有限公司;联苯双酯滴丸(浙江医药股份有限公司新昌制药厂,批号:20140818);四氯化碳(天津天士力化学试剂有限公司,批号:20140228);橄榄油(广州花之王化工有限公司,批号:20140528),所用其它试剂均为分析纯。

1.3试剂与仪器

ALT试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20140909),AST试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20140923),BAC蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20140914);Centrifuge 5417R台式冷冻高速离心机(Germany Eppendorf),JJ-2组织捣碎匀浆机(金坛市富华仪器有限公司),HHS-4A电热恒温水浴锅(沪越实验仪器厂),JA2003型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司),BIO-RAD Model680酶标仪(北京伯乐生命科学发展有限公司),JJQ-P2016J生物组织切片机(武汉俊杰电子有限公司),ZEISS显微镜(德国蔡司公司,型号ImagerA1)。

2.实验

2.1实验分组与给药方法

取Wistar大鼠90只,每组10只,按照体重均衡随机分组:按照正交试验设计因素水平表设计的9组不同的配伍比例。以湖北海棠总黄酮、太白楤木总皂苷和叶下珠总多酚三种有效部位为影响因素,结合药材、提取物有效部位含量、各组分有效剂量筛选结果及临床用量确定动物实验中各提取物的3个给药剂量,采用表5实验表进行试验设计。药物配比的因素水平见表6,根据表5组成不同剂量配比的1-9号本发明有效部位进行配伍。

表5因素水平表

表6试验表

2.2造模

取Wistar大鼠90只,随机分为9组,每组10只,置温度(25±1)℃,相对湿度(40%~65%)的实验室,适应环境7d后试验。从造模第一日起,空白对照组和模型组给予等体积蒸馏水;阳性对照组(联苯双酯组)在造模同时给予联苯双酯滴丸水溶液治疗;药物组在造模同时给予太白楤木醇提物水溶液和湖北海棠醇提物水溶液治疗,1次/d,连续8周。末次注射CCl416h后,戊巴比妥5mg/100g腹腔注射麻醉大鼠,蛙板固定大鼠,腹主动脉取血,然后猝死动物,检测各项指标。

2.3观察指标

2.3.1一般情况

每周两次观察动物活动、状态、毛发、进食、大便等一般情况。

2.3.2加权法综合评价本发明组分配伍试验

腹主动脉取血,分离血清,分别测定大鼠谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶AST)、通过加权评分值综合评价本发明不同组分配伍对大鼠慢性肝损伤肝脏保护作用。

2.4统计学分析

采用SPSS11.0软件进行统计学处理,组间比较采用方差分析。P<0.05有统计学意义。

3结果

3.1实验期间大鼠的一般状况

空白对照组大鼠生长状况良好,饮食规律,毛色光泽,CCl4模型组大鼠在实验第5d开始出现精神不振、被毛蓬松、背弓,对早期死亡大鼠进行解剖,清楚可见腹腔有大量透明状积液,并可见肝脏呈花斑样改变,晚期死亡大鼠解剖可见,肝脏表面有白色膜覆盖,质地坚硬,肛周周围潮湿,体形瘦弱。阳性对照组和药物组大鼠的状况较模型组有改善。

3.试验结果

按照设计表条件进行试验,分别测定大鼠谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、脂质过氧化SOD、MDA和GSH-Px活性。采用综合评价中的TOPSIS法,对试验结果数据进行分析,综合评分结果见表7。

表7试验结果

SOD、GSH-Px为正向指标,d=(Ymin-Yi)/(Ymax-Ymin)

注:AST、ALT、MDA为负向指标,d=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)

3.3结果分析

通过表7可以看出,实验组4、8、9试验效果优良,同时,实验组9为最优实验组。本发明根据实验结果得出的最佳用量范围为:楤木总皂苷:0.04-0.08g/kg,海棠总黄酮:0.075-0.30g/kg,叶下珠总多酚:0.11-0.22g/kg。进一步优选地,最佳配比用量为:楤木总皂苷:海棠总黄酮:叶下珠总多酚0.08g/kg:0.30g/kg:0.22g/kg。

实验例3本发明对CCl4致大鼠慢性肝损伤药效实验及保肝机制初步研究

1.材料和仪器

1.1实验动物

健康清洁级Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重200±20g,由西安交通大学动物实验中心提供,动物生产许可证号:SCXK(陕)2012-003。

1.2实验药物

太白楤木药材购于陕西眉县药材公司,经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为五加科(Araliaceae)植物太白楤木(Aralia taibaiensis)的根皮;湖北海棠药材购自湖北神农架药材公司,经陕西中医药大学王继涛老师鉴定为苹果属(Malus Mill.)湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.)Rehd)的干燥叶;叶下珠药材购自陕西昊源中药饮片有限公司;联苯双酯滴丸(浙江医药股份有限公司新昌制药厂,批号:20140818);四氯化碳(天津天士力化学试剂有限公司,批号:20140228);橄榄油(广州花之王化工有限公司,批号:20140528),所用其它试剂均为分析纯。

1.3试剂与仪器

ALT试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20150723),AST试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20150519),BAC蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20150514),超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20150518),丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20150404),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号:20150908),兔抗TNF-α、NF-KB多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司,批号:20150628),免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司,批号:20150618)。

Centrifuge 5417R台式冷冻高速离心机(Germany Eppendorf),JJ-2组织捣碎匀浆机(金坛市富华仪器有限公司),HHS-4A电热恒温水浴锅(沪越实验仪器厂),JA2003型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司),BIO-RAD Model680酶标仪(北京伯乐生命科学发展有限公司),JJQ-P2016J生物组织切片机(武汉俊杰电子有限公司),ZEISS显微镜(德国蔡司公司,型号ImagerA1)。

2方法与结果

2.1试验方法

2.1.1分组及给药

取Wistar大鼠60只,随机分为6组,每组10只,置温度(25±1)℃,相对湿度(40%~65%)的实验室,适应环境7d后试验。用本发明最佳配伍结果,即楤木总皂苷0.08g/kg:海棠总黄酮0.30g/kg:叶下珠总多酚0.22g/kg组合为给药中剂量(0.6g/kg)组,中剂量×2为高剂量(1.2g/kg)组,中剂量×0.5为低剂量(0.3g/kg)组。除空白组外,其余各组大鼠给予腹腔注射40%CCl4橄榄油溶液(容积为3ml·kg-1,2次/w,周一、周五各一次,连续8周。从造模第一日起,空白对照组和模型组给予等体积蒸馏水;阳性对照组(联苯双酯组)在造模同时给予联苯双酯滴丸水溶液治疗;治疗组在造模同时给予本发明水溶液治疗,1次/d,连续8周。

2.1.2取材

末次注射CCl416h后,戊巴比妥5mg/100g腹腔注射麻醉大鼠,蛙板固定大鼠,腹主动脉取血,收集血液,3000r·min-1离心10min,取上清液,分离血清,-20℃冰箱保存;同时立即剖取肝脏,取0.5g肝组织,剪碎,放于玻璃匀浆器中,加预冷的9倍体积的0.9%生理盐水,2500rmp离心10min,上清液-20℃保存备用。剩余肝组织浸泡于10%甲醛溶液中固定。

2.2观察指标

2.2.1一般情况

每周观察大鼠活动、状态、毛发、进食、大便及体重变化等一般情况;

2.2.2肝脏指数的检测

实验结束后,称量体质量后麻醉取肝脏并称重肝质量,计算肝脏系数=(肝质量/体质量);

2.2.3血清及肝组织匀浆中ALT、AST含量检测

腹主动脉取血,分离血清,置-20℃保存,酶标仪检测血清及肝组织匀浆中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量。

2.2.4肝脏组织HE染色

取肝组织置于10%福尔马林溶液中固定24h,乙醇梯度脱水,石蜡包埋,切片,进行苏木素-伊红HE染色。光镜下观察肝组织病理学变化。

2.2.5肝组织Masson染色

操作严格按照Masson染色试剂盒说明书要求进行。

2.2.6血清抗氧化指标的检测

ELISA法检测血清中SOD、GSH-Px、MDA活性的变化,操作严格按照试剂盒说明书要求进行。

2.2.7肝组织炎症因子TNF-α、NF-kB表达的检测

取肝组织置于10%福尔马林溶液中固定24h,乙醇梯度脱水,石蜡包埋,切片,脱蜡至水后,后续操作按照TNF-α、NF-kB一抗、二抗及DAB染色试剂盒说明书要求严格进行。

2.2.8统计学分析

采用SPSS11.0软件进行统计学处理,组间比较采用方差分析。P<0.05有统计学意义。

2.3结果

2.3.1本发明对CCl4致慢性损伤大鼠肝脏指数的影响

实验前各组大鼠体重基本一致。使用CCl4造模后,大鼠体重增长速度与空白对照组比较显著减慢(P<0.01),本发明药物组均不同程度降低肝脏指数,与模型组相比均有显著差异(P<0.01),结果见表8,图2。

表8本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝脏指数的影响

注:与空白对照组相比##P<0.01;与模型组相比*P<0.05,**P<0.01

2.3.2本发明对CCL4致大慢性肝损伤鼠血清转氨酶活性的影响

模型组大鼠血清中ALT、AST含量与空白对照组比较明显升高,差异有显著性(P<0.01)。与模型组相比,阳性组和本发明高、中、低剂量组均能抑制ALT、AST水平的升高,结果见表9,图3。

表9本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤血清中ALT、AST的影响(IU/L)

注:与空白对照组相比##P<0.01;与模型组相比*P<0.05,**P<0.01

2.3.3肝组织形态学变化

2.3.3.1肉眼观察

空白对照组大鼠肝脏表面光滑,柔软,颜色深红。模型组大鼠肝脏表面粗糙,被有大量结节,肝质地较硬且脆,边缘锐利,触之有油腻感。与模型组比较,本发明治疗组大鼠的肝脏略显肿大,质地柔软,表面较光滑。

2.3.3.2HE染色下肝组织形态学变化

HE染色显示,空白对照组大鼠肝脏小叶结构完整,肝细胞绕中央静脉放射状排列,未发生纤维增生及炎细胞浸润;模型对照组大鼠肝小叶结构破坏,中央静脉粗大,肝脏胶原纤维条索分割、围绕肝小叶排列,形成假小叶,肝细胞坏死严重、脂肪变性,大量炎细胞浸润;与模型组进行比较,本发明治疗组对破坏的大鼠肝组织有不同程度改善,其中中剂量治疗组和高剂量治疗组的肝组织破坏显著减轻,纤维增生减少,炎细胞浸润减少。结果见图4。

2.3.3.3Masson染色下肝组织形态学变化

Masson染色结果显示,空白对照组未见肝组织纤维化。模型组门管区纤维组织增生明显,纤维间隔形成,正常肝小叶结构被破坏。与模型组比较,在本发明不同浓度给药组,肝组织纤维化程度随给药浓度增加明显减轻,在高剂量组仍可在门管区见到少量纤维间隔,肝小叶结构基本恢复正常。结果见图5。

2.3.4本发明对CCL4致慢性肝损伤大鼠肝组织脂质过氧化损伤的影响

与空白对照组相比,模型组肝组织匀浆中SOD和GSH-Px活性降低显著(P<0.01),MDA含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,本发明低、中、高剂量组及阳性组均可不同程度地提高肝组织中SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量(P<0.01),结果见表10,图6-7。

表10本发明对CCL4致大鼠慢性肝损伤肝组织脂质过氧化损伤的影响

注:与空白对照组相比##P<0.01;与模型组相比*P<0.05,**P<0.01

2.3.5本发明对CCL4致慢性肝损伤大鼠肝组织炎症因子表达的影响

2.3.5.1本发明对CCL4致慢性肝损伤大鼠肝组织TNF-a表达的影响

免疫组化结果显示:空白对照组大鼠肝组织中TNF-α几乎没有表达。模型组中,肝细胞胞浆及胞核中均可见到大量棕黄色颗粒,TNF-α高表达。与模型组相比,本发明治疗组TNF-α表达均有不同程度的减少,其中中、高剂量组最为显著(P<0.01)。结果见表11,图8。

表11本发明对CCL4诱导的大鼠慢性肝损伤肝TNF-α因子表达的影响

注:与空白对照组相比##P<0.01;与模型组相比*P<0.05,**P<0.01

2.3.5.2本发明对CCL4致慢性肝损伤大鼠肝组织NF-kB表达的影响

与空白对照组比较,模型组大鼠肝脏NF-kB阳性细胞集中分布在中央静脉,肝细胞坏死灶周围细胞的细胞浆液中,其NF-kB表达的强度显著大于空白对照组。与模型组相比较,本发明药物组和阳性组的NF-kB阳性表达均有减少,其中本发明中剂量和高剂量组较为显著(P<0.01)。结果见表12,图9。

表12本发明对CCL4诱导的大鼠慢性肝损伤肝NF-kB因子表达的影响

注:与空白对照组相比##P<0.01;与模型组相比*P<0.05,**P<0.01

结果表明,本发明能降低CCL4引起的血清中AST、ALT升高;HE,Masson染色观察,本发明治疗组对大鼠肝组织纤维增生、炎细胞浸润及肝小叶结构破坏有不同程度改善,中、高剂量组尤为明显;能够增强肝组织匀浆中SOD、GSH-Px活性,降低MDA含量。TNF-a是由单核细胞及巨噬细胞分泌的17K D非糖蛋白,在生命科学领域被认为是细胞因子网络的“祸首因子”。TNF-a的生物学活性很广泛,对免疫反映、炎症反应、机体代谢等均有重要调节的任务及介导作用,TNF-a参与CCL4的致病化学性肝损伤作用主要原因是激活了中性粒细胞,进而促进其吞噬、氧爆发等效应,活化NF—kB。一般情况下,细胞的NF-kB是处在未活化状态,当炎细胞受到如TNF-a等细胞外信号的刺激时,能够导致N F-kB的活化,NF-kB激活后,可增强TN F-a基因转录,使TNF-aB产生及释放增多并且炎性细胞被激活,进一步激活了NF-kB,形成了一个正反馈调节,炎症反应不断放大。免疫组化检测TNF-α及NF-kB在模型组肝组织阳性表达显著,本发明中、高剂量其阳性表达明显减少,统计学分析,其差异均有显著统计学意义(P<0.01),治疗组效果更加显著。

本发明对CCL4诱导的大鼠慢性肝损伤具有明显保护作用。其可能机制为:提高机体的抗氧化能力,降低细胞自由基损伤,抑制炎症因子表达,减小炎症细胞的浸润。进一步证实了优选出的本发明组分配伍的有效性。

综上所述,本发明药物组合物治疗肝炎、肝纤维化的效果非常优良,优于三种组分单独使用,也优于三种药物的组合使用,为临床治疗肝炎、肝纤维化提供了一种新的选择。

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