CpG复合佐剂在MUC1融合蛋白抗肿瘤中的用途的制作方法

技术领域：

本发明提供一种cpg复合佐剂在muc1融合蛋白抗肿瘤中的用途，涉及cpg-odn2006与mf59联合作为免疫佐剂在重组muc1-mbp融合蛋白抗肿瘤中的医用用途，属于免疫学治疗领域。

背景技术：
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cpg-odn是人工合成的含有非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cpg)的寡脱氧核苷酸(odn)，可模拟细菌dna刺激b细胞、树突状细胞活化，间接激活nk和t细胞等多种免疫效应细胞，增强抗原提呈细胞的加工和提呈，诱导th1型免疫应答，产生较强的体液免疫和细胞免疫应答，可用于肿瘤治疗、过敏性疾病、感染性疾病、免疫功能低下者。目前公认的对人免疫刺激活性最强是cpg-odn2006。国外已经对cpg-odn2006进行了多项临床试验，包括对黑色素瘤、肺小细胞癌、皮肤t细胞淋巴瘤，证实是高效低毒的新型免疫佐剂。国内沃森生物将cpg-odn作为乙型肝炎疫苗佐剂，目前正在进行临床iii期实验，而国内目前尚未发现用于肿瘤疫苗佐剂的报道。

mf59是将span85(0.5％，v/v),tween80(0.5％，v/v)，角鲨烯(4.3％，v/v)混和乳化制得的水包油乳剂，1997年作为流感疫苗佐剂在欧盟获批上市。因其诱导体液免疫反应的效果更好，常被用于人类流感疫苗。但近年，已有研究者通过向疫苗制剂中添加病原相关分子模式(pamp)的模拟物来改变mf59的免疫特点，并证实mf59联合其它佐剂确实可以通过某些机制向利于肿瘤免疫的th1方向发展。这为mf59在其他领域存在潜在应用价值提供了一定的理论基础。

muc1是mucins粘蛋白家族的重要成员，存在于正常腺管上皮细胞及其来源的肿瘤细胞表面，由多肽核芯(核芯肽)和侧枝糖链构成。由于正常组织muc1与肿瘤组织不同，使其成为免疫细胞攻击的靶点。经反复动物实验以及部分人体实验研究证实，muc1是肿瘤疫苗研制的有效靶点。目前以muc1为靶点研制的肿瘤疫苗，49个处于临床试验阶段，其中，tg4010和tecemotide也已经完成iii期临床并取得良好的结果。本研究组长期以来以muc1为靶点，首次通过基因工程技术将muc1基因与大肠杆菌麦芽糖结合蛋白偶联制成重组muc1-mbp融合蛋白。研究发现重组muc1-mbp融合蛋白单独免疫小鼠，很难产生强烈的细胞免疫应答；而与cpg-odn2006联合免疫，既能产生特异性体液免疫应答，又能产生的细胞免疫应答；尤其是当cpg-odn2006与mf59联合后，能更加显著协同增强重组muc1-mbp融合蛋白诱导的特异性细胞免疫应答，发挥更加显著的抗肿瘤作用。

技术实现要素：
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本发明提供了一种cpg复合佐剂在muc1融合蛋白抗肿瘤中的用途，用于人类治疗或预防肿瘤。

所述的cpg复合佐剂为cpg-odn与mf59联合复合佐剂，其中，cpg-odn2006，序列是：5'-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3'，也称cpg-odn7909，是一种非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为核心的序列。mf59是将span85(0.5％，v/v),tween80(0.5％，v/v)，角鲨烯(4.3％，v/v)混和乳化制得的水包油乳剂。

本发明涉及cpg-odn2006与mf59以及muc1-mbp联合适用于下述医疗用途：

1.cpg-odn2006与mf59作为重组muc1-mbp融合蛋白佐剂，三者联合作为治疗性疫苗，治疗癌症包括表达muc1的腺癌、肝癌、血液肿瘤等。

2.cpg-odn2006与mf59作为重组muc1-mbp融合蛋白佐剂，三者联合作为预防性疫苗，应用于各种表达muc1的各种癌症的预防，包括表达muc1的腺癌、肝癌、血液肿瘤等。

本发明所述的cpg-odn2006与mf59复合佐剂的制备工艺，包括以下步骤：

1、将span85、tween80、角鲨烯和10nm柠檬酸钠分别按照体积比0.5％、0.5％、4.3％和94.7％进行混合，用乳化机乳化10min，变成乳白色匀质状，制成mf59乳剂；

2、采用冷冻离心机离心，6000rpm离心5min不发生分层，即达到乳化标准.

3、经0.22μm滤膜过滤除菌，备用；

4、将cpg-odn2006按照2mg/ml溶于水中，与mf59乳剂按照1:2体积比进行混合制成复合佐剂。

通过研究实验表明，本发明cpg-odn2006与mf59与muc1-mbp融合蛋白不仅协同刺激诱导muc1特异性体液免疫应答，而且能显著协同诱导muc1特异性细胞免疫应答，并具有显著的抗肿瘤作用。因此，cpg-odn2006与mf59与muc1-mbp三者联用可作为癌症疫苗开发应用于临床免疫治疗和预防领域。

本发明的积极效果在于：以cpg-odn2006与mf59作为联合佐剂，利用它们的联合协同增强重组muc1-mbp诱导muc1特异性抗体应答和t细胞免疫应答，协同诱导显著地抑制肿瘤的效果，cpg-odn2006与mf59联合重组muc1-mbp融合蛋白可作为疫苗用于表达muc1的肿瘤包括腺癌、血液肿瘤等治疗或预防的用途；cpg-odn2006与mf59联合可制成重组muc1-mbp疫苗的佐剂。

附图说明

图1为重组muc-mbp的sds-page分析电泳图；

图2为不同佐剂联合对muc1-mbp诱导的荷瘤小鼠生存期的影响曲线图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

cpg-odn2006与mf59复合佐剂的制备工艺，包括以下步骤：

将0.5mlspan85、0.5mltween80和4.3ml角鲨烯加入10nm柠檬酸钠94.7ml中，用乳化机乳化10min，变成乳白色匀质状，制成mf59乳剂。采用冷冻离心机离心，6000rpm离心5min不发生分层，即达到乳化标准。经0.22μm滤膜过滤除菌，备用。将cpg-odn2006按照2mg/ml溶于水中，与mf59乳剂按照1:2体积比进行混合制成复合佐剂。

实施例2

cpg-odn2006与mf59复合佐剂联合muc1-mbp融合蛋白疫苗的制备工艺，包括以下步骤：

重组muc1-mbp融合蛋白(纯度98％，内度素小于5eu/mg)参见重组人muc1-mbp融合蛋白抗肿瘤疫苗及生产工艺，(专利号zl03111045.2)制备；按照实施例1中的方法制备cpg-odn2006与mf59复合佐剂；将muc1-mbp融合蛋白与复合佐剂按照1：3体积的比例混合制成疫苗。

实验例1

1.材料

重组muc1-mbp融合蛋白(纯度98％，内度素小于5eu/mg)参见重组人muc1-mbp融合蛋白抗肿瘤疫苗及生产工艺，(专利号zl03111045.2)制备，丙烯酰胺和tris购自sigma公司，亚甲丙烯酰胺购自上海生物工程公司，bsa购自碧云天生物科技有限公司。

2.方法

2.1重组muc1-mbp纯度分析

将重组muc1-mbp融合蛋白10μl加入10％分离胶和4％浓缩胶sds-page凝胶上样孔中，并采用低分子量蛋白marker作为对照，在10-20ma下进行电泳，结束后采用考马斯亮蓝进行颜色分析。

2.2重组muc1-mbp含量分析

将重组muc1-mbp融合蛋白稀释成6个稀释度，按照bca试剂盒说明书进行操作，配制蛋白标准品，采用酶标仪检测吸光光度值a490nm。

3.结果

3.1重组muc1-mbp的鉴定

将本研究组制备的重组muc-mbp通过sds-page分析，如图1所示，在62kd处可见一条较纯的条带，通过分析结果表明，电泳纯度为100％.结果与预期一致，可用于后续的实验研究。

3.2重组muc1-mbp的含量分析

经bca试剂盒分析结果表明1.15mg/ml,与实际值1.2mg/ml相比较,结果基本一致，占实测值95.8％,在质量控制90-110％的范围内，可用于后续的实验。

实验例2

1.材料

cpg-odn2006由上海生工合成(lot：9405454467)；30个氨基酸muc1多肽(纯度95％)由上海紫域生物，bcg购自成都生物制品所，抗igg1-hrp、抗igg2c-hrp和抗igg-hrp购自southernbiotech。span85和tween80购自genview，角鲨烯购自tci。

6～8周龄，18～20gc57bl/690只小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司。

2.方法

2.1小鼠免疫

将小鼠称重，随机分为9组，每组10只鼠，雌雄各半，分别为生理盐水组，cpg-odn2006(0.25mg/kg)，cpg-odn2006(0.25mg/kg)+mf59组，muc1-mbp(0.25mg/kg)组，cpg-odn2006(0.25mg/kg)+muc1-mbp(0.25mg/kg)组，cpg-odn2006(0.5mg/kg)+mf59+muc1-mbp(0.25mg/kg)组，cpg-odn2006(0.25mg/kg)+al(oh)3+muc1-mbp(0.25mg/kg),cpg-odn2006(0.25mg/kg)+bcg(15mg/kg)+muc1-mbp(0.25mg/kg)组。皮下多点注射，每2周免疫一次，共免疫2次。

2.2elisa检测muc1特异抗体及亚类

如上所述，小鼠第2次免疫后4-7天安乐死处死小鼠，眼球采血，常温静置4小时后，4℃离心，3000rpm，10min，分离小鼠血清，通过间接elisa分析抗muc1抗体的效价。简而言之，采用0.5μg/wellmuc1多肽包被96孔板,4℃过夜，次日，通过3％bsa封闭液封闭1h，采用0.5‰tween-20的pbs(pbs-t)液洗涤后，加入小鼠不同稀释度的血清，均设双复孔，37℃孵育0.5-1.5h，弃去孔内液体，pbs-t洗液5-7次后，加入hrp标记山羊抗小鼠igg或igg2c或igg1(按说明书稀释)，37℃孵育0.5-1.5h，弃去孔内液体，pbs-t洗液5-7次后加入底物opd显色5-10min，加2mol/l硫酸溶液终止反应，采用酶标仪检测a490吸光光度值。

3.结果

为研究muc1-mbp疫苗诱导小鼠产生特异性体液免疫应答情况，在小鼠末次免疫后眼球采血，分离血清，采用间接elisa检测muc1特异性抗体及亚类。如表1结果所示，生理盐水对照组、cpg-odn2006以及cpg-odn2006+mf59各组均未见muc1特异性抗体产生；muc1-mbp单独免疫组小鼠产生较微量的抗muc1igg,igg2c以及igg1抗体；cpg-odn2006联合muc1-mbp组，muc1特异性抗体igg,igg2c以及igg1均明显较单独muc1-mbp组增高；mf59联合muc1-mbp组，muc1特异性抗体igg和igg1效价较muc1-mbp单独用略有增加，但igg2c未见明显增加。当cpg-odn2006、mf59以及muc1-mbp联合后，三者联用比muc1-mbp与cpg-odn2006二者联用更加显著提高了muc1特异性抗体igg,igg2c以及igg1的效价，而且以igg2c增加的幅度最高；当muc1-mbp联合cpg-odn2006与al(oh)3或bcg三者联用，与二者联用比较均未见muc1特异性抗体igg,igg2c以及igg1有明显提高。上述结果提示cpg-odn2006与muc1-mbp二者联用能协同促进muc1特异性抗体应答的产生，cpg-odn2006和mf-59与muc1-mbp三者联用更加显著协同诱导muc1特异性体液免疫应答，诱导产生较高水平的igg2c，间接提示cpg-odn2006或cpg-odn2006联合mf59不仅促进muc1-mbp疫苗产生th2应答，同时也产生th1应答。而muc1-mbp与mf-59二者联用只能产生较低水平的抗体应答；cpg-odn2006与muc1-mbp联合后再加入al(oh)3或bcg，muc1特异性抗体应答并未见明显提升。

表1cpg-odn2006、mf59以及muc-mbp三者协同促进产生muc1特异性抗体igg、igg2c和igg1

4.结论

cpg-odn2006、mf-59与muc1-mbp三者联合比cpg-odn2006与muc1-mbp二者联合更加显著协同诱导muc1特异性体液免疫应答，诱导产生较高水平的igg2c，可作为优良的肿瘤疫苗开发利用。

实验例3

1.材料

小鼠淋巴细胞分层液购自索莱宝公司，il-2购自protech30个氨基酸muc1多肽(纯度95％)由上海紫域生物，胎牛血清购自biobio、imdm购自gibco，wst试剂购自promega，il-4以及ifn-γelesa试剂盒均购自于ebioscience公司。

2.方法

2.1muc1特异性淋巴细胞分泌细胞因子分析

如上所述，在第4次免疫后4-7天杀鼠，无菌取脾、研磨、细胞记数,制备脾细胞悬液，采用小鼠淋巴细胞分层液分离小鼠脾脏单个核细胞，用imdm调整细胞浓度至1×10⁷/ml，以100μl/well加入96孔板中。实验设3组，每组设3复孔，分别为阴性对照组、il-2单独刺激组(终浓度100u/ml)、muc1多肽刺激组(muc1多肽10μg/ml+il-2100u/ml)。37℃的co2培养箱3天，半量换液，继续培养5天后，吸取每孔细胞培养上清100μl用于细胞因子的检测。通过夹心elisa检测ifn-γ和il-4的分泌水平。按照ebioscience公司的elisa检测试剂盒说明书进行操作。简而言之，首先将包被抗体(抗ifn-γ和il-4的抗体)包被96孔酶标板，每个样本设双复孔，4℃过夜。采用pbs-0.05％tween-20洗板5次，加入封闭液封闭1h后，洗涤2次，加入标准品(ifn-γ：2000、1000、500、250、125、62.5、32.5、15.625pg/ml；il-4标准品配制：500、250、125、62.5、32.5、15.6、7.8、3.9pg/ml)和样品，100μl/孔，4℃过夜。洗涤5次后，加入检测抗体室温孵育1h，洗涤5次，加入酶标抗体avindin-hrp,室温孵育30min。洗7次，加tmb，室温15min。加硫酸终止后，采用酶标仪450nm波长测定吸光度值波长450nm。

3.结果

3.1cpg-odn与mf59以及muc1-mbp协同促进muc1特异性淋巴细胞分泌ifn-γ水平

为研究muc1-mbp疫苗诱导小鼠产生特异性细胞免疫应答情况，在小鼠第4次免疫后取脾，分离淋巴细胞，采用il-2加muc1多肽特异性刺激淋巴细胞5天后，取细胞培养上清，通过双抗体夹心elisa检测ifn-γ和il-4分泌水平。将体外muc1多肽联合il-2刺激所得的数值减去il-2单独刺激的数值即得到muc1特异性th1释放的细胞因子。如表2结果所示，cpg-odn2006组和cpg-2006+mf59组，均能产生较低水平的ifn-γ，cpg-odn2006联合muc1-mbp组，muc1特异性t细胞释放ifn-γ水平明显增高，在muc1-mbp联合cpg-odn2006联合基础上，加入mf59后，ifn-γ水平增高更加明显；加入al(oh)3后，ifn-γ水平略有下调，加入bcg后，ifn-γ水平也明显上升，但各鼠之间差异较大。同时，各组il-4的水平也不同程度增加。结果提示cpg-odn2006与muc1-mbp二者联合协同促进muc1特异性th1应答和th2应答，cpg-odn2006与mf59以及muc1-mbp三者联合协同刺激产生更高水平的muc1特异性th1应答。

表2各组小鼠免疫后muc1特异性淋巴细胞分泌细胞因子(n＝10，)

其中，a，b：p<0.05，与对照组比较；c，p<0.01,与cpg-2006组比较；d：p<0.01,与muc1-mbp组比较；e，f：p<0.01,与muc1-mbp+cpg-2006

4.结论

cpg-odn2006与mf59以及muc1-mbp三者具有显著的协同诱导产生产生muc1特异th1应答的作用，提示三者可作为良好的癌症疫苗开发利用。

实验例4

1.材料

g418，胎牛血清购自biobio、imdm购自gibco。

动物c57bl/6小鼠,18-20克购自北京华阜康生物公司

细胞b16-muc1细胞系是稳定转染人全长muc1的小鼠b16黑色素瘤细胞。用含g418(终浓度为600μg/ml)，青、链霉素(100u/ml)及10％新生牛血清的imdm培养液培养b16-muc1细胞，用流式细胞仪鉴定muc1蛋白的表达，结果显示b16-muc1细胞muc1的表达率在97.8％以上可用于肿瘤模型的构建。

2.方法

2.1小鼠分组及免疫

c57bl/6小鼠,18-20克50只，随机分5组，分别为生理盐水组(ns)cpg-odn2006+mf59+muc1-mbp组，cpgodn2006+muc1-mbp组，mf59+muc1-mbp组，cpg-odn2006+mf59组。每组10只鼠，雌雄各半。首先，给小鼠背部右胁皮下接种b16-muc1细胞，1×10⁶个/只。然后，在肿瘤接种后的7天可触及小米粒大小肿瘤后，颈背部皮下多点注射免疫，每7天免疫一次，共免疫三次。观察小鼠的一般状态，小鼠成瘤情况，记录小鼠的死亡时间，绘制生存曲线。

3.结果

3.1重组muc1-mbp融合蛋白的抗肿瘤作用

如图2所示：不同佐剂联合对muc1-mbp诱导的荷瘤小鼠生存期的影响曲线图(m-m:muc1-mbp；2006:cpg-odn-2006；ns:生理盐水)，小鼠注射肿瘤细胞后一周，可触及小米粒大小的肿块。此后，经cpg-2006与mf59以及muc1-mbp三者联合组免疫组小鼠肿瘤生长最慢，其次是cpg-2006与muc1-mbp二者联合组，mf59与muc1-mbp二者联合组.在肿瘤注射后60天，上述三组小鼠生存率分别为80％，60％和40％；而生理盐水组与cpg-2006与mf59联合组小鼠肿瘤生长迅速，在肿瘤注射后60天生存率分别为10％和20％。上述结果提示，cpg-2006与mf59以及muc1-mbp三者联合组，cpg-odn2006与muc1-mbp二者联合组，mf59与muc1-mbp二者联合组均能延长荷瘤小鼠的生存期，尤其以muc1-mbp与cpg-2006以及mf59三者联合效果最佳。

4.结论

muc1-mbp与cpg-2006二者联合，muc1-mbp与cpg-2006和mf59三者联合均明显延长荷瘤小鼠生存期，尤其以三者联合最为显著。因此，muc1-mbp与cpg-2006和mf59三者联合可作为良好的疫苗开发利用。