本发明阐述了从银杏叶中提取精制得到含有高纯度银杏黄酮提取物的方法
背景技术：
银杏叶中所含的黄酮类化合物具有降低心肌耗氧量、使冠脉和脑血管流量增加、抗心率失衡、软化血管、降血糖、血脂等作用；具有抑制血小板活化因子(apf)、促进血液循环及脑代谢等功能，用于治疗冠心病、心绞痛、哮喘、内毒素休克、器官移植排斥反应老年痴呆症和防治高血压、低血压、心脏病、动脉硬化、脑功能减退等多种疾病；同时，它还是一种天然抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基、抗衰老、增强机体免疫力的生理活性。有关银杏叶的有效成分及疗效的研究日益受到重视，已开发出保健品、化妆品、药品等多达100多种，形成国际市场上销售额20多亿美元的新兴产业。
目前提取银杏黄酮的主要方法有溶剂萃取法、金属络合沉淀法、膜分离、树脂法和超临界萃取等。①溶剂萃取法得到的产品的纯度有一定的局限性，如果使用卤代烃、甲苯和铅化物等有毒物质，则这些物质的残留会影响产品质量，而为了调整极性往往使用混合溶剂，溶剂回收比较困难，因此不利于保护环境、费用较高。张春秀等(张春秀，胡小玲，岳红.银杏黄酮类化合物的提取分离[j].应用化学,2001,18(4):338-339)采用乙基丁基酮作为萃取剂，设计了三因素四水平的正交实验，考察了温度、ph值、萃取时间、萃取次数等因素对萃取效果的影响。②金属络合沉淀法则容易造成金属离子残留，尤其是需要消耗大量能量回收解络剂，使得过程成本很高。张静(张静.银杏黄酮纯化及生物活性的研究[d].江南大学，2010.)采用了此方法，将银杏黄酮纯度提高到了55％；③膜分离技术分离能够取得较好的分离效果，同时能耗小、无污染，但膜的反复使用会造成膜污染、很不易清理，只有找到成本低、通量高的膜才能实现大规模生产。朱明行等(zhumh，yuny，xiangw.purificationofginkgobilobaflavonoidsbyufmembranetechnology[j].desalination&watertreatment,2013,51(19-21):3847-3853)使用pes10kd膜得到较高纯度的银杏黄酮提取物，但并未表明其收率；④树脂法在国内精制银杏黄酮过程中应用广泛，取得了不错效果，但树脂易出现吸附性能显著下降的情况，其再生过程周期长、产生废液多，导致生产成本较高。吴梅林(吴梅林.银杏叶中活性成分提取分离与测定研究[d].中南大学,2005)采用ab-8树脂制得的银杏黄酮纯度大于24％；⑤超临界萃取技术由于设备造价高，一次性投资高，目前并没有得到广泛应用。张玉祥等(张玉祥，邱蔚芬.co2超临界萃取银杏叶有效成分的工艺研究[j].中国中医药科技,2006,13(4):255-256)使用超临界萃取方法所得的银杏黄酮纯度为27％。
与银杏黄酮提取分离方法相关的专利或申请有：⑴cn102093326a(《一种从银杏叶中提取精制银杏黄酮的方法》)：本发明涉及从银杏叶中提取精制银杏黄酮的方法，包括以下步骤：将干燥的银杏叶粉碎至30-40目，用含有细胞壁溶解酶的水在一定温度下浸泡银杏叶5-8h，然后煮沸提取银杏黄酮、离心水提液、用酸将离心液ph值调至4-6后，用大孔树脂分离纯化银杏黄酮。该专利使用的细胞溶解酶易失活，且不易重复利用；过程中用酸，造成废水处理困难，污染环境。
⑵cn105175465a(《一种提取银杏叶黄酮的方法》)：本发明为一种提取银杏叶黄酮的方法，包括如下步骤：①将银杏叶粉碎后进行索式提取，得到粗提物浸膏；②将步骤①所得的银杏叶粗提物浸膏放于离子液体与盐溶液形成的双水相溶液a中，然后微波进行处理得到吸附完成的双水相溶液；③取步骤②上层清液，通过b-r缓冲液控制ph在3-6，用大孔吸附树脂常温静态进行吸附24h；④用蒸馏水冲洗大孔树脂，然后收集冲洗液，回收离子液体重复利用；并用乙醇溶液对大孔吸附树脂进行洗脱，最后得银杏黄酮产物。该专利中提取方法复杂，难以实现工业化大规模应用。
⑶cn105596382a(《一种银杏提取物的提取工艺》)：本发明提供了一种银杏提取物的提取工艺，包括提取、浓缩、水沉、吸附、除酸和干燥步骤。本发明的提取工艺采用粉碎后的银杏叶浸入乙醇中进行提取，将提取液浓缩至无醇，稀释，并用冷沉离心法对稀释后的浓缩液进行处理，经过后续的d101树脂吸附、除酸、干燥工艺，得到纯度符合国家药典要求的银杏黄酮提取物。
⑷cn102526025a(《制备含多种指定有效成份含量的银杏叶提取物方法》)：本发明涉及一种制备含多种指定有效成份含量的银杏叶提取物方法。先用银杏叶或银杏叶提取物提取银杏有效成分再进一步提取中间体i银杏黄酮含量部位，再进一步提取中间体il银杏内酯a、银杏内酯b和银杏内酯c部位，然后再提取中间体ill白果内酯部位，将所得的银杏黄酮含量部位、银杏内酯a、银杏内酯b和银杏内酯c部位、白果内酯部位按标准要求含量称量直接调制，或与含量不符合要求的银杏叶提取物调制获得符合规定标准的要求。该专利中银杏黄酮部分纯度为30％，对于制作高附加值特效药有困难。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种从银杏叶中获得高纯度银杏黄酮的方法，其方法过程简单易于操作，成本较低，易于放大，便于将技术应用到工厂规模；该方法除了乙醇外不使用任何有机溶剂，更加安全可靠，符合国家标准的要求；该方法获得的银杏黄酮纯度最高为72％，更易于开发成高效药。
本发明采用的技术方案如下：
第一步：将干燥的银杏叶粉碎过60目筛；
第二步：用质量分数60％的乙醇水溶液溶解后进行超声处理；
第三步：在搅拌下进行两次热回流提取，合并提取液并浓缩至乙醇基本除去；
第四步：向浓缩液中加入4倍体积的水后于低温下静置沉淀，然后过滤；
第五步：过滤后的溶液上样于大孔吸附树脂，用水冲柱子后，用20％的乙醇溶液洗脱，最后用60％的乙醇溶液洗脱；
第六步：将60％的乙醇洗脱液浓缩，去掉大部分乙醇后加水上样于聚酰胺树脂，用水冲柱子后，用20％乙醇洗脱，最后用60％乙醇溶液洗脱；
第七步：采用旋蒸回收洗脱液中的乙醇后，经冷冻干燥得到纯度最高为72％的银杏黄酮提取物粉末。
经过实验测定，仅经过大孔吸附树脂的梯度洗脱得到的提取物粉末中银杏黄酮含量为30％以上；为了进一步提高纯度，采用聚酰胺树脂进一步精制。
本发明利用了超声波破坏细胞壁，使银杏黄酮更易被提取。同时，在整个过程中不使用任何毒性有机溶剂，保证了提取物中不含有毒性溶剂成分残留。采用醇提的方法，而不是水提，符合国家对于银杏叶提取的相关规定。采用了未见文献报道的大孔吸附树脂与聚酰胺树脂串联梯度洗脱的方法来得到高纯度的银杏黄酮提取物，只需在原有流程上加设柱子，工艺简单，易于实现工业化生产。得到的银杏黄酮高浓度提取物是黄色鲜亮的粉末，而不再是低纯度时的棕褐色。(注：银杏黄酮的检测参照2015版中国药典第一部416页银杏叶提取物中的方法进行)。
具体实施方式
实施例1:
(1)称取20g经粉碎机粉碎的银杏叶粉末(其中银杏黄酮的质量分数为0.98％)用200毫升质量分数60％的乙醇水溶液溶解，置于超声环境下0.5h后，进行热回流提取2次(每次料液比1:10、温度为70℃、时间为40min)。
(2)将提取液进行抽滤后，经旋蒸回收其中的乙醇，随后加入3倍体积的去离子水于0℃下静置沉淀，经抽滤或离心水析液，得到清澈棕黄色液体。
(3)将上述液体上样于ab-8大孔吸附树脂，待吸附完全后用4倍柱体积去离子水冲洗，随后用6倍柱体积的20％的乙醇水溶液冲洗，最后用5倍柱体积的60％乙醇水溶液冲洗，可观察到柱子中有明显下移的谱带并全部被洗脱掉。
(4)将60％的乙醇水洗脱液经旋蒸回收乙醇后(此时银杏黄酮质量分数为35％、收率为66％)，加入少量水作为原料液上聚酰胺树脂吸附柱，待吸附完全后先用4倍柱体积去离子水冲洗，随后用6倍柱体积20％的乙醇水溶液冲洗，再用6倍柱体积60％乙醇水溶液冲洗，直到柱子中明显下移的金黄色谱带全部被洗脱掉。
(5)将聚酰胺树脂的60％乙醇水洗脱液经旋蒸回收乙醇后进行冷冻干燥，得到银杏黄酮质量分数为66％的固形物粉末143.2mg，银杏黄酮收率为48％。
实施例2:
(1)称取20g经粉碎机粉碎的银杏叶粉末(其中银杏黄酮的质量分数为0.98％)用200毫升质量分数60％的乙醇水溶液溶解，置于超声环境下0.5h后，进行热回流提取2次(每次料液比1:10、温度为70℃、时间为40min)。
(2)抽滤后将得到的提取液进行旋蒸回收其中的乙醇，随后加入3倍体积的去离子水于0℃下静置沉淀，经抽滤或离心水析液，得到清澈棕黄色液体。
(3)将上述液体上样于ab-8大孔吸附树脂，待吸附完全后用4倍柱体积去离子水冲洗，随后用4倍柱体积的20％的乙醇水溶液冲洗，最后用5倍柱体积的60％乙醇水溶液冲洗，可观察到柱子中有明显下移的谱带全部被洗脱掉。
(4)将60％的乙醇水洗脱液经旋蒸回收乙醇后(此时银杏黄酮质量分数为34％、收率为96％)，加少量水后作为原料液上聚酰胺树脂吸附柱，待吸附完全后先用4倍柱体积去离子水冲洗，随后用4倍柱体积10％的乙醇水溶液冲洗，最后用4倍柱体积60％乙醇水溶液冲洗，直到柱子中明显下移的金黄色谱带全部被洗脱掉。
(5)将聚酰胺树脂的60％乙醇水洗脱液经旋蒸回收乙醇后进行冷冻干燥，得到银杏黄酮质量分数为69％的固形物粉末189mg，银杏黄酮收率为67％。
实施例3:
(1)称取20g经粉碎机粉碎的银杏叶粉末(其中银杏黄酮的质量分数为0.98％)用180毫升质量分数60％的乙醇水溶液溶解，置于超声环境下1h后，进行热回流提取2次(每次料液比1:9、温度为70℃、时间为1h)。
(2)抽滤后将得到的提取液进行旋蒸回收其中的乙醇，随后加入3.5倍体积的去离子水于0℃下静置沉淀，经抽滤或离心水析液，得到清澈棕黄色液体。
(3)将上述液体上样于ab-8大孔吸附树脂，待吸附完全后用4倍柱体积去离子水冲洗，随后用6倍柱体积的20％的乙醇水溶液冲洗，最后用4倍柱体积的60％乙醇水溶液冲洗，可观察到柱子中有明显下移的谱带并全部被洗脱掉。
(4)将60％的乙醇水洗脱液经旋蒸回收乙醇后(此时银杏黄酮质量分数为41％、收率为67％)，加入少量水后作为原料液上聚酰胺树脂吸附柱，待吸附完全后先用4倍柱体积去离子水冲洗，随后用6倍柱体积20％的乙醇水溶液冲洗，再用4倍柱体积60％乙醇水溶液冲洗，直到柱子中明显下移的金黄色谱带全部被洗脱掉。
(5)将聚酰胺树脂的60％乙醇水洗脱液经旋蒸回收乙醇后进行冷冻干燥，得到银杏黄酮质量分数为72％的固形物粉末139mg，银杏黄酮收率为51％。