一种多层含有细胞因子的高强度人工硬脑膜及其制备方法与流程

本发明涉及一种多层含有细胞因子的高强度人工硬脑膜及其制备方法，属于生物微纳制造技术领域。

背景技术：

硬脑膜缺损在神经外科临床工作中常见，开放性颅脑损伤(工业、交通、战争等)、肿瘤的侵蚀、先天性脑膜缺损及其它颅脑疾患原因均可引发硬脑膜缺损。硬脑膜缺损需及时修补以防脑脊液外溢，防止脑的膨出和大气压的压迫，否则将危及人体生命。硬脑膜缺损还能引发颅内感染、脑粘连、皮下积液等并发症，经常会引起如头痛、脑功能障碍等疾病。

目前己有多种材料制成的人工硬脑膜正在临床使用，主要可分为两大类:生物衍生材料和人工合成高分子材料。生物衍生材料主要有同种异体的人体硬脑膜及异种的猪/牛源心包膜、真皮基质以及利用牛肌键i型胶原制备的生物膜等。人工合成高分子材料主要包括聚酯类可降解高分子，如聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯以及聚氨酯等。此外还包括聚四氟乙烯等不可降解高分子材料。

目前脑膜损伤修复效果比较理想的是多层人工硬脑膜。这种多层人工硬脑膜通过分层来达到模拟脑膜生理功能的目的。这类人工硬脑膜一般有内层和外层两层组成。其中内层由疏水材料制成，外层由亲水材料制成。由于两层材料疏水亲水性质不同，导致外层与内层的联接可靠性不高，有剥离的现象发生，严重威胁的病人的生命健康。

脑膜主要分布成纤维细胞及其分泌的胶原纤维。一般成纤维细胞直径在20-30μm之间。文献报道，当静电纺丝纤维径在50-1000nm之间时候,平均孔径可达到2μm。平均孔径在3μm以下，就可以有效的防止细胞的进入静电纺丝纤维薄膜中，有效脑粘连的产生。当纤维直径在5-200μm之间,平均孔径达到20-100μm。这样有利于成纤维细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。

成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor,fgf）有几种异构体，在动脉硬化灶中起作用的主要是bfgf（basicfibroblastgrowthfactor），bfgf可以由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌。它的作用是促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。

kylekurpinski等在《nanomedicine》中发表的一篇文章中，介绍了一种双层的电纺膜，所用材料为plcl/ppg溶液。文章利用转轴收集装置，获得了平行排布的电纺膜，测试了平行和垂直纤维排布方向的电纺膜的机械强度，取样大小为6×1cm，测得沿两个方向的最大加载分别为12.08±1.15n和3.01±0.54n。可见，在与纤维方向一致方向上薄膜的强度很差。

中国发明专利cn103480042a，发明名称为:“一种复合型人工硬脑膜及制备方法”，公开了一种复合型人工硬脑膜，由凝胶层和编织层构成，编织层设于两层水凝胶层之间，在水凝胶层中含有细胞生长因子。本发明的有益效果是：细胞生长因子有利于创面修复,加速硬脑膜损伤的愈合。但存在如下缺点:1）脑膜外层为胶体结构，而非纳米纤维支架，不利于细胞附着，脑膜修复周期长，2）细胞生长因子溶于胶体中，只有表层的细胞生长因子与细胞接触，对细胞生产的促进作用有限。

中国发明专利cn106943634a,发明名称为“一种具有抗感染功能的可吸收人工硬脑膜及其制备方法与应用”,公开了一种由纳米纤维膜由可降解聚醋纳米纤维膜和壳聚糖纳米纤维膜双层结构组成。本发明的可吸收人工硬脑膜具有良好抗感染性能可有效防止术后颅内感染，能承受一定的缝合力，不撕裂、不脱边。但该产品两层均采用滚筒定向纺丝工艺制备，脑膜两层均是取向性纳米纤维，这种纤维薄膜强度远远低于非取向性纤维薄膜。同时该人工硬脑膜只有两层，两层间的结合强度不够。

因此，目前临床上迫切需要一种能促进脑损伤愈合，内层与外层结合可靠，使用方便，产业化前景广阔的人工硬脑膜。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明目的是提供一种多层含有细胞因子高强度人工硬脑膜，该人工硬脑膜与传统人工硬脑膜的区别是：

（1）在人工硬脑膜的内层和外层中间增加编织型中间层，中间层采用疏水材料和亲水材料编织而成，根据“相似相容”原理,编织层中的疏水材料制备的细条和人工硬脑膜内层（疏水材料电纺丝制备）可靠结合，亲水材料制备的细条和人工硬脑膜外层（亲水材料电纺丝制备）可靠结合，而这两种细条又是重叠交织在一起的，亲水材质的细条透过疏水材质的丝带的空隙与外层结合，疏水材质的细条透过亲水材质的丝带的空隙与内层结合，这样内外两层就可靠地结合在一起。总之，这种结构的人工硬脑膜，提高了内层与外层之间的结合力，不易在外力的作用下发生层与层之间的剥离。

(2)人工硬脑膜内层，采用电纺丝工艺制备,得到非取向性纳米纤维薄膜。该种薄膜抗撕裂强度远远大于取向性薄膜，从结构上提高了人工硬脑膜的强度。

(3)人工硬脑膜外层，采用电纺丝工艺制备,得到取向性纳米纤维薄膜，纤维间隙便于成纤维细胞附着。

(4)细胞生产因子散布于电纺丝纤维中间，有效提高了细胞生长因子和脑膜细胞的接触几率，充分发挥细胞生长因子的作用。

本发明的另一目的是提供一种多层含有细胞因子高强度人工硬脑膜的制备方法。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：

一种多层含有细胞因子高强度人工硬脑膜，包含三层，面向大脑的疏水性内层，背向大脑亲水性外层和两层之间的编织型中间层。

所述亲水性外层由静电纺丝制成，即外层为了有效诱导干细胞及成纤维细胞的迁入，该层则采用采用生物相容性好的亲水性材料，再者，通过静电纺丝参数调整，使平均孔径达到20-100μm，一般成纤维细胞直径在20-30μm之间。这样有利于成纤维细胞的迁入、粘附、增殖和生长分化。

所述内层是采用疏水性材料，防止细胞的迁入，从而达到防粘连的目的；对制备该层材料的静电纺丝参数进行调整，使其孔隙孔径在纳米以下，比细胞小一到二个数量级（一般成纤维细胞直径在20-30μm之间），从而阻止细胞进入，防止脑粘连产生。

所述中间层是采用疏水性材料和亲水材料编织而成。

一种多层含有细胞因子高强度人工硬脑膜，包括内层、中间层、外层，其制备方法按以下步骤制备而成：

(1)内层的制备：内层材料成分为聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度7％（wt），搅拌4小时，电纺丝参数为流速为0.9ml/h、电压13kv、接收距离20cm，静电纺丝4h；

(2)中间层制备。

羧甲基壳聚糖（南通绿神生物工程有限公司）用静电纺丝制备成薄膜，薄膜厚度为40μm。将薄膜制成宽3mm，长1000mm的细条。

聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司）用静电纺丝制备成薄膜，薄膜厚度为40μm。将薄膜制成宽3mm，长1000mm的细条。

将两种细条采用菱形编制法编制，得到编织型中间层。

（3）在内层固化之前，把编织型中间层放于内层上表面。用50n的压力对上边摆放的编织型中间层向下挤压，保持1min。

(4)外层制备：

外层材料为羧甲基壳聚糖（南通绿神生物工程有限公司），溶解于纯净水(济南海业化工有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺参数为：流速0.4ml/h、电压0.9kv、接收距离1mm，取向静电纺丝工艺制备2h，得到取向性纳米纤维层，纤维纵向与任意一边平行。

(5)成纤维细胞生长因子（rh-bfgf干粉,商品名：外用重组人碱性成纤维细胞生长因子，南海朗肽制药有限公司）用注射用水(济南海业化工有限公司)溶解，均匀喷洒到脑硬膜外层。最优用量为150iu/cm²。

(6)将制得的人工脑膜，经冻干后真空包装，经25kgy钻-60灭菌后-20℃低温保存。

制备得到的多层静电纺丝人工硬脑膜每层的厚度为：内层厚度为80μm±10μm，外层厚度为30μm±10μm，中间层厚度为80μm±20μm。

内层制备时，静电纺丝纤维直径控制在50-1000nm之间,平均孔径为2μm；

外层制备时，静电纺丝纤维直径控制在5-200μm之间,平均孔径为20-100μm。

本发明的有益效果是：

（1）在人工硬脑膜的内层和外层中间增加编织型中间层，中间层采用疏水材料和亲水材料编织而成，根据“相似相容”原理,编织层中的疏水材料制备的细条和人工硬脑膜内层（疏水材料电纺丝制备）可靠结合，亲水材料制备的细条和人工硬脑膜外层（亲水材料电纺丝制备）可靠结合，而这两种细条又是重叠交织在一起的，亲水材质的细条透过疏水材质的丝带的空隙与外层结合，疏水材质的细条透过亲水材质的丝带的空隙与内层结合，这样内外两层就可靠地结合在一起。总之，这种结构的人工硬脑膜，提高了内层与外层之间的结合力，不易在外力的作用下发生层与层之间的剥离。

(2)人工硬脑膜内层，采用电纺丝工艺制备,得到非取向性纳米纤维薄膜。该种薄膜抗撕裂强度远远大于取向性薄膜，从结构上提高了人工硬脑膜的强度。

(3)人工硬脑膜外层，采用电纺丝工艺制备,得到取向性纳米纤维薄膜，纤维间隙便于成纤维细胞附着。

(4)细胞生产因子散布于电纺丝纤维中间，有效提高了细胞生长因子和脑膜细胞的接触几率，充分发挥细胞生长因子的作用。

附图说明

图1为人工硬脑膜结构示意图，其中1为内层，2为中间层，3为外层，4为细胞生长因子。

图2为中间层结构示意图。2-1为羧甲基壳聚糖材质的细条，2-2为聚己内酯材质的细条。

图3为取向性纳米纤维效果图。

图4为非向性纳米纤维效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法：下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)内层的制备：内层材料成分为聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中,纺丝液浓度5％（wt），搅拌1小时，电纺丝参数为流速为1.0ml/h、电压12kv、接收距离15cm，静电纺丝2h；

(2)中间层制备。

羧甲基壳聚糖（南通绿神生物工程有限公司）用静电纺丝制备成薄膜，薄膜厚度为40μm。将薄膜制成宽3mm，长1000mm的细条。

聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司）用静电纺丝制备成薄膜，薄膜厚度为40μm。将薄膜制成宽3mm，长1000mm的细条。

将两种细条采用菱形编制法编制，得到编织型中间层。

（3）在内层固化之前，把编织型中间层放于内层上表面。用50n的压力对上边摆放的编织型中间层向下挤压，保持1min。

(4)外层制备：

外层材料为羧甲基壳聚糖（南通绿神生物工程有限公司），溶解于纯净水(济南海业化工有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺参数为：流速0.2ml/h、电压0.8kv、接收距离1mm，取向静电纺丝工艺制备3h，得到取向性纳米纤维层，纤维纵向与任意一边平行。

(5)成纤维细胞生长因子（rh-bfgf干粉,商品名：外用重组人碱性成纤维细胞生长因子，南海朗肽制药有限公司）用注射用水(济南海业化工有限公司)溶解，均匀喷洒到脑硬膜外层。最优用量为150iu/cm²。

(6)将制得的人工脑膜，经冻干后真空包装，经25kgy钻-60灭菌后-20℃低温保存。

实施例2

(1)内层的制备：内层材料成分为聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度7％wt，搅拌4小时，电纺丝参数为流速为0.9ml/h、电压13kv、接收距离20cm，静电纺丝4h；

(2)中间层制备。

羧甲基壳聚糖（南通绿神生物工程有限公司）用静电纺丝制备成薄膜，薄膜厚度为40μm。将薄膜制成宽3mm，长1000mm的细条。

聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司）用静电纺丝制备成薄膜，薄膜厚度为40μm。将薄膜制成宽3mm，长1000mm的细条。

将两种细条采用菱形编制法编制，得到编织型中间层。

（3）在内层固化之前，把编织型中间层放于内层上表面。用50n的压力对上边摆放的编织型中间层向下挤压，保持1min。

(4)外层制备：

外层材料为羧甲基壳聚糖（南通绿神生物工程有限公司），溶解于纯净水(济南海业化工有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺参数为：流速0.4ml/h、电压0.9kv、接收距离1mm，取向静电纺丝工艺制备2h，得到取向性纳米纤维层，纤维纵向与任意一边平行。

(5)成纤维细胞生长因子（rh-bfgf干粉,商品名：外用重组人碱性成纤维细胞生长因子，南海朗肽制药有限公司）用注射用水(济南海业化工有限公司)溶解，均匀喷洒到脑硬膜外层。最优用量为150iu/cm²。

(6)将制得的人工脑膜，经冻干后真空包装，经25kgy钻-60灭菌后-20℃低温保存。

实施例3

(1)内层的制备：内层材料成分为聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司），溶解于六氟异丙醇(苏州昊帆生物股份有限公司)中，纺丝液浓度5％wt，搅拌4小时，电纺丝参数为流速为1.0ml/h、电压15kv、接收距离25cm，静电纺丝5h。

(2)中间层制备。

羧甲基壳聚糖（南通绿神生物工程有限公司）用静电纺丝制备成薄膜，薄膜厚度为40μm。将薄膜制成宽3mm，长1000mm的细条。

聚己内酯（深圳市博立生物材料有限公司）用静电纺丝制备成薄膜，薄膜厚度为40μm。将薄膜制成宽3mm，长1000mm的细条。

将两种细条采用菱形编制法编制，得到编织型中间层。

（3）在内层固化之前，把编织型中间层放于内层上表面。用50n的压力对上边摆放的编织型中间层向下挤压，保持1min。

(4)外层制备：

外层材料为羧甲基壳聚糖（南通绿神生物工程有限公司），溶解于纯净水(济南海业化工有限公司)中，纺丝液浓度6％（wt），搅拌1小时，电纺参数为：流速0.6ml/h、电压1kv、接收距离2mm，取向静电纺丝工艺制备3h，得到取向性纳米纤维层，纤维纵向与任意一边平行。

(5)成纤维细胞生长因子（rh-bfgf干粉,商品名：外用重组人碱性成纤维细胞生长因子，南海朗肽制药有限公司）用注射用水(济南海业化工有限公司)溶解，均匀喷洒到脑硬膜外层。最优用量为150iu/cm²。

(6)将制得的人工脑膜，经冻干后真空包装，经25kgy钻-60灭菌后-20℃低温保存。