一种肝素化丝素蛋白膜及其制备方法与流程

本发明涉及一种肝素化丝素蛋白膜及其制备方法，肝素以共价键高密度接枝到丝素蛋白膜表面，能显著提高丝素蛋白材料的抗凝血性能，属于生物医用材料领域。

背景技术：

蚕丝蛋白是一种天然的高分子，由蚕绢丝腺内壁上的内皮细胞分泌的高纯度结晶性蛋白质。丝素蛋白材料具备良好的力学性能、生物相容性以及较低的免疫原性，且可被生物降解，在生物医药与再生医学领域具有良好的应用前景。近年来丝素基材料被广泛用于制备人工血管，人工心脏等支架。然而，作为外源性的植入物，丝素蛋白材料会直接与组织液或血液接触，血小板与血浆蛋白会吸附、聚集在材料表面，进而引发凝血，形成血栓。因此，如何构建具有良好的抗凝血性能的表面是丝素蛋白作为血液直接接触型生物材料面临的关键问题。

迄今为止，用于提高丝素蛋白材料抗凝血性能的策略主要有水蛭素改性，内皮化，硫酸化以及肝素化等。其中肝素化是应用最广且是最有效的增强丝素蛋白材料抗凝血性能的方法。丝素蛋白表面肝素化的方法主要包括物理共混，表面涂层及共价接枝等。公开号为cn1255189c的中国发明专利“一种抗凝血性不溶性丝素材料的制备方法”中，将肝素溶解在丝素蛋白溶液中制备成的肝素-丝素共混膜具有较好的抗凝血性能。“improvedhemocompatibilityofsilkfibroinfabricusinglayer-by-layerpolyelectrolytedepositionandheparinimmobilization”[j.appl.polym.sci.,2014,131(18)]一文中，首先利用聚丙烯氯化铵和聚丙烯酸经过层层静电自组装技术在丝素纤维表面形成聚电解质层，然后将低分子量的肝素涂层在带正电荷的丝素纤维表面，能显著降低血浆蛋白的吸附，有效地提高丝素材料的抗凝血性能。“cytocompatibilityandbloodcompatibilityofmultifunctionalfibroin/collagen/heparinscaffolds”[biomaterials，2007，28(14)：2306-2313]一文中，将肝素、丝素蛋白与胶原共混制备成的支架材料体外能较明显地延长凝血酶原时间（pt）、凝血酶时间（tt）及活化部分凝血活酶时间（aptt），但支架上的肝素在4天内基本释放完全。

在上述已公开的现有技术中，将肝素通过表面涂层、物理共混等方法固定在丝素蛋白材料的表面，是依靠分子间静电相互作用或者氢键，结合力弱，肝素分子易于脱落，突释现象明显，有效的抗凝血时间较短。因此，将肝素共价接枝到丝素蛋白材料表面上以提高其抗凝血性及其持久性，是改善丝素蛋白材料抗凝血性能的重要途径。然而，丝素蛋白分子链上的碱性氨基酸含量仅约为0.87mol%，其中侧链上带有自由氨基的精氨酸和赖氨酸的含量分别仅约为0.46和0.22mol%，这就使得能与肝素分子链上的羧基反应的自由氨基数目有限，难以达到在丝素蛋白膜表面高密度共价接枝肝素的目的。

技术实现要素：

本发明针对丝素蛋白表面自由氨基数量少及现有的丝素蛋白肝素化改性技术存在的不足，提供一种能有效将肝素以共价键高密度接枝到丝素蛋白膜表面，具有良好的抗凝血活性的肝素丝素蛋白膜及其制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是提供一种肝素化丝素蛋白膜的制备方法，先将蚕丝经脱胶、溶解、透析后得到再生丝素蛋白溶液，制成丝素蛋白膜，再经乙醇溶液处理，得到水难溶性的丝素蛋白膜，再进行如下步骤的处理：

（1）将水难溶性的丝素蛋白膜置于低温等离子体反应室内，预抽真空至5～10pa，通入气体清洗后，开启射频电源，用低温等离子体对丝素蛋白膜表面进行处理，通入气体的流量为10～100cm³/min，反应室内压强为20～100pa，射频功率为5～200w，处理时间为1～60min；所述的气体为氮气或氨气，或它们的混合气体；

（2）关闭射频电源，继续通入气体5～60min后取出样品；

（3）将肝素钠溶解于ph值为4.5～6.5的缓冲溶液中，配制成浓度为0.1～20.0mg/ml的肝素钠溶液，再加入n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺，肝素钠溶液中的n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的浓度分别为10～50mm和5～20mm；

（4）将步骤（2）取出的丝素蛋白膜样品浸入步骤（3）制得的肝素钠溶液中，于2～8℃反应2～48h；反应结束后，经清洗、室温干燥，得到一种肝素化丝素蛋白膜。

上述技术方案中，步骤（3）所述的缓冲溶液可以是2-(n-吗啡啉)乙磺酸，柠檬酸钠，乙酸钠缓冲溶液中的任意一种。

本发明技术方案还包括按上述制备方法得到的一种肝素化丝素蛋白膜。

本发明的原理是：利用氮气低温等离子体技术在丝素蛋白膜的表面引入大量的自由氨基，再用1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺激活肝素上的羧基与丝素蛋白膜上新引入的氨基发生酰胺化反应，从而将肝素以共价键高密度接枝到丝素蛋白膜表面。

本发明所采用的对丝素蛋白膜表面肝素化改性的方法与现有的其他方法相比，有如下优点：

1.本发明首先采用氮气低温等离子体技术在丝素蛋白膜表面引入大量的自由氨基，再用1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺激活肝素分子上的羧基与丝素蛋白膜表面新产生的自由氨基发生酰胺化反应，从而将肝素以共价键高密度接枝到丝素蛋白膜表面，使得肝素与丝素蛋白材料表面结合稳定，克服了通过表面涂层或物理共混法对丝素蛋白材料进行肝素化改性带来的肝素突释、抗凝血不明显或时间很短等弊端，使材料获得持久稳定的抗凝血性能。

2.本发明所采用的方法工艺路线简单，操作简便，为血液直接接触型医用生物材料的表面抗凝血改性提供了新途径。

附图说明

图1是本发明提供的制备肝素化丝素蛋白膜的原理流程图。

图2是本发明提供的肝素化丝素蛋白膜表面的肝素接枝密度图。

图3是相关材料与本发明提供的肝素化丝素蛋白膜体外活化部分的凝血活酶时间（aptt）、凝血酶时间（tt）及凝血酶原时间（pt）的对比图。

图4是相关材料与本发明提供的肝素化丝素蛋白膜表面吸附血小板的扫描电镜对比图片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明技术方案作进一步的阐述。

实施例一：

本实施例提供一种肝素化丝素蛋白膜的制备方法，先按现有技术制备得到水难溶性的丝素蛋白膜（步骤1～5），再按附图1提供的制备肝素化丝素蛋白膜的原理流程图，制备肝素化丝素蛋白膜，具体步骤如下：

1.将150g生蚕丝放入5l浓度为0.05%的na2co3溶液中，于98～100℃处理3次，每次30min，用去离子水清洗后，于60℃烘箱中烘干扯松，得到丝素纤维。

2.将15g丝素纤维溶于100ml的9.3mlibr溶液中，60℃缓慢搅拌溶解1h得到丝素蛋白混合溶液。

3.用纤维素膜为透析材料（截留分子量9～12kda），将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水进行透析，以除去溴化锂杂质，再用多层脱脂纱布过滤，得到再生丝素蛋白溶液。

4.将再生丝素蛋白溶液倾倒在直径为8.5cm的聚苯乙烯皿上，在洁净的通风橱内室温风干成厚度为20μm的丝素蛋白膜。

5.将丝素蛋白膜用浓度为90%的乙醇溶液处理30min，然后用去离子水清洗24h，室温干燥得到水难溶性的丝素蛋白膜。

6.将水难溶性的丝素蛋白膜置于低温等离子体处理仪的下电极中央，关闭反应室及各路气路阀，启动真空泵，预抽本底真空至10pa。

7.打开进气气路，将氮气通入反应室，清洗2次，然后再关闭阀门，抽至本底真空度至8pa。

8.再将氮气进气阀门打开，调节氮气流量为10cm³/min，反应室内压强为20pa，待压强稳定后，启动射频电源，射频功率为5w，处理时间为60min。

9.辉光放电结束后，关闭射频电源，继续通入氮气5min，处理结束后，依次关闭进气阀、真空泵，打开放空阀门，取出样品。

10.将经氮气等离子体处理过的水难溶性的丝素蛋白膜立即浸入肝素钠溶液中，2℃反应2h，反应完毕后，用去离子水漂洗48h，室温干燥得到肝素化丝素蛋白膜。其中肝素钠浓度为0.1mg/ml，肝素钠溶解在2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，所用的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度为50mm，溶液的ph值为5.6，肝素钠溶液中的n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的浓度分别为10mm和5mm，肝素上的羧基被激活的时间为30min，制备得到一种肝素化丝素蛋白膜。

经测定，本实施例提供的改性后的丝素蛋白膜表面肝素接枝密度为4.5μg/cm²，体外活化部分的凝血活酶时间（aptt）为（63±3.1）s、凝血酶时间（tt）为（24±2.2）s及凝血酶原时间（pt）为（21±1.8）s。

实施例二：

1.将120g生蚕丝放入5l浓度为0.05%的na2co3溶液中，于98～100℃处理3次，每次30min，用去离子水清洗后，于60℃烘箱中烘干扯松，得到丝素纤维。

2.将20g丝素纤维溶于120ml的9.3mlibr溶液中，60℃缓慢搅拌溶解1h得到丝素蛋白混合溶液。

3.用纤维素膜为透析材料（截留分子量9～12kda），将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水进行透析，以除去溴化锂杂质，再用4000rpm离心10min得到再生丝素蛋白溶液。

4.将再生丝素蛋白溶液倾倒在直径为8.5cm的聚苯乙烯皿上，在洁净的通风橱内室温风干成厚度为80μm的丝素蛋白膜。

5.将丝素蛋白膜用70%的乙醇溶液处理240min，然后用去离子水清洗48h，室温干燥得到水难溶性的丝素蛋白膜。

6.将水难溶性的丝素蛋白膜置于低温等离子体处理仪的下电极中央，关闭反应室及各路气路阀，启动真空泵，预抽本底真空至9pa。

7.打开进气气路，将氮气通入反应室，清洗3次，然后再关闭阀门，抽至本底真空度至7pa。

8.再将氮气进气阀门打开，调节氮气流量为100cm³/min，反应室内压强为100pa，待压强稳定后，启动射频电源，射频功率为200w，处理时间为1min。

9.辉光放电结束后，关闭射频电源，继续通入氮气25min，处理结束后，依次关闭进气阀、真空泵，打开放空阀门，取出样品。

10.将经氮气等离子体处理过的水难溶性的丝素蛋白膜立即浸入肝素钠溶液中，8℃反应12h，反应完毕后，用去离子水漂洗36h，室温下干燥得到肝素化丝素蛋白膜。其中肝素钠浓度为10mg/ml，肝素钠溶解在2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，所用的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度为60mm，溶液的ph值为4.5，肝素钠溶液中的n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的浓度分别为20mm和10mm，肝素上的羧基被激活的时间为25min,制备得到一种肝素化丝素蛋白膜。

经测定，本实施例提供的改性后的丝素蛋白膜表面肝素接枝密度为6.8μg/cm²，体外活化部分的凝血活酶时间（aptt）为（75±2.5）s、凝血酶时间（tt）为（25±1.9）s及凝血酶原时间（pt）为（24±2.1）s。

实施例三：

1.将100g生蚕丝放入4l浓度为0.05%的na2co3溶液中，于98～100℃处理3次，每次30min，用去离子水清洗后，于60℃烘箱中烘干扯松，得到丝素纤维。

2.将10g丝素纤维溶于100ml的三元溶液（氯化钙：水：乙醇的摩尔比为1:8:2）中，72℃缓慢搅拌溶解1h得到丝素蛋白混合溶液。

3.用纤维素膜为透析材料（截留分子量9～12kda），将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水进行透析，以除去氯化钙、乙醇等杂质，再用多层脱脂纱布过滤，得到再生丝素蛋白溶液。

4.将再生丝素蛋白溶液倾倒在直径为8.5cm的聚苯乙烯皿上，在洁净的通风橱内室温风干成厚度为60μm的丝素膜。

5.将丝素蛋白膜用80%的乙醇溶液处理120min，然后用去离子水清洗36h，室温干燥得到水难溶性的丝素蛋白膜。

6.将水难溶性的丝素蛋白膜置于低温等离子体处理仪的下电极中央，关闭反应室及各路气路阀，启动真空泵，预抽本底真空至7pa。

7.打开进气气路，将氮气通入反应室，清洗3次，然后再关闭阀门，抽至本底真空度至5pa。

8.再将氮气进气阀门打开，调节氮气流量为45cm³/min，反应室内压强为30pa，待压强稳定后，启动射频电源，射频功率为70w，处理时间为30min。

9.辉光放电结束后，关闭射频电源，继续通入氮气60min，处理结束后，依次关闭进气阀、真空泵，打开放空阀门，取出样品。

10.将经氮气等离子体处理过的水难溶性的丝素蛋白膜立即浸入肝素钠溶液中，4℃反应36h，反应完毕后，用去离子水漂洗24h，室温干燥得到肝素化丝素蛋白膜。其中肝素钠浓度为20mg/ml，肝素钠溶解在2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，所用的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度为40mm，溶液的ph值为6.0，肝素钠溶液中的n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的浓度分别为50mm和20mm，肝素上的羧基被激活的时间为45min,制备得到一种肝素化丝素蛋白膜。

经测定，本实施例提供的改性后的丝素蛋白膜表面肝素接枝密度为7.9μg/cm²，体外活化部分的凝血活酶时间（aptt）为（112±2.3）s、凝血酶时间（tt）为（81±1.6）s及凝血酶原时间（pt）为（28±1.4）s。

实施例四：

1.将180g生蚕丝放入5l浓度为0.05%的na2co3溶液中，于98～100℃处理3次，每次30min，用去离子水清洗后，于60℃烘箱中烘干扯松，得到丝素纤维。

2.将30g丝素纤维溶于250ml的三元溶液（氯化钙：水：乙醇的摩尔比为1:8:2）中，72℃缓慢搅拌溶解1h得到丝素蛋白混合溶液。

3.用纤维素膜为透析材料（截留分子量9～12kda），将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水进行透析，以除去氯化钙、乙醇等杂质，再用4000rpm离心10min得到再生丝素蛋白溶液。

4.将再生丝素蛋白溶液倾倒在直径为8.5cm的聚苯乙烯皿上，在洁净的通风橱内室温风干成厚度为40μm的丝素膜。

5.将丝素蛋白膜用85%的乙醇溶液处理60min，然后用去离子水清洗48h，室温干燥得到水难溶性的丝素蛋白膜。

6.将水难溶性的丝素蛋白膜置于低温等离子体处理仪的下电极中央，关闭反应室及各路气路阀，启动真空泵，预抽本底真空至8pa。

7.打开进气气路，将氮气通入反应室，清洗2次，然后再关闭阀门，抽至本底真空度至6pa。

8.再将氮气进气阀门打开，调节氮气流量为60cm³/min，反应室内压强为50pa，待压强稳定后，启动射频电源，射频功率为120w，处理时间为10min。

9.辉光放电结束后，关闭射频电源，继续通入氮气45min，处理结束后，依次关闭进气阀、真空泵，打开放空阀门，取出样品。

10.将经氮气等离子体处理过的水难溶性的丝素蛋白膜立即浸入肝素钠溶液中，6℃反应48h，反应完毕后，用去离子水漂洗36h，室温干燥得到肝素化丝素蛋白膜。其中肝素钠浓度为15.0mg/ml，肝素钠溶解在2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，所用的2-(n-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的浓度为35mm，溶液的ph值为6.5，肝素钠溶液中的n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3（3-二甲基氨丙基）碳化二亚胺的浓度分别为30mm和15mm，肝素上的羧基被激活的时间为60min,制备得到一种肝素化丝素蛋白膜。

经测定，本实施例提供的改性后的丝素蛋白膜表面肝素接枝密度为7.1μg/cm²，体外活化部分的凝血活酶时间（aptt）为（106±3.1）s、凝血酶时间（tt）为（69±2.3）s及凝血酶原时间（pt）为（25±1.9）s。

参见附图2，它是本发明实施例提供的肝素化丝素蛋白膜表面肝素接枝密度图。由图2可以看出，随着氮气低温等离子体处理时间的增加，丝素蛋白膜表面的肝素接枝密度呈现上升趋势，当氮气低温等离子体对丝素蛋白表面处理9min时，丝素蛋白膜表面的肝素接枝密度可达7.8μg/cm²。

参见附图3，它是未经任何处理的丝素蛋白膜（sf）、经氮气低温等离子体处理过的丝素蛋白膜（sf-ltp）与本发明实施例提供的肝素化丝素蛋白膜（sf-ltp-hep）体外活化部分的凝血活酶时间（aptt）、凝血酶时间（tt）及凝血酶原时间（pt）的对比图。由图3对比结果可以看出，与未经任何处理的丝素蛋白膜（sf）、经氮气低温等离子体处理过的丝素蛋白膜（sf-ltp）相比，本发明提供的肝素化丝素蛋白膜（sf-ltp-hep）能显著地延长体外活化部分的凝血活酶时间（aptt）、凝血酶时间（tt）及凝血酶原时间（pt）。

参见附图4，它是未经任何处理的丝素蛋白膜（a图）、经氮气低温等离子体处理的丝素蛋白膜（b图）与本发明实施例提供的肝素化丝素蛋白膜（c图）表面吸附血小板的扫描电镜对比图片。由图4对比结果可以看出，本发明提供的肝素化丝素蛋白膜（sf-ltp-hep）能有效地减少血小板的吸附与聚集。