用于从全血中自动采集白细胞的方法与流程

本发明涉及用于在自动血液分离系统中从全血中分离干细胞和/或淋巴细胞的方法，其中，所采集的产品的质量得到提高并且细胞采集程序通过利用检测器而进一步自动化，该检测器包括用以在所要求保护的方法中和在细胞分离系统中对流体流的颜色和浊度进行测量的光学传感器，该细胞分离系统可以被用于执行所要求保护的方法。

背景技术：

本发明涉及血液分离术的领域。分离术是下述任何程序：在所述任何程序中，血液被从供血者/患者体内抽出并且对一部分(比如，血浆、白细胞、血小板或红细胞)进行分离和保留，并且剩余部分被重新输注到该供血者/患者体内。各类型的分离术包括红细胞分离术、白细胞分离术、淋巴细胞分离术、干细胞分离术、血浆分离术、以及血小板分离术(血小板单采术)。

分离术还被用在治疗中，其中，全血被分离成全血的主要成分血浆和红细胞，并且异常的致病成分通过在治疗性血浆置换程序中与血浆一起被移除；或者异常的红细胞在红细胞置换程序中被去除且被健康的细胞置换。此外，除了血浆置换程序和红细胞置换程序之外，还存在治疗性的程序以去除白血球(白细胞分离术)或者去除血小板(血小板分离术)。

淋巴细胞分离术和干细胞采集法是用以从供血者/患者体内所抽出的血液中采集包含有淋巴细胞和/或干细胞(其利用特殊药物从骨髓中冲出到外全血中)的单核细胞成分的分离程序，其中，血液的剩余部分被重新输注到该供血者/患者体内。

血液分离术通常利用血液细胞分离机来执行。这种血液细胞分离机通常包括下述离心机单元：该离心机单元被用于按照密度和大小将血液成分分离。离心方法可以被分为两个基本类别：连续流离心法(cfc)以及间歇流离心法。在cfc方法中的“连续”指的是血液被采集、旋转并同时回流。该方法和系统的主要优点在于，程序的体外体积低。这在少数人群、小孩或心脏和循环系统有问题的患者必须经受分离术程序时是特别有利的。

间歇流离心法以包括下述步骤的循环工作：以一定剂量抽取血液、使血液旋转、对血液进行处理、采集一种或更多种成分、以及使血液的剩余成分回流到供血者/患者体内。为了防止血液凝固，当血液从人体被泵送到分离机器中时抗凝剂被自动地与血液混合。

血液离心法的最终产品是：处于分离室外部的沉降红细胞：处于中间的包含mnc(mnc是单核的细胞，即淋巴细胞和单核细胞)、干细胞和血小板的血沉棕黄层；以及处于分离室内部的血浆。

近年来，已经研发了自动分离系统。在装置中已经实施了自动夹和传感器。此外，已经研发了特别适于对血液成分进行自动分离的具有离心室的细胞分离机。

ep0985453公开了用于细胞分离机的相应的离心室，该细胞分离机特别地用于将全血分离成全血的各成分。

ep1025872涉及用于对将血液分离成血液各成分的细胞分离机的管套件并且涉及利用所述管套件的细胞分离机。ep1025872还涉及用于进行血液分离的方法。

一种已知的且商用的细胞分离机是com.细胞分离机(fresenius)。该com.装置利用连续流离心法以便分离血液成分。血液成分在离心机外进行采集。此外，com.使用无密封的一次性套件。仅需要较低的体外体积来操作com.装置。捐赠以及治疗可以利用com.装置来运行。

对于治疗应用而言，例如对于连续的光化学疗法或供者淋巴细胞输注(dli)而言，期望的是，从全血中采集高纯度的淋巴细胞。干细胞产品的纯度相对于冻融程序是重要的。

淋巴细胞与单核细胞一起都属于单核的细胞(mnc)。在本发明的优选实施方式中，特别期望的是，从全血中分离包含血沉棕黄层部分中的淋巴细胞和/或干细胞的mnc。

通常能够利用com.分离系统通过离心法从全血中分离血沉棕黄层，该血沉棕黄层包含具有靶细胞(淋巴细胞和/或干细胞)的mnc。

为了自动采集mnc，com.系统包括下述检测器装置：该检测器装置包括光学传感器，该光学传感器检测到细胞通过该传感器并且触发处理器装置以开始对血沉棕黄层中所包含的靶细胞(淋巴细胞和/或干细胞)进行采集。

然而，现存的常规系统具有下述缺点：血沉棕黄层的量可能非常少并且所采集的靶细胞部分可能受到太多红细胞的污染。这是因为：对靶细胞的采集是根据预定量以常规的方式执行的，但是在靶细胞的采集期间当红细胞的内容物在血沉棕黄层流中增加时，靶细胞的采集不是自动停止的。

技术实现要素：

因此，本发明的目的是改进从全血中自动采集靶细胞(淋巴细胞和干细胞)的程序，并且因此克服现有技术的缺点，其中，所述靶细胞被包含在血沉棕黄层中。

该问题通过包括根据权利要求1的步骤的方法而解决。

具体地，根据本发明的用于从全血中分离淋巴细胞和/或干细胞的方法在自动血液细胞分离装置中执行。

根据本发明的自动血液细胞分离装置适当地是连续流分离器，该连续流分离器在被称为自动mnc的新的完全自动的采集系统的情况下以间歇采集循环工作，所述新的完全自动的采集系统具有用以采集干细胞和/或淋巴细胞的子程序。患者/供血者的特征(体重、身高和性别)以及细胞预计数(白细胞浓度、cd34+细胞浓度以及红细胞比容百分比)被登记到细胞分离器的菜单中。基于这些值，该装置计算最优采集参数(循环量、血沉棕黄层量、处理的血液量)。可以通过修改循环次数来对所需产量进行调整。

每个循环包括以下三个自动阶段：

1.在分离阶段期间，全血在分离室中被分离成红细胞层、被称为血沉棕黄层的mnc(单核的细胞)层、以及富含血小板的血浆(prp)。在红细胞和prp直接回流到患者/供血者体内的同时，mnc层在分离室内沉积在被光学摄像系统控制的预定位置中。成熟的粒细胞处于红细胞层内。

2.在达到了循环量之后，溢出阶段开始：mnc层经由从分离室排出的血浆而被泵送到对采集夹进行控制的光学传感器。

3.当该传感器检测到细胞时，该传感器使溢出阶段自动地停止并且立即开始血沉棕黄层阶段：传感器关闭通向患者的路径并且打开通向采集容器的路径。

根据本发明的自动血液细胞分离装置总体上包括具有图形用户界面(giu)的前面板、泵、自动夹和检测器装置、用于附接生理盐水袋和抗凝剂袋的静脉输液架、灌注袋、以及用于靶细胞和血浆的采集容器，该检测器装置包括用于对流体流进行监测的光学传感器。自动血液细胞分离装置还包括离心室，该离心室包括具有用以安置室保持器的机构的转子，该室保持器用于对用于从全血中自动分离血液成分的分离室进行保持。分离室和容器通过管线系统彼此连接。泵优选地是蠕动泵，并且泵将血液、血液成分和溶液输送在自动血液细胞分离装置的上述部件之间。自动夹被自动血液细胞分离装置的处理器装置控制，并且自动夹有助于将管线系统中的流体流导引至安装在自动血液细胞分离装置上的管线系统的预期部分。

在血液被供应至安装在自动血液分离系统上的管线套件之后，红细胞和血浆部分在离心单元的分离室中进行分离。在该步骤期间，生理盐水溶液被从分离室导流，并且形成了包含红细胞的外层和包含血浆的内层。在分离室中，血沉棕黄层作为另一层积聚在红细胞与血浆部分之间。随后，在所谓的凝结阶段中，在开始进行溢出之前，血沉棕黄层在分离室中恰当地定位。

红细胞外层与血浆内层之间的血沉棕黄层在自动血液细胞分离装置的分离室中的位置适当地被监测装置来监测，该监测装置包括位于分离室上的八孔印记、以及光学传感器，该光学传感器适当地是一种摄像系统。

在溢出阶段期间，进入到分离室中的血液的特定流速和从室中流出的血浆的特定流速造成分离室内的负压，该负压支持将血沉棕黄层从室中移除并将该血沉棕黄层泵送到血浆管线中。在随后的血沉棕黄层阶段期间，使血沉棕黄层和血浆部分溢出至自动血液细胞分离装置的前面板，并且靶细胞(淋巴细胞和/或干细胞)被泵送到采集容器中。

因此，根据本发明的用于从全血中分离淋巴细胞和/或干细胞的方法总体上包括以下步骤：

-将血液供应至安装在自动血液细胞分离装置上的管线套件；

-在位于离心单元中的分离室中分离红细胞和血浆部分，以及在分离室中将血沉棕黄层积聚在红细胞与血浆部分之间；

-在分离室中使血沉棕黄层部分凝结；

-将血沉棕黄层和血浆部分溢出到位于自动血液细胞分离装置的前面板处的传感器；

-将淋巴细胞和/或干细胞转移并采集到采集容器中。

在另一实施方式中，根据本发明的用于从全血中分离淋巴细胞和/或干细胞的方法可以包括以下步骤：

-用生理盐水溶液和抗凝血剂溶液灌注安装在自动血液细胞分离装置上的管线套件。

适当地，在将血液供应至管线套件之前，该灌注步骤被执行为第一步骤。管线套件优选地用生理盐水溶液和抗凝血剂溶液灌注，以便使任何空气从血液分离系统中排出并且以便防止血液凝结并防止血液受到空气接触，所述血液将被分离成血液的各成分。

本发明的方法的优点在于，淋巴细胞和/或干细胞可以在所采集的产品受到红细胞的污染减少的情况下以自动的方式进行采集。为了防止用本发明的方法自动采集的淋巴细胞和/或干细胞受到污染，应用至少两个准则，以用于将靶细胞转移并采集到采集容器中。作为第一准则，在管线中对流体流的浊度进行监测，该管线将分离室与用于采集血沉棕黄层的采集容器连接。在溢出开始之后，包含靶细胞的血沉棕黄层首先被从分离室转移至位于自动血液细胞分离装置的前面板处的传感器，随后对红细胞部分进行转移。

该传感器是根据本发明的检测装置的一部分，该传感器是位于com.装置处的所谓的溢出检测器。

在本发明的优选实施方式中，当流体流即血浆部分的浊度增加时，开始将靶细胞转移到采集容器中。血浆流的浊度的该增加表示了：除了血小板被包含在流体流中之外，靶细胞(淋巴细胞和/或干细胞)也被包含在流体流中。只要在流体流中识别到这种增加的浊度，则将靶细胞转移到采集容器中。

还期望的是，对未被血小板污染的靶细胞(淋巴细胞和/或干细胞)部分——即具有计数减少的血小板或基本上不含血小板的靶细胞(淋巴细胞和/或干细胞)部分——进行采集。当在管线中除了对流体流的浊度进行监测之外还对流体流的颜色、优选地对流体流的白色进行监测时，具有计数减少的血小板的靶细胞部分可以被采集，其中，该管线将分离室与采集容器连接。流体流首先具有略微淡黄的颜色。在“白色”的血沉棕黄层通过传感器时，该流体流的淡黄颜色下降。白色的血沉棕黄层指示出在所监测的流体流中存在血小板。血小板部分的结束由流体流的颜色增加来表示，该流体流现在包含具有计数减少的血小板或基本上不含血小板的淋巴细胞和/或干细胞。因此，在白色的血沉棕黄层已经通过溢出检测器之后在流体流的浊度和颜色增加时，立即开始对具有计数减少的血小板的淋巴细胞和/或干细胞进行转移和采集。

根据本发明，当流体流的颜色——优选地红色——达到预定阈值时，靶细胞在采集容器中的转移和采集被自动停止。流体流中的红色的这种增加指示的是：现在红细胞部分从分离室中溢出至位于自动血液细胞分离装置的前面板处的传感器。

因此，作为第二准则，对流体流的颜色进行监测、优选地对流体流中的红色进行监测。

因此，在本发明的方法的更优选的实施方式中，存在适用于将靶细胞转移并采集到采集容器中的至少两个准则，其中：

-作为第一准则，对流体流的浊度进行监测，并且当流体流的浊度增加时开始将靶细胞转移到采集容器中；以及

-作为第二准则，对流体流的颜色进行监测、优选地对流体流中的红色进行监测，并且当在流体流中达到红色预定阈值时，终止将靶细胞转移到采集容器中。

在本发明的方法的更优选的实施方式中，当将对具有计数减少的血小板的靶细胞部分进行采集时，存在应用于将靶细胞转移并采集到采集容器中的以下准则，其中：

-作为第一准则，对流体流的浊度和颜色进行监测、优选地对流体流的白色进行监测，并且当流体流的浊度增加且在白色的血沉棕黄层已经通过传感器之后流体流的颜色增加时开始将靶细胞转移到采集容器中；以及

-作为第二准则，对流体流的颜色进行监测、优选地对流体流中的红色进行监测，并且当在流体流中达到红色预定阈值时，终止将靶细胞转移到采集容器中。

为了在溢出阶段和靶细胞采集阶段期间对流体流的浊度和颜色进行监测，根据本发明的自动血液细胞分离装置包括检测器装置。该检测器装置包括光学传感器，该光学传感器包括：红色发射led(发光二极管)，其用于浊度测量；以及绿色发射led，其用于测量血浆和/或血沉棕黄层流中由红细胞对所发出的绿光的吸收。在本发明的优选实施方式中，由光电晶体管对传输通过流体流的光以及发射到后部的光二者进行检测，并且后方测量部段用作能够对所述发射led的老化效应和温度漂移进行补偿的基准测量分支。

流体流的红色与红细胞比容值相对应。因此，当由溢出检测器中所包括的光学传感器在流体流中测量到红色的预定阈值时，靶细胞采集被终止，其中，所述红色对应于一定的红细胞比容值。更优选地，当由溢出检测器中所包括的光学传感器测量的流体流中的红色达到与下述红细胞比容值相对应的阈值时靶细胞采集被终止：该红细胞比容值高达25％，优选地高达20％或15％，更优选地高达14％、13％、12％、11％或10％，最优选地高达9％、8％、7％、6％或5％。

甚至更优选地，当在对干细胞进行采集时在采集容器中所采集的产品的红细胞比容达到10％、9％或8％的值的情况下，靶细胞采集可以被终止，并且当在对淋巴细胞进行采集时在采集容器中所采集的产品的红细胞比容达到5％、4％、3％或2％的值的情况下，靶细胞采集可以被终止。

红细胞比容(hct)值是红细胞在血液中的体积百分比(体积％)。

当在流体流中所测量的红色具有与低于上述预定百分比的红细胞比容的值时，靶细胞的采集不会被终止。当达到与预定红细胞比容值相对应的红色阈值时，将靶细胞的采集终止确保了：可以有效地防止所采集的靶细胞部分受红细胞的污染。

本发明的方法可以以若干循环执行。这确保了可以从患者/供血者体内采集血沉棕黄层中的足够量的靶细胞。

通常，在溢出夹与溢出检测器之间存在一定的基于结构的距离。当在溢出检测器中所包括的光学传感器已经检测到与预定阈值相对应的红色之后溢出夹立即将通向采集容器的管关闭时，溢出夹与溢出检测器之间的靶细胞将丢失。

因此，在另一优选实施方式中，为了避免靶细胞的这种丢失，在由溢出检测器的光学传感器检测到红色阈值之后并且在对包含靶细胞的额外预定体积的血沉棕黄层进行采集之后，靶细胞采集被终止。适当地，血沉棕黄层的该额外采集的体积的范围为0ml至5ml、优选地为0ml至4ml、更优选地为0ml至3ml、最优选地为0ml至2ml或1ml至2ml。

当本发明的方法被执行若干循环时，在由溢出检测器检测到红色阈值之后、但是在靶细胞的采集终止之前，包含靶细胞的所述额外体积的血沉棕黄层被在前五个至十个循环(大约总程序的一半)内进行采集。在所述程序的后半中，该体积通常减小、优选地减小50％，因为在所述程序的前半期间，血沉棕黄层的体积通常减小。该实施方式具有以下优点：可以有效地防止靶细胞部分例如受到红细胞的污染。

因此，在本发明的优选实施方式中，用本发明的方法所采集的靶细胞部分大量包含淋巴细胞和/或干细胞。“大量包含淋巴细胞”指的是粒细胞的细胞计数在较低范围内，即指的是用本发明的方法所采集的淋巴细胞和/或干细胞基本上不含粒细胞。在本发明的优选实施方式中，“大量包含淋巴细胞”指的是粒细胞和血小板的细胞计数在较低范围内，即指的是用本发明的方法所采集的淋巴细胞和/或干细胞具有计数减少的粒细胞和血小板、或者基本上不含粒细胞和血小板。

利用所采集的靶细胞部分的红细胞比容值可以估计所采集的靶细胞部分受到红细胞的污染。由delfante等人在临床血浆分离交换术杂志2006年第21期的第227页至第232页中已经研究了部署有常规自动mnc程序的com.装置(fresenius)。利用该方法从患者和供血者体内所获得的干细胞采集物(即，血沉棕黄层采集物)分别具有10.9％和9.2％的红细胞比容值。利用本发明的方法能够提供下述靶细胞采集物：所述靶细胞采集物在干细胞被采集作为产品时具有低于10％、9％或8％的红细胞比容值，并且所述靶细胞采集物在淋巴细胞被采集作为产品时具有低于5％、4％、3％或2％的红细胞比容值。

在操作模式下，自动血液细胞分离装置直接连接至供血者/患者，并且要被分离的血液经由针从供血者/患者的静脉获得并被直接供应至自动血液细胞分离装置。分离了的血液的成分——比如在该操作模式下的血浆和红细胞——经由插入到患者/供血者静脉中的第二针通过相应的管线(具有两个不同的静脉穿刺部位的双针程序)被重新输注至供血者/患者体内。

根据本发明的自动血液细胞分离装置还可以以“离线”模式进行操作。在该操作模式下，自动血液细胞分离装置不连接至患者。血液分离是基于在执行根据本发明的血液分离方法之前早已从患者体内采集的血液样本而执行的。血液样本然后被提供在血液袋中，所述血液袋经由相应的管线连接至自动血液细胞分离装置。类似地，不想要的血液成分——比如血浆和红细胞——不会被重新输注到患者体内，而是被采集在相应的采集容器中。

在另一优选实施方式中，根据本发明的自动血液细胞分离装置包括溢出检测器，该溢出检测器包括光学传感器，在分离室中开始进行溢出之后该光学传感器对前面板的管线中的流体流的浊度进行监测。因此，通过利用溢出检测器，可识别何时靶细胞存在于从分离室中溢出的血浆中。通常，根据自动血液细胞分离装置的操作模式，血浆部分被重新输注到患者体内、或者作为副产品而部分地被采集在采集容器中。溢出检测器触发自动夹——即所谓的血浆采集夹——中的一个自动夹，以改变该自动夹的位置并将流体流从使血浆“重新输注”位置重新导引成使血浆“转移并采集”到血浆采集容器中的位置。

在本发明的特别优选的实施方式中，不仅由溢出检测器的光学传感器对在分离室中开始溢出之后的流体流中的浊度进行监测，而且另外地，由同一光学传感器对流体流的颜色进行监测、特别地对流体流的红色进行监测。

自动血液细胞分离装置还包括处理器装置，该处理器装置接收来自溢出检测器的信号并且该处理器装置触发溢出夹以改变该溢出夹的位置。

因此，在本发明的方法的另一优选实施方式中，当在分离室中开始溢出之后流体流的浊度升高时并且当在包含血小板的白色的血沉棕黄层已经通过溢出检测器中所包括的传感器之后流体流的颜色增加时，溢出检测器向处理器装置触发一个信号；并且，处理器装置通过将溢出夹向相应的靶细胞采集容器的方向打开而对包含靶细胞(淋巴细胞和/或干细胞)的血沉棕黄层的转移和采集的开始进行触发。

在本发明的方法的再一优选实施方式中，只要达到流体流——即血沉棕黄层——的红色预定阈值，则溢出检测器再次向处理器装置触发一个信号，并且处理器装置通过改变溢出夹的位置而对靶细胞在靶细胞采集容器中的转移和采集的终止进行触发，从而将随后溢出的红细胞重新输注到供血者/患者体内、或者将随后溢出的红细胞转移到相应的采集容器中。

本发明的方法具有若干优点。特别地，现有技术的方法的所有缺点以及常规的自动细胞分离系统的所有缺点可以被优化。与靶细胞的采集是手动地停止、即由使用者按下自动细胞分离装置的“停止阶段”按钮而停止的常规方法相比，或者与在采集了默认体积的包含靶细胞的血沉棕黄层之后将靶细胞的采集手动地停止相比，溢出检测器现在使血沉棕黄层阶段自动地停止。靶细胞部分的所采集的体积取决于流体流中的红细胞比容。因此，确保了：在当重新输注开始时血沉棕黄层聚集尾物被推入到靶细胞采集容器中之前，红细胞回流到供血者/患者体内。还可以进一步确保的是，采集最大产量的靶细胞。

通过本发明的方法，能够在自动程序中采集质量比以常规方法所采集的质量更高的靶细胞。因此，在另一实施方式中，本发明涉及能够利用本发明的方法所获得的靶细胞，优选地涉及能够用本发明的方法所获得的淋巴细胞、单核细胞和/或干细胞。

根据本发明的方法所分离和采集的靶细胞——特别地淋巴细胞和/或干细胞——可以在治疗中使用。因此，本发明在另外实施方式中提供了利用本发明的方法所采集的淋巴细胞和/或干细胞在治疗中的使用。利用本发明的方法所采集的干细胞对于在光化学疗法或高剂量化学疗法之后治疗特定癌症是特别有用的，其中，通过光化学疗法或高剂量化学疗法，患者的血流中的干细胞受到不可逆地损害。利用本发明的方法所采集的淋巴细胞对于供者淋巴细胞输注是特别有用的、并且/或者对于皮肤疾病和移植物抗宿主病的治疗是特别有用的。

本发明的目的还通过用于在自动程序中从全血中分离血沉棕黄层中的淋巴细胞和/或干细胞的血液细胞分离装置而实现，该血液细胞分离装置包括：

-泵部分，该泵部分用于将流体泵送通过安装在自动血液细胞分离装置处的管线套件；

-离心室，该离心室包括用于从全血中自动分离血沉棕黄层的分离室；

-检测器装置，该检测器装置包括光学传感器，该光学传感器用于对指示出在血浆流中存在细胞的测量值进行测量并且用于对指示出在血浆/血沉棕黄层管中存在红细胞的测量值进行测量；

-自动夹，该自动夹用于将血浆流导引朝向“重新输注”方向并且用于将血沉棕黄层流导引朝向“采集”方向；以及

-处理器装置，该处理器装置用于对自动夹进行控制，该处理器装置配置成在由检测器装置在血浆/血沉棕黄层管中检测到靶细胞——比如淋巴细胞和/或干细胞——的情况下将自动夹的位置切换成处于“采集”方向，并且该处理器装置还配置成在由检测器装置在血浆/血沉棕黄层管中检测到红细胞情况下将自动夹的位置切换成处于“重新输注”方向。

在本文中，为了将血沉棕黄层转移并采集到采集容器中，应用至少两个准则，其中：

-作为第一准则，对血浆/血沉棕黄层管中的流体流的浊度进行监测并且当血浆/血沉棕黄层管中的流体流的浊度升高时开始将靶细胞转移到靶细胞采集容器中；以及

-作为第二准则，对血浆/血沉棕黄层管中的血沉棕黄层流的颜色进行监测、优选地对血浆/血沉棕黄层管中的红色进行监测，并且当达到血浆/血沉棕黄层管中的流体流的红色预定阈值时，终止将靶细胞转移到靶细胞采集容器中。

当将对具有减少计数的血小板的靶细胞部分进行采集时，为了将血沉棕黄层转移并采集到采集容器中，应用以下准则，其中：

-作为第一准则，对流体流的浊度和颜色进行监测、优选地对流体流的白色进行监测，并且当流体流的浊度增加且在白色的血沉棕黄层已经通过传感器之后流体流的颜色增加时开始将靶细胞转移到采集容器中；以及

-作为第二准则，对血浆/血沉棕黄层管中的血沉棕黄层流的颜色进行监测、优选地对血沉棕黄层流的红色进行监测，并且当达到血浆/血沉棕黄层管中的流体流的红色预定阈值时，终止将靶细胞转移到靶细胞采集容器中。

所述方法的上面所描述的优点和有利实施方式同样地适用于血液细胞分离装置，使得血液细胞分离装置将涉及上述内容。

附图说明

随后将关于在附图中所示出的实施方式对本发明的基本构思进行更详细地描述。在附图中：

图1示出了被用在根据本发明的方法中的自动细胞分离装置的总体视图；

图2示出了自动细胞分离装置的前面板的详细视图；

图3示出了作为自动细胞分离装置的一部分的溢出检测器和溢出夹；

图4示出了分离室的主要构造方案；

图5至图6示出了在分离室中进行自动血液分离的各阶段；

图7示意性地示出了淋巴细胞采集程序的循环；

图8示出了由溢出检测器中所包括的光学传感器对流体流的浊度和红色进行监测而产生的信号；

图9示出了当具有计数减少的血小板或基本上不包含血小板的靶细胞将被采集时由溢出检测器中所包括的光学传感器对流体流的浊度和颜色进行监测而产生的信号。

具体实施方式

图1示出了自动血液细胞分离装置1的总体组件，该自动血液细胞分离装置1包括静脉输液架2、打印机3、供血者显示器4、轮5、自动夹10、泵部分20、离心室40、以及前面板100。

静脉输液架2被构造成对采集袋和贮存袋进行附接，所述采集袋和贮存袋比如为靶细胞采集容器、或者例如为生理盐水袋和抗凝血剂贮存袋。

打印机3允许对在自动血液分离期间的整个程序顺序进行记录。适当地，在该程序期间所显示的流量和流速随着时间而被打印出。用于分离的位置在开始该分离程序时被打印，并且实际的值在该程序期间周期性地进行打印，例如每1000ml的全血就进行打印。

供血者显示器4适当地是指示出供血者/患者的信息——比如时间、剩余治疗时间以及警示——的双线式led显示器。

离心室40包括离心单元和用于执行本发明的方法的分离室。

图2示出了血液细胞分离装置1的前面板100的详细视图。前面板100还包括图形用户界面101，该图形用户界面101适当地是彩色lcd显示器。血泵部分20包括acd泵21、全血泵22、血浆泵23、以及细胞泵24，该全血泵22将抗凝血的全血输送至离心室40，该血浆泵23在分离室中建立界面位置(血沉棕黄层的位置)并且与血泵一起在采集阶段期间在分离室中保持该界面位置。

自动血液细胞分离装置可以通过按下按钮102而打开，并且该自动血液细胞分离装置可以通过按下按钮103而关闭。入口管线、出口管线(以及在白细胞分离术中不使用的吸附器柱)中的压力通过压力监测器104来监测。为了对出口管线中的压力进行控制，前面板包括用于对回流压力进行测量的压力测量端口128、用于对入口压力进行测量的压力测量端口129(以及用于对柱的跨膜压力进行测量的另一压力测量端口130)。当执行根据本发明的方法时，安装在自动血液细胞分离装置1上的套件首先用来自贮存袋52的抗凝血溶液进行灌注并且用来自袋51的生理盐水溶液进行灌注，其中，所述两种溶液通过操作acd泵21、全血泵22和血浆泵23而被转移至管线套件，并且其中，抗凝血溶液经由灌注溶液管125而被提供至装置1并且生理盐水溶液经由生理盐水管126和126’而被提供至套件。为了确保对抗凝血溶液的无空气式输送，抗凝血溶液被输送通过acd滴注器131。在对安装在自动血液细胞分离装置1上的管线套件进行灌注之后，管线套件可以经由针121和123连接至供血者/患者(供血者/患者的外周静脉导管)。替代性地，具有已经从患者体内所获得的血液样品的贮存袋可以经由血液管120连接至装置1，并且任何不想要的血液成分可以经由管122而被采集在相应的采集容器中。

然后，血液被从供血者/患者体内经由血液管120供应至安装在自动血液细胞分离装置1上的套件。患者的血液利用全血泵22被泵送到离心室40中。作为离心室40的一部分的分离室在该阶段中用灌注溶液填充。借助于全血泵22将患者的血液泵送到分离室中导致了：来自分离室的灌注溶液经由导流管132而导流到灌注袋55中。在分离室中，全血被分离成红细胞、血沉棕黄层、以及血浆部分。当在分离室中建立这些成分的分离层时，通过使血浆泵23加速并减小全血的流速而使血沉棕黄层溢出至位于前面板100处的溢出传感器。血沉棕黄层被泵送通过管124。流体流经过溢出检测器115和溢出夹110。溢出检测器115对管124中经过的血浆流的浊度进行监测。血浆通过溢出夹110，该溢出夹110在“回流”方向上打开，这意味着从全血中已分离的血浆连同红细胞一起经由管134和回流管122而被再次转移到患者体内。为了确保回流到患者体内的血浆和红细胞不含空气，所述成分经过空气检测器112的滴注器116。当溢出检测器115中所包括的光学传感器检测到管124中的血浆流的浊度增加时，该光学传感器向处理器装置133触发一个信号，该处理器装置133将溢出夹110触发成切换处于“采集”方向。在管124中所测量的血浆流的浊度的增加表示的是：靶细胞部分——即包含淋巴细胞和/或干细胞的单核细胞——现在正在通过溢出检测器115。将溢出夹110从“回流”切换至“采集”导致了经由血沉棕黄层管124’将血沉棕黄层中所包含的淋巴细胞和/或干细胞采集在采集容器53和54中。只要管124中的血沉棕黄层流的颜色不达到红色预定阈值，则对淋巴细胞和/或干细胞进行采集，其中，管124中的血沉棕黄层流的颜色也由溢出检测器115中所包括的光学传感器进行监测。当溢出检测器115测量到与预定阈值相对应的红色时，该溢出检测器115向处理器装置133触发一个信号，该处理器装置133又将溢出夹110触发成从“采集”切换回“回流”。在管124中达到红色预定阈值意味着血沉棕黄层现在已经通过并且意味着红细胞处于管124中。因此，淋巴细胞和/或干细胞的采集被自动地停止，而不需要使用者干预。

因此，溢出检测器115对血浆中的相关介质或安装在自动血液细胞分离装置1上的血沉棕黄层管124中的相关介质的浊度和颜色二者进行测量。更具体地，溢出检测器115包括具有交替地启用的红色发射led和绿色发射led的光学传感器。传输通过管中的介质的光和发射到后部的光二者都由光电晶体管来检测。后面的测量部分用作能够对所述发射led的老化效应和温度漂移进行补偿的基准测量分支。来自光电晶体管的信号被两个ad转换器转换并且经由spi总线被发送至微控制器。由于各个传感器的公差，因此对于特定传感器而言溢出检测器115必须被校准。所测量的校准数据经由spi总线被保存在电可擦只读存储器(eeprom)中。红色led被用于对管124中的流体流的浊度进行测量并且绿色led被用于对管124中的流体流的颜色进行测量，特别地，在管124中测量由红细胞对所发射绿光的吸收。

自动血液细胞分离装置1还可以包括生理盐水入口管线夹106和生理盐水回流管线夹107，该生理盐水入口管线夹106和该生理盐水回流管线夹107对生理盐水的供应进行控制，以用于灌注并用于在停止状况中保持静脉开放功能、并且用于重新输注。血浆采集夹108是对将可选的另外的血浆采集到采集容器56中进行控制的自动夹。导流夹109是用于对生理盐水导流进行控制的自动夹。回流夹105是在出现警报的情况下将供血者/患者的循环与自动血液细胞分离装置1的循环分开的自动防故障磁体夹。该夹适当地包括用于对回流管线进行监测的一体式传感器。

acd检测器111起作用为用于对抗凝剂流进行监测的滴落计数器、hb/hct检测器113对装置1中的任何可能的溶血进行检测以及对在分离期间使血红蛋白进入已被分离的血浆的错误进行检测。置换流体结束检测器114对置换流体管线125中的空气进行检测。

图3更详细地示出了自动血液细胞分离装置的溢出检测器115和溢出夹110。流体流(血浆或血沉棕黄层)经由管124被输送通过溢出检测器115和溢出夹110。下部箭头表示了进入溢出检测器中的流动方向f。当溢出夹110被切换成处于“回流”方向时，血浆流如由箭头r所指示的被重新输注到患者体内，从而通过滴注器116，以便防止该重新输注的血液流中出现任何空气或气泡。当溢出夹110被切换成处于如由箭头c所指示的“采集”方向时，血沉棕黄层中包含的淋巴细胞和/或干细胞经由管124’被输送到采集容器53中(也参见图2)。

如从图3中可以看到的，在溢出夹110与溢出检测器115之间存在一定的基于结构的距离。当在溢出检测器115已经测量到与预定阈值相对应的红色之后溢出夹110立即将通向采集容器53的管124’关闭时，介于溢出检测器115与溢出夹110之间的靶细胞将丢失。

在根据本发明的自动采集程序的优选实施方式中，在由溢出检测器115检测到红色预定阈值之后并且在允许包含靶细胞的额外默认体积的血沉棕黄层通过溢出夹110之后，淋巴细胞和/或干细胞的采集被终止，以便防止靶细胞的丢失。适当地，血沉棕黄层的这一额外体积的范围为0ml至5ml、优选地为0ml至4ml、更优选地为0ml至3ml、最优选地为0ml至2ml或1ml至2ml。

图4示出了分离室30的示意性图示，该分离室30是空的。分离室30包括血液端口31、内部血浆端口32、以及外部红细胞端口33。分离室33还包括具有8个孔的印记34，以用于对界面位置进行监测。优选地，这些监测窗口34以上升方式布置。更优选地，分离单元30包括以上升方式布置的八个监测孔。

图5和图6示出了在已填充的分离室30中对全血进行分离的程序的不同阶段。当全血被泵送通过离心单元40、特别是通过血液端口31被泵送到分离室30中时，由所供应的血液使灌注溶液35导流通过内部血浆端口32，并且形成外红细胞层37和内血浆层36(图5)。全血被血泵22连续地泵送到分离室中，血浆通过内部血浆端口32而被连续地移除，并且红细胞经由外部红细胞端口33而连续地排出。血沉棕黄层38积聚在红细胞层37与血浆层36之间(图5)。血沉棕黄层的位置由监测装置来监测，该监测装置包括8孔式印记34和摄像机(未示出)。

图6示出了血沉棕黄层从分离室30中经由内部血浆端口32沿通向自动血液细胞分离装置1的溢出检测器115(如由虚线箭头所指示的)和溢出夹110的方向溢出的晚期阶段。对血沉棕黄层进行转移由血浆泵23来执行。

图7示出了淋巴细胞或干细胞的自动采集程序中的一个循环。在左手侧的框中的“采集”意指在本发明的自动血液细胞分离装置的离心室的分离单元中对红细胞、血浆和血沉棕黄层部分进行分离和凝结。在溢出阶段开始之后，由溢出检测器115对流体流的浊度进行监测。当溢出检测器检测到浊度增加并且在包含血小板的白色的血沉棕黄层通过之后检测到流体流的颜色增加时，信号被传输至处理器装置133，该处理器装置133又触发溢出夹110以将溢出夹110的位置改变成处于对包含淋巴细胞和/或干细胞的血沉棕黄层进行“采集”的方向。对淋巴细胞和/或干细胞的采集还由溢出检测器来监测。当溢出检测器检测到流体流中的红色预定阈值时，信号被传输至处理器装置并且该处理器装置触发溢出夹以将溢出夹的位置切换到处于“重新输注”方向，这使淋巴细胞和/或干细胞的采集终止并且使不想要的血液成分的剩余部分被重新输注到供血者/患者体内。如果要采集更多的淋巴细胞和/或干细胞，则该循环可以重复若干次。

通过利用改进的自动血液细胞分离装置1和本发明的方法从来自供血者/患者的全血中分离并采集干细胞已经证明了本发明的方法的优点。与容积驱动式溢出阶段和血沉棕黄层阶段相比，所采集的干细胞的红细胞比容值减小：特别地，在所采集的产品(干细胞)中所测量的红细胞比容为3.8％。对第二患者/供血者重复同一程序，并且在该情况下在所采集的产品(干细胞)中所测量的红细胞比容为4.2％。因此，与由delfante等人在临床血浆分离交换术杂志2006年第21期第227页至第232页——其中，从患者和供血者身上所采集的干细胞部分中的红细胞比容值为10.9％和9.2％——的内容相比，利用血液细胞分离装置1和根据本发明的方法所采集的干细胞受到红细胞的污染已减少。

图8示出了使在本发明的方法中所使用的溢出检测器中所包括的光学传感器的信号可视化的流程图。溢出检测器对由血沉棕黄层中所包含的血浆和/或细胞所引起的吸收的变化进行测量。虚线表示在淋巴细胞采集期间的血流量。黑色峰值分别表示血浆的浊度(由箭头d所指示的)和血沉棕黄层的红色(由箭头e所指示的)。

图9示出了当对具有血小板计数减少的靶细胞部分进行采集时使在本发明的方法中所使用的溢出检测器中所包括的光学传感器的信号可视化的流程图。溢出检测器对由血沉棕黄层中所包含的血浆、血小板和靶细胞所引起的吸收的变化进行测量。首先，传感器的值被设定为0(g)。在每次循环期间执行校准。当由传感器检测到包含血小板部分的白色的血沉棕黄层(h)时，颜色信号下降。在阶段g和阶段h期间，溢出夹110(参见图3)处于“重新输注”位置。流体流的颜色的增加表示了血小板部分的结束以及在流体流中存在靶细胞(i)。溢出夹110(参见图3)现在被切换到“采集”位置并且靶细胞被转移至采集容器53且被采集在采集容器53中。在溢出检测器115已经测量到与预定阈值(l)相对应的红色之后溢出夹110(参见图3)立即被切换到“重新输注”位置，并且如在图3中所描述的，对额外体积的靶细胞进行采集。

附图标记列表

1自动血液细胞分离装置，单采装置

2静脉输液架

3打印机

4供血者显示器

5轮

10自动阀/夹

20泵部分

21acd泵，血浆重新循环泵

22全血泵

23血浆泵

24细胞泵

30分离室

31血液端口

32内部血浆端口

33外部红细胞端口

348孔式印记

35生理盐水

36血浆

37红细胞

38血沉棕黄层

40包括分离室30的离心室

50采集/储存/贮存袋和容器

51生理盐水袋

52抗凝血剂袋

53、54采集容器

55灌注袋

56采集容器

100前面板

101具有显示器和操作键的图形用户界面(gui)

102“开”按钮

103“关”按钮

104压力监测器

105回流夹

106生理盐水入口夹

107生理盐水出口管线夹

108血浆采集夹

109导流夹

110溢出夹

111acd检测器

112空气检测器

113血浆hb/hct检测器

114置换流体检测器

115溢出检测器

116滴注器

120血液管

121入口针

122通向患者的出口管

123出口针

124血浆管/血沉棕黄层管

124’血沉棕黄层管

125acd管

126、126’生理盐水管

127acd泵

128用于关于回流压力的压力传感器的连接器

129用于关于入口压力的压力传感器的连接器

130通向跨膜压力传感器p3的连接器

131acd滴注器

132导流管

133处理器装置

134将溢出检测器115与滴注器116连接的管

f流体流的填充方向

c流体流的“采集”方向

r流体流的“重新输注”方向

d浊度峰值

e颜色峰值

g值为零的颜色值

h白色的血沉棕黄层的颜色值

i在靶细胞部分开始时的颜色值

l与预定阈值(l)相对应的红色的值