使用量子点靶向和操纵线粒体功能的探针的制作方法

文档序号:17484970发布日期:2019-04-20 06:42阅读:421来源:国知局
使用量子点靶向和操纵线粒体功能的探针的制作方法

本文公开的实施方案涉及用于靶向和操纵线粒体功能的量子点纳米颗粒,以及使用这种量子点纳米颗粒靶向和操纵线粒体功能的方法。



背景技术:

线粒体是具有许多作用的细胞器,包括产生能量、产生热量、合成激素、调节代谢和钙、释放典型酶细胞色素c氧化酶(cox)、细胞凋亡、产生活性氧类(ros)稳态和衰老。最近,靶向线粒体已经被考虑用于各种疾病管理方案,包括败血症、寿命终期的急性器官衰竭、癌症、阿尔茨海默病,和糖尿病。参见,例如,karuetal.,life,62(8),607-610,2010;singeretal.,virulence,5(1),66-72,2014;wuetal.,antioxidants&redoxsignaling,20(5),733-745,2014;pathaniaetal.,adv.drugdeliveryrev.,61,1250-1275,2009;和d’souzaetal.,biochimicaetbiophysicaacta,1807,689-696,2011。

最近的研究提出,纳米颗粒具有在主要为溶酶体的亚细胞器中特异性积累的趋势。参见,例如,frohlich,internationaljournalofnanomedicine,october31,2012,5577-5591。还发现线粒体积累纳米颗粒。参见,例如,d’souzaetal.,biochimicaetbiophysicaacta1807(2011)689-696。

研究还提出,酶细胞色素c氧化酶(cox)被认为是可见光和近红外光(nir)区域的光接收器和光信号转换器。光照射导致cox活性增加,这导致可改变细胞稳态,和增加产生三磷酸腺苷(atp)、活性氧类(ros)、一氧化氮(no),和细胞内钙(ica2+)的一系列反应。参见,例如,karuetal.,multiplerolesofcytochromecoxidaseinmammaliancellsunderactionofredandir-aradiation,life,62(8),607-610,2010和tafuretal.,photomedicineandlasersurgery,volume26,number4,2008323-28。

制备和表征具有一定尺寸的颗粒受到了很多的关注,例如在2-50nm范围内,通常称为量子点(qds)或纳米晶体。这些研究主要是由于这些材料的尺寸可调的电子特性可用于例如光学和电子设备、太阳能电池、催化剂、发光二极管和一般空间照明。qds因其独特的光学、电子和化学性质而受到广泛研究,这些性质源于量子限制效应;随着半导体纳米颗粒的尺寸减小到玻尔半径的两倍以下,能量水平变得量子化,产生离散的能级。带隙随着粒径的减小而增加,导致尺寸可调的光学、电子和化学性质,例如尺寸依赖性的光致发光。

这种如明亮和高吸收性荧光团的量子点的出现为靶向和操纵线粒体功能提供了机会。

因此需要新的方法来靶向和操纵线粒体功能。



技术实现要素:

公开的实施方案包括可用于靶向线粒体功能的量子点纳米颗粒。通过操纵这种量子点纳米颗粒的光学和/或光伏特性,可以调节某些线粒体功能(例如,cox活性或膜电位)用于检测和标记目的和/或用于治疗目的。

在一个方面,本发明涉及用于靶向线粒体功能的量子点纳米颗粒。

在一个实施方案中,本文叙述的量子点纳米颗粒与功能性配体偶联,以允许调节(例如,减慢或停止)线粒体中的代谢活性。在一个实施方案中,量子点纳米颗粒包含核心半导体材料和外层,其中外层包含与功能性配体连接的官能化有机涂层,以允许线粒体中的代谢活性被调节(例如,减慢或停止)。

在一个实施方案中,量子点纳米颗粒与己糖激酶(hk)抑制剂偶联,例如2-脱氧葡萄糖(2dg)。hk酶负责醣酵解并与线粒体膜相关。醣酵解是癌细胞能量的主要来源。因此,量子点纳米颗粒可以具有三种分开或组合的功能:i)递送醣酵解抑制剂,例如己糖激酶(hk)抑制剂,例如2-脱氧葡萄糖(2dg);ii)活化cox,和iii)标记。

在一个实施方案中,纳米颗粒,通过直接在量子点纳米颗粒的无机表面上或在用于使纳米颗粒具有水溶性和生物相容性的有机晕状体层上的酰胺、酯、硫酯或硫醇锚定基团,与功能配体连接(例如,共价键合或物理键合(电荷或范德瓦尔斯力))。在一些实施方案中,水溶性qd纳米颗粒包括一种半导体材料的核和在一些实施方案中的至少一种不同半导体分子的壳,而在其他实施方案中,水溶性qd纳米颗粒包括合金半导体材料,其具有通过组分渐变合金化向外增加的带隙值。

在某些实施方案中,光响应量子点(qd)包括具有配体相互作用剂和表面改性配体的水溶性qd纳米颗粒。可以通过在包含六甲氧基甲基三聚氰胺的溶液中将配体相互作用剂和表面改性配体化学加成到qd来形成水溶性qd纳米颗粒。在特定实施方案中,配体相互作用剂是c8-20脂肪酸及其酯,而表面改性配体是单甲氧基聚环氧乙烷。

在某些实施方案中,水溶性纳米颗粒包括能够结合甲基化特异性结合配体的封端配体。在某些实施方案中,封端配体选自:硫醇、羧基、胺、磷化氢、氧化膦、膦酸、次膦酸、咪唑、oh、硫醚和杯芳烃基团。

在另一个实施方案中,纳米颗粒通过离子配对或范德瓦尔斯相互作用与功能配体结合。在一个实施方案中,纳米颗粒通过酰胺键与功能配体共价连接。

在一个实施方案中,量子点纳米颗粒偶联物包含:包含核心半导体材料的量子点和外层,其中外层包含有机涂层的晕状体(官能化有机涂层)以使颗粒具有水溶性和生物相容性,和功能性配体,以调节线粒体中的代谢活动。

在一个实施方案中,本文所述的任何量子点纳米颗粒经表面改性(例如,物理或化学涂覆和/或电荷改性)以增强量子点在线粒体附近或线粒体内的积累。合适的涂层包括,例如,线粒体配体,例如,由tebu-bio销售的抗线粒体抗体(目录号909-301-d79)、由tebu-bio销售的抗hsp60(t547)(目录号bs1179-50ul(50u1)和bs1179-100ul(100ul))、由tebu-bio销售的抗sod1(目录号mab10394)、由tebu-bio销售的抗grp75克隆s19-2(目录号mab6629)、由tebu-bio销售的抗细胞色素c(h19)(目录号bs1089-50ul(50ul)和bs1089-100ul(100ul))、三苯基鏻(tpp)及其衍生物。这些线粒体特异性配体一旦使用下面讨论的偶联化学与量子点纳米颗粒连接,就确保了量子点纳米颗粒在线粒体附近或内部的更特异性的积累。

在本文所述的任何量子点纳米颗粒的一个实施方案中,纳米颗粒包含ii-vi族材料、iii-v族材料、i-iii-vi族材料或其任何合金。

在另外的实施方案中,本文所述的任何量子点纳米颗粒还包含细胞摄取增强剂,(细胞穿透肽(cpps,如tat、rgd,或聚精氨酸)、组织渗透增强剂,(例如,皂苷、阳离子脂质、链球菌溶血素o(slo))或其组合。细胞摄取增强剂的实例包括,例如,反式激活转录激活因子(tat)、arg-gly-asp(rgd)三肽,或聚精氨酸肽。配体-纳米颗粒偶联物可以进一步包含其他已知的试剂,例如皂苷、阳离子脂质体或链球菌溶血素0,其可以增强细胞摄取。

另一方面,制备根据本文所述任何实施方案的量子点纳米颗粒的方法。在一个实施方案中,方法包括:i)将纳米颗粒与官能化配体偶联以得到官能化纳米颗粒偶联物,其中纳米颗粒包含由核心半导体材料和外层组成的量子点,其中外层包含羧基。

在一个实施方案中,偶联步骤在偶联剂存在下进行。在一个实施方案中,偶联步骤i)包括(a)使外层中的羧基与碳二亚胺连接体反应以活化羧基,和b)使活化的羧基与官能化配体(例如,配体上具有胺末端)反应。优选地,偶联剂是1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。

在另外的实施方案中,方法还包括:ii)纯化量子点纳米颗粒。在另外的实施方案中,方法还包括:iii)分离特异性结合纳米颗粒偶联物。在一个实施方案中,方法包括步骤i),ii)和iii)。

另一方面,本发明提供了一种操纵线粒体功能的方法。在一个实施方案中,方法包括i)将根据本文所述的任何实施方案的量子点纳米颗粒与线粒体相关联,并且任选地ii)用光源激发量子点纳米颗粒,从而产生光子和/或伏打电流(伏打能量)。在一个实施方案中,光子和/或伏打电流调节线粒体功能的反应性(例如,cox活性或膜电位)。

在一个实施方案中,产生的伏打电流(例如微电压)刺激细胞色素c氧化酶(cox)的释放,从而诱导细胞凋亡。在另一个实施方案中,产生的光子用例如580-860nm的光光调制cox的活性。

另一方面,本发明提供了调节cox或其亚单位或衍生物(例如刺激cox释放)活性的方法。在一个实施方案中,方法包括i)使根据本文所述任何实施方案的量子点纳米颗粒与线粒体接触,并任选地ii)用光源激发量子点纳米颗粒,并任选地iii)从量子点纳米颗粒产生光照射。在一个实施方案中,通过吸收光伏能量激活cox。在另一个实施方案中,通过吸收光能激活cox。在一个实施方案中,产生的伏打电流刺激cox的释放,任选地其中这引发细胞死亡。

另一方面,本发明提供了一种使线粒体膜去极化的方法(例如,由此诱导信号传导级联,例如,细胞凋亡,导致细胞死亡)。在一个实施方案中,方法包括i)使根据本文所述的任何实施方案的量子点纳米颗粒与线粒体接触,和ii)用光源激发量子点纳米颗粒,并任选地iii)从量子点纳米颗粒产生光照射。在一个实施方案中,线粒体膜通过光伏效应去极化。在一个实施方案中,这诱导细胞凋亡。

另一方面,本发明提供抑制醣酵解的方法。在一个实施方案中,方法包括i)使根据本文所述的任何实施方案的与己糖激酶(hk)抑制剂连接的量子点纳米颗粒与线粒体接触,和ii)用光源激发量子点纳米颗粒,并任选地iii)从量子点纳米颗粒产生光照射。在一个实施方案中,hk抑制剂是2-脱氧葡萄糖(2dg)。

附图说明

图1描绘了在5小时、24小时和48小时后小鼠胚胎干细胞中的量子点纳米颗粒的细胞质摄取。使用4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对核区域进行蓝色/绿色反染色,dapi是一种与dna中富含a-t的区域强烈结合的荧光染料。用量子点染色的细胞质区域用c表示,用dapi染色的核区域用n表示。(注:包含多个细胞的48小时图未经详尽标记。)

图2描绘了提出的在线粒体中量子点纳米颗粒相互作用的机制。

具体实施方式

本文公开了能够与线粒体关联并且能够发射光以激活某些线粒体途径的量子点(qds)。本文公开了与线粒体特异性结合配体偶联的量子点(qds),其具有足够接近线粒体以检测和操纵线粒体功能的能力。

缩写:在本申请中使用以下缩写:

dcc二环己基碳二亚胺

dcm二氯甲烷

dic二异丙基碳二亚胺

edc1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐

hmmm六甲氧基甲基三聚氰胺

in(ma)3铟肉豆蔻酸

qd量子点

sulfo-nhsn-羟基琥珀酰亚胺的磺基衍生物

smcc琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯

(tms)3p三(三甲基甲硅烷基)膦

为了便于理解本发明,并且为了避免在解释本文的权利要求时存在疑问,下面定义了许多术语。本文定义的术语具有本领域普通技术人员在与本发明相关的领域中通常理解的含义。除非在权利要求中概述,否则用于描述本发明的特定实施例的术语不限制本发明。

除非明确地如此定义,否则诸如一、一个和所述的术语目的不在指代单数实体,而是包括可以用于说明的特定示例的一般种类。当在权利要求和/或说明书中与包括结合使用时,术语一或一个的使用可以表示一个,但也可以与一个或多个、至少一个和/或一个或多个一致。

权利要求中术语或的使用用于表示和/或,除非明确指出将替代方案视为相互排斥。因此,除非另有说明,否则一组备选中的术语或表示所述组成员中的任何一个或组合。此外,除非明确指出将备选方案视为相互排斥,否则短语a、b和/或c表示具有单独的元素a、单独的元素b、单独的元素c,或a,b和c的任何组合的实施方案。

类似地,为避免疑问,除非另有明确说明将备选方案视为相互排斥,否则短语至少一个与项目列表相结合,意味着所述列表中的单个项目或所述项目的任何组合。例如,除非另有定义,否则短语a、b和c中的至少一个表示a、b、c中的至少一个,或a、b和c的任何组合。因此,除非另外定义,否则所述短语要求所列项目中的一个或多个,并且不一定不是全部。

术语包括(及其任何形式,例如包括和包括),具有(及其任何形式,例如具有和具有),包括(及其任何形式,例如包括和包括)或包含(及其任何形式,例如包含和包含)是包容性的或开放式的,并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤。

在说明书和权利要求书中使用的术语有效意味着足以提供或实现期望的、期待的,或预期的结果。

术语约或近似被定义为接近本领域普通技术人员理解的,并且在一个非限制性实施方案中,所述术语定义为在10%内、5%内、1%内,并且在某些方面在0.5%以内。

在某些实施方案中,线粒体特异性结合配体是识别线粒体特异性结合位点的抗体。如本文所用,术语抗体包括完整的免疫球蛋白分子以及其部分、片段和衍生物,例如fab、fab’、f(ab’)2、fv、fsc、cdr区,或能够结合抗原或表位的抗体的任何部分,包括双特异性嵌合抗体或将源自抗体的抗原结合结构域与另一种多肽结合。术语抗体包括单克隆抗体(mab)、嵌合抗体、人源化抗体,以及其通过任何已知技术提供的片段、部分、区域或衍生物,包括但不限于,酶促切割和重组技术。如本文所用的术语抗体还包括单结构域抗体(sdab)及其片段,其具有重链抗体的单个单体可变抗体结构域(vh)。缺乏可变轻链(vl)和恒定轻链(gl)结构域的sdab天然存在于骆驼利动物(vhh)和软骨鱼(vnar)中,并且有时被制药公司ablynx称为纳米抗体,该公司最初开发出在美洲驼中特异性抗原结合的sdab。修饰语单克隆表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的,并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

在其他实施方案中,线粒体特异性结合配体是识别甲基化dna碱基的适体。适体是结构上不同的rna或dna寡核苷酸(odns),其可以模拟蛋白质结合分子并且基于其独特的二级三维结构构象而不是通过成对核酸结合而表现出高(nm)结合亲和力。可通过高通量体外方法选择适体以结合靶分子。适体通常为抗体分子量的约1/10,并且提供复杂的三级折叠结构,其具有足够的识别表面积以与抗体竞争。

量子点(qds)是具有独特光学性质的荧光半导体纳米颗粒。qd表示特定的非常小尺寸形式的半导体材料,其中颗粒的尺寸和形状导致光激发的量子力学效应。通常,较大的qd(例如半径为56nm)将发射橙色或红色发射颜色的较长波长,较小的qd(例如半径为23nm)发出较短波长的蓝色和绿色,尽管具体的颜色和尺寸取决于所述qd的组成。量子点比任何常规荧光染料(如吲哚菁绿(icg))的亮度高约20倍,并且光稳定性高出许多倍。重要的是,由于qd的化学性质和纳米尺寸,qd停留时间较长。qd可以吸收和发射更强的光强度。在某些实施方案中,qd可配备有多于一种的结合标签,形成双特异性或三特异性纳米装置。qd的所述独特属性使得几种医疗应用能够满足未被满足的需求。

在本文提供的实施方案中,所述qd被官能化以呈现亲水外层或晕状体,其允许在水性环境中使用所述qd,例如在活细胞中的体内和体外应用。这种qd被称为水溶性qd。

在一个实施方案中,所述qd可以是表面配备有能够偶联的功能(cooh、oh、nh2、sh、叠氮化物、炔烃)。在一个示例性实施方案中,所述水溶性无毒qd是羧基官能化的或变成羧基官能化的。例如,cooh-qd可以使用碳二亚胺连接技术使用水溶性1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)与靶向抗体的胺末端连接。将所述羧基官能化的qd与edc混合以形成活性o-酰基异脲中间体,然后通过来自反应混合物中单克隆抗体上的伯氨基的亲核攻击而置换。如果需要,在与所述含伯胺抗体的反应过程中加入n-羟基琥珀酰亚胺的磺基衍生物(sulfo-nhs)。加入sulfo-nhs后,所述edc将nhs与羧基偶联,形成比0-酰基异脲中间体更稳定的nhs酯,同时允许在生理ph下与伯胺有效结合。在任一情况下,结果是所述qd和所述抗体之间的共价键。也可以替代地使用其他化学反应如suzuki-miyaura交叉偶联、(琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)(succinimidyl4-(n-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,smcc),或基于醛的反应。

合成核和核-壳纳米颗粒的方法公开在例如共同拥有的美国专利号7,867,556、7,867,557、7,803,423、7,588,828,和6,379,635中。每个上述专利的内容通过引用整体并入本文。美国专利号9,115,097、8,062,703、7,985,446、7,803,423,和7,588,828,以及美国公开号2010/0283005、2014/0264196、2014/0277297,和2014/0370690,其全部内容通过引用并入本文,描述生产大量高质量单分散量子点的方法。

在一个实施方案中,利用核/壳颗粒,其具有至少一种半导体组合物的中心区域或核心,所述半导体组合物埋入或涂覆有明显不同的半导体组合物的一个或多个外层或壳。作为一个例子,所述核可以由in、p、zn和s的合金组成,例如通过实施例1的描述形成,包括在zns分子簇上分子接种铟基纳米颗粒,然后形成zns的壳。

在其他实施方案中,所用的水溶性qd纳米颗粒包含具有带隙值或能量(eg)的合金半导体材料,其通过渐变合金化而向外增加,代替产生核/壳qd。所述带隙能量(eg)是将电子从基态价能带激发到空导带能带所需的最小能量。

所述渐变合金qd组合物被认为在元素组成中从颗粒中心处或附近渐变到所述qd的最外表面,而不是形成为由离散壳层覆盖的离散核心。一个例子是in1-xp1-yznxsy,渐变合金qd,其中x和y从qd的中心到表面逐渐从0增加到1。在这样的示例中,所述量子点(qd)的带隙将从纯inp朝向中心逐渐变化到表面上纯zns的较大带隙值的带隙。尽管所述带隙取决于粒径,但是zns的带隙比inp的带隙宽,使得渐变合金的带隙将从所述qd的内部逐渐增加到表面。

一锅合成方法可用作本文实施例1中所述的分子接种方法的改进。这可以通过逐渐减少加入到反应溶液中的肉豆蔻酸铟和(tms)3p的量来维持颗粒生长,同时在例如用于产生实施例1的核颗粒的方法中加入增量的锌和硫前体来实现。因此,在一个实施例中,将二丁基酯和饱和脂肪酸置于反应烧瓶中并加热脱气。引入氮气并升高温度。在搅拌下加入分子簇,例如zns分子簇[et3nh]4[zn10s4(sph)16]。随着渐变协议添加渐变合金前体溶液,温度增加,所述渐变协议包括添加逐渐降低浓度的第一半导体材料和逐渐增加浓度的第二半导体材料。例如,渐变协议可以开始添加肉豆蔻酸铟(in(ma)3)和溶解在二羧酸酯(例如二正丁基癸二酸酯)中的三甲基甲硅烷基膦(tms)3p,其中加入的in(ma)3和(tms)3p的量随着时间逐渐减少,用逐渐增加浓度的硫和锌化合物如(tms)2s和乙酸锌代替。随着in(ma)3和(tms)3p的添加量减少,逐渐增加量的溶解在饱和脂肪酸(例如肉豆蔻酸或油酸)中的(tms)2s和二羧酸酯(例如癸二酸二正丁酯)与乙酸锌一起加入。以下反应将导致zns化合物的产生增加。随着添加的继续,形成所需尺寸的qd颗粒,其发射最大值在波长上逐渐增加,其中inp和zns的浓度以最高浓度的inp朝向所述qd颗粒的中心和最高浓度的zns在所述qd粒子的外部渐变。当获得所需的发射最大值时,停止进一步添加反应,并使得到的渐变合金颗粒退火,然后通过沉淀和洗涤分离所述颗粒。

纳米颗粒与介质的相容性以及所述纳米颗粒对聚集、光氧化和/或猝灭的敏感性主要由所述纳米颗粒的表面组成介导。关于任何核、核-壳或核-多壳纳米颗粒中的最终无机表面原子的配位可能是不完全的,在表面上具有高度反应性的悬空键,这可导致颗粒聚集。通过用保护性有机基团钝化(封端)裸表面原子来克服所述问题,所述有机基团在本文中称为封端配体或封端剂。颗粒的封端或钝化防止颗粒聚集发生,但也保护所述颗粒免受其周围化学环境的影响,并且在核材料的情况下为所述颗粒提供电子稳定化(钝化)。封端配体可以是但不限于与颗粒的最外层无机层的表面金属原子结合的路易斯碱。所述封端配体的性质很大程度上决定了纳米颗粒与特定介质的相容性。可根据所需特征选择封端配体。可以使用的封端配体的类型包括硫醇基、羧基、胺、膦、氧化膦、膦酸、次膦酸、咪唑、oh、硫醚和杯芳烃基团。除杯芳烃外,所有这些封端配体都具有头基,其可以形成所述颗粒表面上的封端配体的锚定中心。所述封端配体的主体可以是直链、环状或芳香族。所述封端配体本身可以是大的、小的、低聚的或多齿的。所述配体主体的性质和未结合到所述颗粒上的突出侧一起决定配体是亲水的、疏水的、两亲的、阳性、阳性的还是两性离子的。

在许多量子点材料中,所述封端配体是疏水的(例如,烷基硫醇、脂肪酸、烷基膦、烷基氧化膦等)。因此,在所述纳米颗粒的合成和分离之后,所述纳米颗粒通常分散在疏水性溶剂中,例如甲苯。这种封端的纳米颗粒通常不能在更具极性的介质中分散。如果需要对所述qd进行表面改性,则最广泛使用的方法称为配体交换。随后可以在核心合成和/或脱壳过程中与所述纳米颗粒表面配位的亲脂性配体分子与极性/带电配体化合物交换。另一种表面改性策略是将极性/带电分子或聚合物分子与已经与所述纳米颗粒表面配位的配体分子插入。然而,虽然某些配体交换和插入程序使所述纳米颗粒与水性介质更相容,但它们可导致比相应的未改性纳米颗粒具有更低量子产率(qy)和/或显着更大尺寸的材料。

对于体内和体外目的,如果不需要,具有低毒性特征的qd是理想的。因此,出于某些目的,所述量子点纳米颗粒优选基本上不含有毒性重金属,例如镉、铅和砷(例如,含有小于5重量%、例如小于4重量%、小于3重量%、小于2重量%、小于1重量%、小于0.5重量%、小于0.1重量%、小于0.05重量%,或小于0.01重量%的重金属如镉、铅和砷)或不含重金属,如镉、铅和砷。在一个实施方案中,提供了缺乏重金属如镉、铅和砷的降低的毒性qd。

qd的所述独特性质使得几种潜在的医学应用成为可能,包括活细胞中未被满足的体外和体内诊断。关于qd的医学应用的主要问题之一是大多数研究都集中在含有有毒重金属(如镉、铅或砷)的qd上。本文所述的生物相容性和水溶性无重金属qd可安全地用于体外和体内的医学应用。在某些实施方案中,提供体内相容的水分散性无镉qd,其具有10-20nm的流体动力学尺寸(在完整igg2抗体的尺寸范围内)。在一个实施方案中,所述体内相容的水分散性无镉qd根据本文实施例1和2中所述的程序制备。在某些实施方案中,所述体内相容的水分散性无镉qd是羧基官能化的并且用配体结合部分进一步衍生化。

不含镉、铅和砷的纳米颗粒的实例包括包含半导体材料的纳米颗粒,例如zns,znse,znte,inp,insb,alp,als,alsb,gan,gap,gasb,pbs,pbse,agins2,cuins2,si,ge及其合金和掺杂衍生物,特别是包含这些材料之一的核和这些材料中的另一种的一种或多种壳的纳米颗粒。

在某些实施方案中,对无毒qd纳米颗粒进行表面改性以使其具有水溶性并具有允许通过将它们暴露于配体相互作用剂以实现所述配体相互作用剂与所述qd表面的关联而衍生化的表面部分。所述配体相互作用剂可包含链部分和对连接/交联剂具有特定亲和力或与其反应的官能团,如下所述。所述链部分可以是例如烷烃链。官能团的实例包括亲核试剂,例如硫代基团、羟基、甲酰胺基团、酯基团,和羧基。所述配体相互作用剂可以包含或可以不包含对qd表面具有亲和力的部分。这些部分的实例包括硫醇、胺、羧基,和膦。如果配体相互作用基团不包含这样的部分,则所述配体相互作用基团可以通过嵌入封端配体与所述纳米颗粒的表面关联。配体相互作用剂的实例包括c8-20脂肪酸及其酯,例如肉豆蔻酸异丙酯。

应当注意,所述配体相互作用剂可以简单地因用于合成所述纳米颗粒的方法结合qd纳米颗粒,从而不需要将纳米颗粒暴露于额外量的配体相互作用剂。在这种情况下,可能不需要将其他配体相互作用剂与所述纳米颗粒结合。或者,或另外,在合成和分离所述纳米颗粒之后,可以将qd纳米颗粒暴露于配体相互作用剂。例如,可以将所述纳米颗粒在含有配体相互作用剂的溶液中温育一段时间。这种温育或一部分温育期可以处于升高的温度,以促进所述配体相互作用剂与所述纳米颗粒表面的结合。在所述配体相互作用剂与所述纳米颗粒表面结合后,所述qd纳米颗粒暴露于连接/交联剂和表面改性配体。所述连接/交联剂包括对所述配体相互作用剂的基团和所述表面改性配体具有特定亲和力的官能团。所述配体相互作用剂-纳米颗粒关联复合物可以依次暴露于所述连接/交联剂和表面改性配体。例如,所述纳米颗粒可以暴露于所述连接/交联剂一段时间以实现交联,然后暴露于所述表面改性配体以将其掺入所述纳米颗粒的配体壳中。或者,所述纳米颗粒可以暴露于所述连接/交联剂和所述表面改性配体的混合物,从而实现交联并在单个步骤中掺入表面改性配体。

在一个实施方案中,在分子簇化合物存在下,在其中保持所述分子簇的完整性并充当明确定义的预制种子或模板以提供与化学前体反应的成核中心的条件下提供量子点前体,以生产供工业应用足够大规模的高质量的纳米颗粒。

然而,所公开的方法不限于分子簇方法。制备所述量子点的其他方法包括例如双注射方法、水基方法、热注射方法,和接种方法。

适用于本发明的量子点纳米颗粒的类型包括,但不限于,包含以下类型的核心材料(包括其任何组合或合金):

iia-vib(2-16)材料,包含元素周期表第2族的第一元素和元素周期表第16族的第二元素,还包括三元和四元材料和掺杂材料。合适的纳米颗粒材料包括,但不限于:mgs,mgse,mgte,cas,case,cate,srs,srse,srte,bas,base,和bate。

ii-v族材料包含元素周期表第12族的第一元素和元素周期表第15族的第二元素,还包括三元和四元材料和掺杂材料。合适的纳米颗粒材料包括,但不限于:zn3p2,zn3as2,cd3p2,cd3as2,cd3n2,和zn3n2.。

ii-vi族材料包含元素周期表第12族的第一元素和元素周期表第16族的第二元素,还包括三元和四元材料和掺杂材料。合适的纳米颗粒材料包括,但不限于:cdse,cdte,zns,znse,znte,zno,hgs,hgse,hgte,cdses,cdsete,cdste,znses,znsete,znste,hgses,hgsete,hgste,cdzns,cdznse,cdznte,cdhgs,cdhgse,cdhgte,hgzns,hgznse,hgznte,cdznses,cdznsete,cdhgses,cdhgsete,cdhgste,hgznses,和hgznsete.。

iii-v族材料包含元素周期表第13族的第一元素和元素周期表第15族的第二元素,还包括三元和四元材料和掺杂材料。合适的纳米颗粒材料包括,但不限于:bp,alp,alas,alsb;gan,gap,gaas,gasb;inn,inp,inas,insb,ain,和bn。

iii-iv族材料包含元素周期表第13族的第一元素和元素周期表第14族的第二元素,还包括三元和四元材料和掺杂材料。合适的纳米颗粒材料包括,但不限于:b4c,al4c3,ga4c,si,和sic。

iii-vi族材料包含元素周期表第13族的第一元素和元素周期表第16族的第二元素,还包括三元和四元材料。合适的纳米颗粒材料包括,但不限于:al2s3,al2se3,al2te3,ga2s3,ga2se3,gete;in2s3,in2se3,ga2te3,in2te3,和inte。

iv-vi族材料包含元素周期表第14族的第一元素和元素周期表第16族的第二元素,还包括三元和四元材料和掺杂材料。合适的纳米颗粒材料包括,但不限于:pbs,pbse,pbte,sb2te3,sns,snse,和snte。

纳米颗粒材料包含来自元素周期表的过渡金属中的任何族的第一元素,和来自周期表的第16族的第二元素,并且还包括三元和四元材料和掺杂材料。合适的纳米颗粒材料包括,但不限于:nis,crs,ags,和i-iii-vi族材料,例如,cuins2,cuinse2,cugas2,和agins2。

在一个优选的实施方案中,所述纳米颗粒材料包含ii-iv族材料、iii-v族材料、i-iii-vi族材料,以及其任何合金或掺杂衍生物。

出于说明书和权利要求的目的,术语掺杂纳米颗粒是指上述纳米颗粒和包含一种或多种主要族或稀土元素的掺杂剂,其通常是过渡金属或稀土元素,例如但不限于锌硫化物与锰,如掺杂mn+的zns纳米颗粒。

在一个实施方案中,所述量子点纳米颗粒基本上不含重金属,如镉(例如,含有小于5重量%,例如小于4重量%、小于3重量%、小于2重量%、小于1重量%、小于0.5重量%、小于0.1重量%、小于0.05重量%,或小于0.01重量%的重金属,如镉)或不含重金属,如镉。

对于体内应用,优选不含重金属的半导体纳米颗粒,例如in基量子点,例如inp量子点及其合金和掺杂衍生物。

在一个实施方案中,本文所述的任何量子点纳米颗粒包括第一层,所述第一层包括在所述纳米颗粒核上提供的第一半导体材料。可以在所述第一层上提供包括第二半导体材料的第二层。

合成

以下合成步骤可用于偶联。连接体可用于在所述纳米颗粒上的羧基官能团和甲基化特异性结合配体上的胺端基之间形成酰胺基团。可以使用已知的连接体,例如直接在所述量子点纳米颗粒的无机表面上的硫醇锚定基团。可以采用标准的耦合条件,并且对于本领域普通技术人员来说是已知的。例如,合适的偶联剂包括,但不限于,碳二亚胺,例如二环己基碳二亚胺(dcc),二异丙基碳二亚胺(dic),和1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)。在一个实施方案中,所述偶联剂是edc。

在一个实施例中,带有羧基端基和官能化配体的量子点纳米颗粒可以在溶剂中混合。可以向所述混合物中加入偶联剂,例如edc。可以温育所述反应混合物。所述粗官能化配体纳米颗粒偶联物可以进行纯化和/或分离。

可以使用标准固态纯化方法。可能需要进行几次过滤和用合适溶剂洗涤的循环以除去过量的未反应的官能化配体和/或edc。

为了公开的完整性,包括以下实施例,并说明制备本发明组合物和复合物的方法以及呈现所述组合物的某些特征。这些实施例绝对不是要限制本公开的范围或教导。

实施例1

无毒量子点的合成

分子接种过程用于产生无毒的量子点(qd)。简言之,如下进行在500-700nm范围内发射的非官能化铟基量子点的制备:将二丁基酯(约100ml)和肉豆蔻酸(ma)(10.06g)置于三颈烧瓶,在约70℃下真空脱气1小时。此后,引入氮气并将温度升至约90℃。加入约4.7g的zns分子簇[et3nh]4[zn10s4(sph)16],并将所述混合物搅拌约45分钟。然后将温度升至约100℃,接着逐滴加入in(ma)3(1m,15ml),接着加入三甲基甲硅烷基膦(tms)3p(1m,15ml)。搅拌所述反应混合物,同时将温度升至约140℃。在140℃下,进一步逐滴添加溶解于二-正-丁基癸二酸酯的肉豆蔻酸铟(in(ma)3)(1m,35ml)(搅拌5分钟)和溶解于二-正-丁基癸二酸酯的(tms)3p(1m,35ml)。然后将温度缓慢升至180℃,再滴加in(ma)3(1m,55ml),然后加入(tms)3p(1m,40ml)。通过以这种方式添加前体,形成发射最大值从500nm逐渐增加到720nm的铟基颗粒。当获得所需的发射最大值时停止反应并在反应温度下搅拌半小时。在此期间之后,使所述混合物退火最多约4天(在比反应低约-20-40℃的温度下)。在所述阶段还使用uv灯来辅助退火。

通过套管技术加入干燥的脱气甲醇(约200ml)分离所述颗粒。使沉淀物沉降,然后借助滤棒通过套管除去甲醇。加入干燥的脱气氯仿(约10ml)以洗涤固体。将所述固体在真空下干燥1天。所述过程导致在zns分子簇上形成铟基纳米颗粒。在进一步的处理中,通过在稀氢氟酸(hf)中洗涤,进一步提高了所得铟基纳米颗粒的量子产率。铟基芯材料的量子效率范围为约25%-50%。所述组合物被认为是包含in、p、zn和s的合金结构。

zns壳的生长:将20ml部分的hf蚀刻的铟基核颗粒在三颈烧瓶中干燥。加入1.3g肉豆蔻酸和20ml癸二酸二正丁酯并脱气30分钟。将溶液加热至200℃,逐滴加入2ml1m(tms)2s(以7.93ml/h的速率)。加完后,将溶液静置2分钟,然后加入1.2g无水乙酸锌。将溶液在200℃保持1小时,然后冷却至室温。通过加入40ml无水脱气甲醇分离所得颗粒并离心。弃去上清液,向剩余的固体中加入30ml无水脱气的己烷。使溶液静置5小时,然后再次离心。收集上清液,弃去剩余的固体。最终的非官能化铟基纳米颗粒材料的量子效率在有机溶剂中为约60%-90%。

实施例2

水溶性表面改性qd

本文提供了用于产生和使用三聚氰胺六甲氧基甲基三聚氰胺(hmmm)改性的荧光纳米颗粒作为药物递送载体的方法的一个实施方案。独特的三聚氰胺基涂料具有出色的生物相容性、低毒性和非常低的非特异性结合。这些独特的功能允许在体外和体内广泛的生物医学应用。

制备合适的水溶性纳米颗粒的一个实例提供如下:200mg在608nm红色发射的无镉量子点纳米颗粒作为芯材料,将含有铟和磷的合金与实施例1中所述的含zn壳一起分散在含有肉豆蔻酸异丙酯(100微升)的甲苯(1ml)中。包含肉豆蔻酸异丙酯作为所述配体相互作用剂。将所述混合物在50℃加热约1-2分钟,然后在室温下缓慢振荡15小时。将含有六甲氧基甲基三聚氰胺(hmmm)(cymel303,购自cytecindustries公司,西帕特森,新泽西州)(400mg)、单甲氧基聚环氧乙烷(ch3o-peg2000-oh)(400mg)和水杨酸(50mg)的甲苯溶液(4m1)加入到所述纳米颗粒分散体中。包含在官能化反应中的水杨酸起到三种作用,即催化剂、交联剂,和cooh源。部分由于hmmm对0h基团的偏好,水杨酸提供的许多cooh基团在交联后仍可在qd上获得。

hmmm是基于三聚氰胺的连接/交联剂,具有以下结构:

hmmm可以在酸催化反应中反应以交联各种官能团,例如酰胺、羧基、羟基,和硫醇。

将所述混合物脱气并在130℃下回流第一个小时,然后在140℃下回流3小时,同时用磁力搅拌器以300rpm搅拌。在第一个小时期间,使氮气流通过烧瓶以确保除去由hmmm与亲核试剂反应产生的挥发性副产物。将所述混合物冷却至室温并储存在惰性气体中。与未改性的纳米颗粒相比,所述表面改性的纳米颗粒显示出很少或没有荧光量子产率的损失,并且发射峰或半峰全宽(fwhm)值没有变化。将等分的所述表面改性的纳米颗粒在真空下干燥,并将去离子水加入到残余物中。所述表面改性的纳米颗粒在水性介质中很好地分散并且保持永久分散。相比之下,未改性的纳米颗粒不能悬浮在水性介质中。根据上述方法的表面改性的纳米颗粒的荧光量子产率为4050%。在典型的批次中,获得47%±5%的量子产率。

在另一个实施方案中,将具有在608nm红色发射的无镉量子点纳米颗粒(200mg)分散在含有胆固醇(71.5mg)的甲苯(1m1)中。将所述混合物在50℃加热约1-2分钟,然后在室温下缓慢振荡15小时。将hmmm(cymel303)(400mg)、单甲氧基聚环氧乙烷(ch3o-peg2000-oh)(400mg)、愈创甘油醚(100mg)、二氯甲烷(dcm)(2ml)和水杨酸(50mg)的甲苯溶液(4ml)加入到所述纳米颗粒分散体中。

如本文所用,所述化合物愈创甘油醚具有以下化学结构:

如本文所用,所述化合物水杨酸具有以下化学结构:

将所述混合物脱气并在140℃下回流4小时,同时用磁力搅拌器以300rpm搅拌。与先前的方法一样,在第一个小时期间,氮气流通过烧瓶以确保除去由hmmm与亲核试剂反应产生的挥发性副产物。将所述混合物冷却至室温并储存在惰性气体中。将等分的所述表面改性的纳米颗粒在真空下干燥,并将去离子水加入到残余物中。使用100mmkoh溶液将溶液的ph调节至6.5,并使用amicon过滤器(30kd)通过三次超滤循环除去过量的未反应物质。将最终的水溶液冷藏直至使用。

值得注意的是,用于改性纳米颗粒以增加其水溶性的传统方法(例如,与巯基官能化的水溶性配体的配体交换)在温和条件下是无法使纳米颗粒具有水溶性的。在更加苛刻的条件下,例如加热和超声处理,变成水溶性的部分具有非常低的量子产率(qy<20%)。相比之下,本方法提供具有高量子产率的水溶性纳米颗粒。如本文所定义,高量子产率等于或大于40%。在某些实施方案中,获得等于或大于45%的高量子产率。如本实施例中制备的表面改性的纳米颗粒也很好地分散并且保持永久地分散在其他极性溶剂中,包括乙醇、丙醇、丙酮、甲基乙基甲酮、丁醇、甲基丙烯酸三丙基甲酯,或甲基丙烯酸甲酯。

实施例3

包括靶向配体的水溶性qd

在某些实施方案中,所述水溶性qd被改性以包括添加至所述qd的靶向配体。因此,在一个实施方案中,合成量子点纳米颗粒,其是无毒和水溶性的(生物相容的)并且表面配备有能够偶联的功能(cooh、oh、nh2、sh、叠氮化物、炔烃)。由于可以添加到所述qd中的官能团,例如本文实施例2中提供的cooh官能团,可以改性所述qd以包括靶向配体,其允许所述qd选择性地鉴定样品、细胞和组织中的线粒体。所述靶向配体改性的qd被照射并发射光用于检测。

在一个示例性实施方案中,所述水溶性无毒qd是羧基官能化的或变成羧基官能化的。所述cooh-qd使用化学方法例如使用水溶性1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)的碳二亚胺连接技术与线粒体靶向部分(例如特异性抗体)的胺末端连接。将所述羧基官能化的qd与edc混合以形成活性o-酰基异脲中间体,然后通过来自所述反应混合物中单克隆抗体上的伯氨基的亲核攻击而置换。如果需要,在与含伯胺抗体的反应过程中加入n-羟基琥珀酰亚胺的磺基衍生物(sulfo-nhs)。加入sulfo-nhs后,edc将nhs与羧基偶联,形成比o-酰基异脲中间体更稳定的nhs酯,同时允许在生理ph下与伯胺有效结合。在任一情况下,结果是所述qd和所述抗体之间的共价键。也可以替代地使用其他化学反应如suzuki-miyaura交叉偶联、琥珀酰亚胺基4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)或醛基反应。

在一个实施方案中,无毒水溶性量子点化学连接至针对线粒体结合的抗体。合适的甲基化特异性结合配体包括,但不限于,tebu-bio销售的抗线粒体抗体(目录号909-301-d79)、由tebu-bio销售的抗hsp60(t547)(目录号bs1179-50ul(50u1)和bs1179-100ul(100u1))、由tebu-bio销售的抗sod1(目录号mab10394)、由tebu-bio销售的抗grp75克隆s19-2(目录号mab6629)、由tebu-bio销售的抗细胞色素c(h19)(目录号bs1089-50ul(50ul)和bs1089-100ul(100u1))、三苯基鏻(tpp)及其任何组合。

体内相容的水分散性无镉qd与线粒体特异性结合配体的共价偶联:在艾本德离心管中,将1mg羧基官能化的水溶性量子点与100ulmes活化缓冲液(即25l的40mg/ml原液混合到1001mes中)混合。将mes缓冲液在去离子(di)水,ph4.5中制备为25mm溶液(2-(n-吗啉代)乙磺酸半钠盐(mes)sigmaaldrich)。向其中加入33ul新鲜edc溶液(30mg/ml在di水中的原液,1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc),fisherscientific)并将溶液混合。加入41新鲜的sulfo-nhs(100mg/ml原液,thermofisherscientific,在di水中)并混合。nanosep300k过滤器(pallnanosep300komega超滤器)在100lmes中预先润湿。将mes/edc/sulfo-nhs/qd溶液添加到所述nanosep300k过滤器中,并用足够的mes加满。将过滤器以5000rpm/15分钟离心。将所述点重新分散在50ul活化缓冲液中,并转移至含有101线粒体特异性配体的艾本德离心管中。将所述溶液充分混合并在室温下温育过夜(约1618小时)。用1616-氨基己酸(6ac)(19.7mg/100mm)淬灭溶液。注意,淬灭可以替代地用具有伯胺的其他化合物进行,但是对于所述实施方案选择6ac,因为它具有cooh并且可以保持产物的胶体稳定性。将溶液转移至预先润湿的nanosep300k过滤器(10011xpbs)中,并用1xpbs加满至5001线。使用nanosep300k过滤器和1xpbs缓冲液通过三次超滤循环除去过量的sav。离心的每个循环在5000rpm下运行20分钟,每次循环后用约400ul的1xpbs再分散。将最终浓缩物重新分散在100ulpbs中。

实施例4

体外应用

由于cox在620、680、760和820nm处具有光吸收峰,因此可以调整所述量子点发射以匹配cox吸收峰之一。在本例子中,使用620nm发射量子点纳米颗粒。将培养的癌细胞与水溶性620nm发射量子点纳米颗粒一起温育,浓度范围为(1-20g/ml)。在预定时间之后,拍摄荧光显微镜图像以检测所述点的内化。从图1中可以看出,所述量子点纳米颗粒被内化到细胞质结构中。然后照射所述qd,并且来自所述内化qd的后续发射用于刺激cox并调节cox活性或从培养的癌细胞培养物中的线粒体释放。

研究表明,酶细胞色素c氧化酶(cox)被认为是可见光和近红外(nir)区域的光接收器和光信号转换器。内化qd的光照射引起cox活性的增加,导致一系列反应,这些反应可以改变细胞稳态并增加三磷酸腺苷(atp)、活性氧类(ros)、一氧化氮(n0)和细胞内钙(ica2+)的产生。光发射内化qd的体外应用提供了对cox在细胞功能和疾病中起作用的更好理解。

实施例5

体内应用-体内平衡

取决于治疗目的和给药方法,所述量子点纳米颗粒可以用作直接注射到哺乳动物中关注区域(例如,目标区域或器官)的简单裸点。足以增加cox活性的内化qd的光照射被认为是通过调节体内平衡(例如,增加三磷酸腺苷(atp)、活性氧类(ros)、一氧化氮(no)和/或细胞内钙(ica2+)的产生)来进行低强度光疗的原因。参见tafuretal.,low-intensitylighttherapy:exploringtheroleofredoxmechanisms,photomedlasersurg.2008aug;26(4):323-328。内化qd的光照射用于靶向哺乳动物的关注区域,而不对其他区域进行光照射。qd的内部光照射用于调节炎症修复、伤口愈合和软组织修复的过程。

所述qd还可以通过皮下、肌肉内、皮内或静脉内途径给药。将qd配备组织特异性标签(根据上文讨论的实施例3)以确保在哺乳动物中特异性递送所述qd靶向关注的区域(例如,哺乳动物中的特定器官)。

例5

体内应用-细胞凋亡

取决于治疗目的和给药方法,所述量子点纳米颗粒可以用作直接注射到哺乳动物中关注区域(例如,目标区域或器官)的简单裸点。内化qd的光照射引起cox活性的增加;cox的过表达被认为通过到达存在线粒体的细胞的细胞质而触发细胞凋亡的途径。参见boehningd,etal.,cytochromecbindstoinositol(1,4,5)trisphosphatereceptors,amplifyingcalcium-dependentapoptosis.naturecellbiology.5(12):1051-61(dec2003)。内化qd的光照射用于靶向哺乳动物的关注区域,而不对其他区域进行光照射。qd的内部光照射用于启动不需要的细胞(例如肿瘤细胞)中的细胞死亡(细胞凋亡)。光照射导致线粒体膜的去极化,导致cox释放到存在线粒体的细胞的细胞质中。

所述qd还可以通过皮下、肌肉内、皮内或静脉内途径给药。将qd配备组织特异性标签(根据上文讨论的实施例3)以确保在哺乳动物中特异性递送所述qd靶向关注的区域(例如,哺乳动物中的特定器官)。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用结合到本文中,如同在本文中完整阐述一样。根据前述说明书,本发明的这些和其它优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此,本领域技术人员将认识到,在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下,可以对上述实施例进行改变或修改。应当理解,本发明不限于本文所述的特定实施方案,而是旨在包括在本发明的范围和精神内的所有变化和修改。

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