本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种储存物理稳定性好的环孢素固体脂质纳米粒及其制备方法。
背景技术：
固体脂质纳米粒(solidlipidnanoparticles，slns)是以生理相容的高熔点脂质为骨架材料，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成的粒径在10～1000nm之间的固体胶粒给药系统，是九十年代初发展起来的一种可替代乳剂、脂质体和聚合物纳米粒的一种新型纳米给药系统。它主要用于静脉注射，达到靶向或控释作用，也可用于口服给药，提高药物的口服生物利用度。
固体脂质纳米粒脂质材料结晶度高，相对规则的晶体结构留给药物的空间较小、载药量低。固体脂质纳米粒的贮存稳定性较差。在储藏过程中固体脂质纳米粒常出现粒子聚集、粒径变大、胶凝、药物析出等现象，其原因是脂质晶型转变，从高能态转变为低能态，晶格的有序性增加。为此发展了纳米结构脂质载体(nanostructuredlipidcarriers)，即制备过程中在固态脂质中加入部分液态脂质材料，降低晶格的有序性，防止药物析出。然而，纳米结构脂质载体在采用其常用的制备方法——熔融乳化法制备的过程中比固体脂质纳米粒更容易出现过冷态(super-cooledmelts)现象，液态脂质过量易出现相分离，而且在贮存过程中也会发生粒径增大和药物析出等问题。
菊糖(inulin)，俗称菊粉，化学组成上是由果糖分子通过β(2→1)键连接而成的，末端连有一个葡萄糖分子，聚合度为2～60左右。菊糖为天然功能性食用多糖，广泛存在于多种植物中，尤其是菊芋、菊苣块根中含有丰富的菊糖，目前广泛应用于食品制作过程中替代或减少脂肪用量的改良剂，赋予食品质感。
菊糖为白色粉末，且易吸潮，溶解度随聚合度降低而增大，温度对溶解度的大小也有重要的影响。菊糖对热稳定，较耐热，即使在100℃条件下加热也不会分解。当ph<4条件下，菊糖在一定温度和时间可分解为果糖和葡萄糖。另外，有研究证明，菊糖在缺乏自由水的条件下，即使在酸性或者高温条件下也十分稳定。为了拓宽其用途，对菊糖进行化学结构修饰，合成了烷基化菊糖衍生物，以改善菊糖的性能。
固体脂质纳米粒脂质材料结晶度高，相对规则有序的晶体结构留给药物的空间较小、载药量低，固体脂质纳米粒的贮存稳定性较差。在储藏过程中固体脂质纳米粒常出现粒子聚集、粒径变大、胶凝、药物析出等现象，其原因是脂质晶型转变，从高能态转变为低能态，晶格的有序性增加。
技术实现要素：
本发明针对上述问题，提供了一种储存物理稳定性好的脂质纳米粒，该固体脂质纳米粒以菊糖衍生物作为乳化剂，将环孢素与脂质材料熔融后制备得到载药的固体脂质纳米粒，该载药的固体脂质纳米粒药物包封性能良好，且烷基化菊糖衍生物疏水烷基链的一部分可嵌入固体脂质纳米粒的脂质骨架中，降低脂质晶格的有序性，从而提高固体脂质纳米粒的储存稳定性。
本发明通过如下技术方案实现上述目的：
本发明提供了一种储存物理稳定性好的环孢素固体脂质纳米粒及其制备方法，按重量计，其原料及配比包括：
环孢素0.1g～1g
脂质材料3g～5g
烷基化菊糖衍生物2g～5g
进一步地，所述固体脂质纳米粒的烷基化菊糖衍生物为辛烷基化菊糖衍生物、十二烷基化菊糖衍生物、十八烷基化菊糖衍生物的一种或多种。
进一步地，所述固体脂质纳米粒的脂质材料为辛酸/葵酸甘油三酯、单硬脂酸甘油酯、双硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山嵛酸单甘油酯、山嵛酸甘油二酯、山嵛酸甘油三酯、月桂酸甘油酯的一种或多种。
本发明还提供了所述固体脂质纳米粒的制备方法，如下所述：
(1)取配方比的脂质材料置于容器中，水浴加热至脂质材料全部熔融后，加入配方比的环孢素；
(2)将配方比的烷基化菊糖衍生物于蒸馏水中溶解完全后，加热至与步骤(1)所述脂质材料及环孢素的温度相同时，加入步骤(1)中的容器内，并用分散机分散一段时间后得到初乳，将初乳进行超声分散一段时间后，冷却至室温即可。
进一步地，所述固体脂质纳米粒的制备方法中，分散机分散时的转速为6000rpm～11000rpm，分散时间为2min～6min。
进一步地，所述固体脂质纳米粒的制备方法中，超声分散的超声功率为600w～900w,超声时间为5min～15min。
进一步地，所述固体脂质纳米粒的制备方法中，步骤(2)中加入的蒸馏水的体积为500ml。
本发明制得的固体脂质纳米粒的平均粒径小于300nm。
本发明制得的固体脂质纳米粒为混悬液，经冷冻干燥后可得到固体脂质纳米粒冻干粉，并可进一步制备成片剂和胶囊，用于制备在消化道吸收的药物制剂。
本发明的有益效果为：
1、以主链亲水、支链疏水的烷基化菊糖衍生物为乳化剂，该乳化剂是由末端基团为羟基的菊糖和异氰酸酯通过酯键连接而成的具有梳形结构的高分子材料，可以多点接触的方式强力吸附于纳米粒表面；当纳米粒相互靠近时，位于纳米粒表面的烷基化菊糖衍生物的齿状亲水链不会像直链表面活性剂一样相互穿插缠绕，导致纳米粒聚集，粒径增大，不仅在低浓度时就具有强力吸附在乳滴表面的作用，而且在高电解质和高温环境下同样也能强力吸附在乳滴表面，提高胶态系统的稳定性，且烷基化菊糖衍生物的疏水烷基链还可以嵌入slns的脂质骨架中，降低脂质晶格的有序性，从而提高固体脂质纳米粒的稳定性。
2、该稳定性高的固体脂质纳米粒的制备工艺简单，适用于医药企业大规模生产。
附图说明
图1为在不同温度和时间贮存下载药slns(tween-cya-slns、inu12-cya-slns、
inu18-cya-slns)的粒径(ps)、多分散性系数(pdi)、zeta电位(zp)变化。
图2在不同温度和时间贮存下的载药slns(tween-cya-slns、inu12-cya-slns、
inu18-cya-slns)的包封率(ee)的变化情况。
图3为tween-cya-slns在不同储存条件下的dsc图谱。
图4为inu12-cya-slns在不同储存条件下的dsc图谱。
图5为inu18-cya-slns在不同储存条件下的dsc图谱。
图6为tween-cya-slns在不同储存条件下的xrd图谱。
图7为inu12-cya-slns在不同储存条件下的xrd图谱。
图8为inu18-cya-slns在不同储存条件下的xrd图谱。
图示说明：a：新制slns；b：4℃贮存3个月；c：25℃贮存3个月；d：4℃贮存6个月；e：25℃贮存6个月。
具体实施方式
下面结合具体实施例例，对本发明作进一步地说明。
实施例1
1、称取葵酸甘油三酯0.75g、双硬脂酸甘油酯2.50g、三硬脂酸甘油酯1.75g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，使脂质材料全部熔融；
2、将十八烷基化菊糖衍生物5.00g溶解完全于500ml蒸馏水中，加热至与脂质材料料相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散6min，得到初乳，将初乳以900w进行超声分散15min后即可。
实施例2
1、称取山嵛酸单甘油酯0.75g、山嵛酸二甘油酯2.50g、山嵛酸三甘油酯1.75g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，使脂质原料全部熔融后，加入1.00g环孢素；
2、将十八烷基化菊糖衍生物5.00g溶解完全于500ml蒸馏水中，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散6min，得到初乳，将初乳以900w进行超声分散15min即可。
实施例3
1、称取山嵛酸单甘油酯0.75g、山嵛酸二甘油酯2.50g、山嵛酸三甘油酯1.75g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，使脂质原料全部熔融后，加入1.00g环孢素；
2、将十二烷基化菊糖衍生物5.00g溶解完全于500ml蒸馏水中，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散6min，得到初乳，将初乳以900w进行超声分散15min即可。
实施例4
1、称取山嵛酸单甘油酯0.75g、山嵛酸二甘油酯2.50g、山嵛酸三甘油酯1.75g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，使脂质原料全部熔融后，加入1.00g环孢素；
2、将辛烷基化菊糖衍生物5.00g溶解完全于500ml蒸馏水中，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散6min，得到初乳，将初乳以900w进行超声分散15min即可。
实施例5
1、称取单硬脂酸甘油酯2.50g、月桂酸甘油酯2.50g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，使脂质原料全部熔融后，加入1.00g环孢素；
2、将十二烷基化菊糖衍生物5.00g溶解完全于500ml蒸馏水中，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以6000rpm持续分散4min，得到初乳，将初乳以600w进行超声分散8min即可。
实施例6
1、称取月桂酸甘油酯3g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，使脂质原料全部熔融后，加入0.1g环孢素；
2、将十八烷基化菊糖衍生物2.00g溶解完全于500ml蒸馏水中，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以8000rpm持续分散5min，得到初乳，将初乳以800w进行超声分散5min即可。
实施例7
1、称取单硬脂酸甘油酯1.35g、双硬脂酸甘油酯0.75g、三硬脂酸甘油酯2.65g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，待脂质材料全部熔融后，加入0.50g环孢素；
2、将辛烷基化菊糖糖衍生物4.00g溶解完全于500ml蒸馏水后，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散3min，得到初乳，将初乳以800w进行超声分散8min即可。
实施例8
1、称取单硬脂酸甘油酯1.35g、双硬脂酸甘油酯0.75g、三硬脂酸甘油酯2.65g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，待脂质材料全部熔融后，加入0.80g环孢素；
2、将辛烷基化菊糖糖衍生物4.00g溶解完全于500ml蒸馏水后，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散3min，得到初乳，将初乳以800w进行超声分散8min即可。
实施例9
1、称取月桂酸甘油酯4.00g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，待脂质材料全部熔融后，加入0.80g环孢素；
2、将十八烷基化菊糖衍生物4.00g溶解完全于500ml蒸馏水后，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散5min，得到初乳，将初乳以900w进行超声分散10min即可。
实施例10
1、称取单硬脂酸甘油酯2.50g、月桂酸甘油酯2.50g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，待脂质材料全部熔融后，加入1.00g环孢素；
2、将十八烷基化菊糖衍生物5.00g溶解完全于500ml蒸馏水后，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散3min，得到初乳，将初乳以800w进行超声分散8min即可。
实施例11
1、称取单硬脂酸甘油酯1.50g、月桂酸甘油酯1.50g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，待脂质材料全部熔融后，加入0.10g环孢素；
2、将十八烷基化菊糖衍生物2.00g溶解完全于500ml蒸馏水后，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散3min，得到初乳，将初乳以800w进行超声分散8min即可。
实施例12
1、称取单硬脂酸甘油酯2.00g、月桂酸甘油酯2.25g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，待脂质材料全部熔融后，加入0.75g环孢素；
2、将十二烷基化菊糖衍生物4.00g溶解完全于500ml蒸馏水后，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散5min，得到初乳，将初乳以900w进行超声分散15min即可。
对比例1
1、称取山嵛酸单甘油酯0.75g、山嵛酸二甘油酯2.50g、山嵛酸三甘油酯1.75g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，使脂质原料全部熔融；
2、将泊洛沙姆(poloxamer188)5.00g溶解完全于500ml蒸馏水中，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散3min，得到初乳，将初乳以900w进行超声分散5min即可。
对比例2
1、称取山嵛酸单甘油酯0.75g、山嵛酸二甘油酯2.50g、山嵛酸三甘油酯1.75g，置于超声杯中,循环水浴加热至温度在80℃并维持此温度，使脂质原料全部熔融后，加入1.00g环孢素；
2、将吐温80(tween-80)5.00g溶解完全于500ml蒸馏水中，加热至与脂质材料及环孢素相同的温度时，加入步骤1中的容器内，然后用分散机以11000rpm持续分散3min，得到初乳，将初乳以900w进行超声分散2min即可。
实施例13
载药固体脂质纳米粒混悬液的粒径分布和zeta电位测定
精密量取tween-cya-slns(对比例2制备所得)、inu12-cya-slns(实施例3制备所得)、inu18-cya-slns(实施例2制备所得)固体脂质纳米粒混悬液0.1g于10ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度摇匀。用zetasizernanozs90粒度和电位测量仪测定固体脂质纳米粒的粒径和zeta电位，平行测定三次，结果见图1。
(1)粒径方面，在4℃和25℃分别贮存3个月和6个月后，三组cya-slns的粒径均呈现增大的趋势，且25℃较4℃增加的速度快。相同温度下，三组cya-slns粒径增加的速度由快到慢依次是：tween-cya-slns、inu12-cya-slns、inu18-cya-slns。tween-cya-slns的粒径增大1倍多(245.2nm→529.7nm)，其pdi增加幅度也较大，说明随着贮存时间延长，tween-cya-slns不仅粒径增大，而且粒度分布也变得不均一。
(2)总体来看，tween-cya-slns增加幅度最为明显(245.2±6.3nm→529.7±8.7nm)，为116.02％，inu12-cya-slns(343.4±12.6nm→453.9±14.1nm)、inu18-cya-slns(245.1±7.1nm→317.56±8.7nm)的粒径增加幅度不大，分别为32.18％，29.56％。pdi增加幅度结果也得到了相似的结果。
(3)对于zeta电位，zeta-电位绝对值降低可能导致粒径增长，分布变宽，粒子胶凝、聚集和沉淀，以及药物漏出,tween-cya-slns变化较明显，其绝对值减小到17.3，而inu12-cya-slns、inu18-cya-slns的zeta-电位变化不明显。这说明以菊糖衍生物为乳化剂制备的slns能够保持较稳定的zeta电位，保持体系的稳定性。
实施例14
载药固体脂质纳米粒混悬液包封率的测定
采用低温超速离心法测定包封率。取tween-cya-slns(对比例2制备所得)、
inu12-cya-slns(实施例3制备所得)、inu18-cya-slns(实施例2制备所得)固体脂质纳米粒混悬液1ml，用10％乙醇溶液稀释至10ml，封入6g超速离心管中，于10℃、60000rpm离心30min。取上清液，进样20μl，hplc法测定cya的量。根据公式计算包封率(ee)。载cya的slns在不同温度下储存的药物包封率(ee)变化见图2。
结果表明：
(1)在4℃和25℃分别贮存3个月和6个月后，三组cya-slns的药物包封率均有下降的趋势，25℃下降的幅度较4℃更大。相同温度下，三组cya-slns包封率降低的速度由快到慢依次是：tween-cya-slns、inu12-cya-slns、inu18-cya-slns。inu18-cya-slns的包封率下降幅度最慢。
(2)在4℃条件下贮存6个月以及在25℃条件下贮存3个月，inu18-cya-slns的包封率变化较小，在25℃贮存6个月后的包封率仍有61.31％。slns包封率的变化速度也在一定程度上反映了脂质材料晶型转变的速度。slns在贮存过程中，其脂质骨架材料常常发生晶型转变，脂质排列从无序变为有序，导致药物析出，包封率下降。
(3)从包封率下降的速度可以看出，在贮存过程中inu18-cya-slns脂质晶型转变最慢，其次为inu12-cya-slns，而tween-cya-slns最快。
实施例15
载药固体脂质纳米粒混悬液的dsc测定
取样品约5mg，置于铝盘中，以空白铝盘作为参比，分别对tween-cya-slns(对比例2制备所得)、inu12-cya-slns(实施例3制备所得)、inu18-cya-slns(实施例2制备所得)冻干粉末进行扫描。扫描区间为25～180℃，扫描速率为10℃/min。根据公式计算样品结晶指数(ci)，结果见表1及图3至5。
表1载cya的slns贮存6个月后的熔点、热焓值和重结晶指数(ci)
dsc结果显示：(1)与新制slns相比，在4℃和25℃分别贮存3个月和6个月后，载药slns(tween-cya-slns、inu12-cya-slns、inu18-cya-slns)的熔点、热焓值(δh)和ci均呈现增大趋势，且25℃增加的速度较4℃快,但后两者的增加幅度较小。在相同条件下，三组cya-slns的增大比例由大到小依次为：tween-cya-sln、inu12-cya-slns、inu18-cya-slns。
(2)在4℃和25℃分别贮存6个月后，tween-cya-slns的熔点升高最快，可能是因为熔点较低的α晶型逐渐转变为熔点较高的β′晶型，甚至是熔点更高的β型。表明随着贮存时间的增加，脂质中的熔点较低的α构型逐渐转变为熔点较高的β′构型，β′构型又逐渐转变为熔点最高的β构型，但inu12-cya-slns、inu18-cya-slns中晶格缺陷较多的α型仍存在。
由此证明在贮存过程中inu18-cya-slns脂质晶型转变最慢，其次为inu12-cya-slns，而tween-cya-slns转变最快。
实施例16
载药固体脂质纳米粒混悬液的xrd测定
分别取约10mg样品(tween-cya-slns(对比例2制备所得)、inu12-cya-slns(实施例3制备所得)、inu18-cya-slns(实施例2制备所得))置于玻璃样品容器中，以cu-kα射线为x-射线源，置于d1system多功能x射线衍射仪中扫描，扫描角度范围为10～60°，扫描速率为5°/min，记录样品的衍射图。结果见图6-8。
(1)随着贮存时间和温度的增加，tween-cya-slns位于21.35°(α和β′构型混合物)的峰减弱，储存三个月后新出现了两个分别位于19.31°(βi或β晶型)和23.67°(β晶型)的结晶峰，且这两个峰的强度均随着贮存温度的增加而增大，4℃储存六个月后,19.31°处的峰强与21.35°处接近，25℃储存六个月后，19.31°和23.67°处的结晶峰峰强均超过21.35°。这表明随着贮存时间的增加，脂质中的熔点较低的α构型逐渐转变为熔点较高的β′构型，β′构型又逐渐转变为熔点最高的β构型，脂质晶型转变明显。
(2)inu12-cya-slns在4℃贮存3个月的衍射图无明显变化；4℃贮存6个月后可见新出现的一个位于23.70°的结晶峰，说明α型部分转变为β′型。
(3)inu12-cya-slns在25℃贮存3个月后，可见新出现的两个位于19.46°(βi或β晶型)和23.86°(β晶型)的结晶峰，说明α型部分转变为β′型。而25℃贮存6个月后，19.46°和23.86°的结晶峰有轻微增强。
(4)inu18-cya-slns在4℃、25℃贮存3个月的衍射图均无无明显变化25℃贮存3个月的衍射图隐约可见两个较小的位于19.45°(βi或β晶型)和23.42°(β晶型)的结晶峰,但该峰的强度明显比相同条件下tween-cya-sln的弱的多。
(5)inu18-cya-slns在4℃贮存6个月后，仅在23.53°出现一个新的小结晶峰。在25℃贮存6个月后，位于19.45°(βi或β晶型)和23.42°(β晶型)的结晶峰没有明显变化，比相同条件下tween-cya-slns及inu12-cya-slns该处的峰强度均小，说明inu18-cya-slns的晶形转变程度比其余二者的程度均更小。
(6)在25℃贮存6个月后，三组cya-slns中的结晶峰(2θ＝6～9°)增强较空白更明显，结合包封率的结果可知均有药物漏出现象，原因可能是25℃贮存6个月后脂质晶形转变程度较大，晶格有序性增加，导致药物被排出。但inu18-cya-slns的包封率仍比其余二者大，药物排出量最少，可能是其脂质晶格无序性较其余二者均大。
以上结果表明：inu12-cya-slns与inu18-cya-slns的贮存稳定性较tween-cya-slns强，且inu18抑制脂质晶形转变的能力比inu12强。原因可能是inu12和inu18的刷状脂肪酸链能够插入脂质中扰乱其晶格有序性，并有效抑制晶形转变，但inu12的刷状脂肪酸链较短，可能限制了其扰乱晶格有序性的灵活性，导致作用减弱。