本发明属于纳米生物医学领域，涉及一种抗(anti)egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子在制备药物中的应用，具体涉及一种抗(anti)egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子在制备防治哮喘的药物中的应用。
背景技术：
哮喘是一种常见的疾病。它是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病，这种慢性炎症与气道高反应性相关。哮喘的显著病理表征是气道杯状细胞化生或者异常增生所引发的气道部位粘液过量分泌。目前早期常采用糖皮质激素控制炎症进行治疗，但是哮喘反复发作，通常会引起气道重塑、气道增生而变狭窄，从而使得在后期该药物治疗效果变差。其中，气道重塑是哮喘病理的重要指标之一，其主要病理学特征是：杯状细胞及粘液增生、支气管上皮下胶原纤维化、气道平滑肌增生肥大以及上皮改变。杯状细胞的增生与粘液分泌量直接影响气道横截面积，从而反应气道阻力的大小，而支气管上皮下胶原纤维的沉积情况是反应支气管哮喘气道重塑的重要指标，该胶原纤维主要是由ⅰ型和ⅲ型组成。近年来一些研究表明，表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)参与气道表皮杯状细胞和平滑肌细胞的增生，可能与哮喘的发生发展相关，但哮喘中涉及的因子众多，其真正的发病机制未明，故也未明确抗egfr抗体在哮喘治疗中的作用。
单链抗体(singlechainvariablefragment，scfv)作为一种分子量较小的基因工程抗体备受关注。由于完整抗体的分子量较大，所以使用基因工程手段构建出同样具有抗原结合能力的抗体片段scfv。scfv只含有抗体中与抗原结合的部分，整个大小只占完整抗体的六分之一，但仍旧具有一定与靶蛋白结合的能力。抗表皮生长因子受体单链抗体(antiegfrscfv)是一种可以特异性与egfr结合的单链抗体，由于组织细胞表面表达egfr，抗egfrscfv可作为靶向性分子来介导载体蛋白与细胞的特异性结合。基于此，将抗egfrscfv修饰于铁蛋白重链亚基(fth1)自组装蛋白表面，可获得具有靶向egfr的功能化铁蛋白抗egfrscfv::fth1融合蛋白，并进一步得到与fth1蛋白的杂合蛋白抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白。
该抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白属于纳米粒子，是由24个亚基自行组装成中空笼状结构的高度对称的生物大分子，该蛋白纳米粒子是本申请人早期构建的一个蛋白，其具体序列及制备方法已在专利号为zl201010239499.3的专利中公布。但该专利中并未提及与治疗哮喘相关的内容，故本发明在此基础上，进一步考察该蛋白用于治疗哮喘的效果。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中缺乏有效控制哮喘引起的气道重塑、气道阻力变大等副作用的药物的缺陷，提供一种抗(anti)egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子在制备药物中的应用，特别是在制备防治哮喘的药物中的应用。发明人经研究发现，抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子能够明显降低哮喘模型小鼠的肺部杯状细胞数目、减少哮喘模型小鼠的支气管粘液分泌量和减少哮喘模型小鼠的支气管皮下胶原纤维沉积，从而有效地扩大了哮喘小鼠支气管横截面积，减小了哮喘小鼠气道阻力，对哮喘小鼠的气道重塑有防治作用。
目前，抗egfr抗体多侧重用于肿瘤治疗相关的研究，由于如上述其在哮喘预防和治疗中的作用尚不确定，且哮喘机制复杂，至今未明，故用于哮喘治疗相关研究甚少。本申请人在前期构建的融合蛋白抗egfrscfv::fth1以及杂合蛋白抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子的基础上，也进行了诸多治疗肿瘤的研究；在首次尝试对哮喘进行研究时，惊奇地发现上述杂合蛋白能够明显降低哮喘模型小鼠的肺部杯状细胞数目、减少哮喘模型小鼠的支气管粘液分泌量和减少哮喘模型小鼠的支气管皮下胶原纤维沉积，从而有效地扩大了哮喘小鼠支气管横截面积，减小了哮喘小鼠气道阻力，对哮喘小鼠的气道重塑有防治作用。
本发明解决上述技术问题的技术方案是一种抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子在制备防治哮喘的药物中的应用。本发明所述抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子是由24个亚基自行组装成中空笼状结构的高度对称的生物大分子，其中抗egfrscfv::fth1蛋白亚基是将抗egfrscfv融合于fth1蛋白的n端。该蛋白纳米粒子是本申请人早期构建的一个蛋白，其具体序列及制备方法已在专利号为zl201010239499.3的专利中公布。
较佳地，所述抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白由抗egfrscfv::fth1蛋白和fth1蛋白杂合而成；其中，所述抗egfrscfv::fth1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，和/或，所述fth1蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示；更佳地，所述抗egfrscfv::fth1蛋白和/或fth1蛋白为重组蛋白。
较佳地，所述抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子的平均粒径为18nm±5nm。
较佳地，所述抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子中抗egfrscfv::fth1蛋白和fth1蛋白的摩尔比例的比值≤2，从而可以获得较多正确折叠的目标杂合蛋白；更佳地，平衡成本，所述摩尔比例为4:6。
较佳地，所述防治哮喘的药物为减小气道阻力和/或改善气道重塑的药物；更佳地，所述防治哮喘的药物为降低杯状细胞数目、减少支气管粘液分泌量和/或减少支气管上皮下胶原纤维沉积的药物。所述杯状细胞数目与支气管粘液分泌量直接影响气道横截面积，从而反应气道阻力的大小，所述支气管上皮下胶原纤维的沉积情况是反应支气管哮喘气道重塑的重要指标。
较佳地，所述药物包括抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子和至少一种药用载体；更佳地，所述抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子为所述药物的唯一活性成分。
本发明所述药物包括0.1～99.9％的抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子和0.1～99.9％药用载体，所述百分比为质量百分比。
本发明所述药物适于口服给药、经静脉、肌肉、皮内或皮下给药等。
本发明所述药物可以为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述药物可以是水溶液、非水溶液或混悬液等。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明将一种抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子应用于哮喘的防治，能够显著地降低杯状细胞数目、减少支气管粘液分泌量和/或减少支气管上皮下胶原纤维沉积，从而能够有效扩大支气管的横截面积，减小哮喘小鼠的气道阻力，对哮喘小鼠的气道重塑有防治作用。
附图说明
图1为复性后的抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子的native-page示意图，其中泳道1为去铁铁蛋白，泳道2为抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子。
图2为抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子的tem示意图。
图3为抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子与mda-mb-468细胞结合的荧光显微镜示意图，说明纳米粒子能有效与egfr受体结合。
图4为pas染色后小鼠支气管周围杯状细胞增生及粘液分泌情况的示意图。
图5为masson三色染色后小鼠支气管上皮下胶原纤维沉积情况的示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子的制备与表征
两种质粒pet-28(+)-fth1、pet-28a(+)-抗egfrscfv-fth1于本实验室现存(具体制备方法详见zl201010239499.3)。其中，所述抗egfrscfv::fth1蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述fth1蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。大肠杆菌感受态细胞e.coli.bl21(de3)和e.coli.dh5α购于北京天根生化科技公司。将上述两种质粒转化入e.coli.dh5α感受态细胞内，以菌落pcr、酶切鉴定法筛选阳性克隆。之后，通过测序将序列正确的表达载体转化入ecoil.bl21(de3)感受态细胞，以获得含有fth1蛋白基因目标工程表达菌株细胞和抗egfrscfv::fth1蛋白基因目标工程表达菌株细胞。
接着，在抗egfrscfv::fth1蛋白基因目标工程表达菌株细胞中表达抗egfrscfv::fth1蛋白。将所述菌株细胞培养在37℃含有卡那霉素的lb培养基中。当培养液od值为0.4～0.6时(卡那霉素浓度为50μg/ml)，加入1mmiptg诱导表达3小时，温度为37℃。诱导后，通过5000转(20分钟)离心得到细胞沉淀，利用buffera(50mmtris-hcl、ph7.9)洗一次，然后超声破碎。将破碎得到的细胞裂解液经5000转(4℃，15分钟)离心回收沉淀，用bufferb(50mmtris-hcl、50mmnacl、1mmedta、1％tritonx-100、ph7.9)洗四次，得到抗egfrscfv::fth1的包涵体。然后将抗egfrscfv::fth1孵育在含8m尿素的bufferc(50mmtris-hcl、8m尿素、1mmedta、10mmdtt、ph7.9)里，28℃过夜使得蛋白充分变性。
利用fth1蛋白基因目标工程表达菌株细胞表达fth1蛋白，表达条件与上述表达抗egfrscfv::fth1蛋白相同。不同的是所获得的fth1为可溶蛋白。在此，采用superose6尺寸排阻柱akta(购自ge)得到纯化的fth1蛋白。然后将fth1蛋白溶于含8m尿素的bufferc里，28℃过夜使得蛋白充分变性。然后，将洗涤与变性后的抗egfrscfv::fth1蛋白与fth1蛋白以4:6的摩尔比混合，蛋白总质量为5mg，体积为50ml。在含4、3、2、1和0m尿素bufferd中4℃依次透析，其中bufferd(50mmtris-hcl、0.5mmedta、50mmnacl、10％glycerol、0.1％polyethyleneglycol(peg)、0.5mmcuso4、ph7.9)，然后再转入buffere(50mmtris-hcl、50mmnacl、10％glycerol、ph7.9)透析。最后，将得到的蛋白利用50kd超滤装置过滤浓缩得到高浓度抗egfrscfv::fth1/fth1杂合蛋白。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳native-page(如图1)和透射电子显微镜tem(如图2)结果显示抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子正确折叠组装且纳米粒子的平均直径为18nm±5nm。
荧光显微镜检测抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子与内源性表达egfr于细胞表面的mda-mb-468乳腺癌细胞(购自中国科学院细胞库)的结合，如图3所示，说明抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白具有与细胞表面egfr受体结合的活性。
本实验结果说明，抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子制备成功，并在细胞实验上成功表征，得到了有活性的抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子。
实施例2抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子对小鼠肺部杯状细胞数目和支气管粘液分泌量的影响
1.实验材料
1.1实验对象
spf级balb/c小鼠，体重18～20克，6～8周龄，随机分为2组。
1.2实验试剂
1)腹腔注射致敏液，其为含有卵白蛋白(ova)与al(oh)3的pbs溶液，ova浓度为10mg/l，每只小鼠腹腔注射0.2ml。
2)激发溶液为ova浓度为20mg/l的pbs溶液，激发方式为雾化激发，平均中位直径2.9μm的雾化颗粒，雾化时间30分钟。
3)其他试剂均采用分析纯的药物用无菌pbs配置获得。
4)抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子，实施例1中制备。
2.实验方法
哮喘模型构建：腹腔注射卵白蛋白(ova)致敏balb/c小鼠，21天后对balb/c小鼠进行ova雾化激发；激发共计7天，每天1次，每次30分钟。其中，在第一、三、七次雾化后，将pbs(对照组)、抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子分别腹腔注射入小鼠体内。最后一次注射结束24小时后解剖小鼠，收集小鼠肺组织。切片染色检测肺部支气管周围杯状细胞增生及粘液分泌情况，杯状细胞增生与粘液分泌直接影响气道横截面积，反应气道阻力大小。
实验组具体分为以下2组：
a、pbs组：ova造模小鼠3周后腹腔注射pbs，体积为0.2ml，第一、三、七次雾化激发后注射。
b、抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白组：ova造模小鼠3周后腹腔注射抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子，剂量为0.75nm，体积为0.2ml，第一、三、七次雾化激发后注射。
最后一次注射结束24小时后，小鼠行颈椎脱臼法处死，解剖小鼠，取完整肺部，4％(w/v)多聚甲醛固定24小时，固定后经梯度酒精脱水，酒精梯度依次为50％(v/v)、70％(v/v)、85％(v/v)、95％(v/v)直至100％(v/v)纯酒精，每个梯度脱水1小时。脱水后进行透明，将肺组织转移至纯酒精与二甲苯1:1(体积比)的混合液浸渍1.5小时，再转入纯二甲苯中浸渍1小时。透明后进行浸蜡与包埋，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯1:1(体积比)的混合液2个小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中各浸渍3小时，浸蜡后包埋，包埋好的组织块4℃冰箱中过夜后切片。
处理好的组织切片行pas染色，将石蜡切片脱蜡至水后，放置于蒸馏水中浸洗1分钟。滴加1滴(约100μl)高碘酸(试剂a)染色10分钟，蒸馏水冲洗。滴加1滴(约100μl)schiff氏液(试剂b)染色10～20分钟。倾除试剂b。直接滴加1滴(100μl)偏重亚硫酸钠(试剂c)作用1分钟(2次)。然后在流水下冲洗10分钟。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。显微镜检测小鼠肺组织细胞染色情况。
3.实验结果
pas染色(过碘酸雪夫染色)中的过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与schiff氏液的无色品红结合，红色定位于胞浆上。而哮喘模型肺组织中的杯状细胞及其分泌的粘液中含有大量糖原，因此可以通过pas染色观察肺组织中杯状细胞增生肥大及支气管内粘液的分泌情况。杯状细胞的增生与粘液分泌量直接影响气道的横截面积，从而观察对气道阻力大小的影响。结果如图4所示，经pas染色后，抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子组中小鼠支气管杯状细胞的增生较pbs组受到抑制，且粘液分泌显著减少。
本实验结果表明，抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子对哮喘小鼠杯状细胞增生的抑制明显，且粘液分泌明显减少，从而有效的扩大了哮喘小鼠支气管横截面积，有效减小哮喘小鼠气道阻力。
实施例3抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子对小鼠支气管上皮下胶原纤维沉积的影响
1.实验方法
1)哮喘模型构建同实施例2，即在第一、三、七次雾化后，将pbs、抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子分别腹腔注射入小鼠体内。最后一次注射结束24小时后解剖小鼠，收集小鼠肺组织。切片染色检测支气管上皮下胶原纤维沉积情况，这个是反应支气管哮喘气道重塑的重要指标。
2)实验组设计、石蜡切片技术及切片染色前处理同实施例2。
3)处理好的组织切片行masson三色染色，将石蜡切片脱蜡至水后，依次自来水和蒸馏水洗5分钟。苏木素染核2分钟，充分水洗，用温水返蓝，再用masson三色丽春红酸性复红液染10分钟，1％(w/w)磷钼酸水溶液分化5分钟，1％(w/v)苯胺蓝染5分钟，最后用1％(v/v)冰醋酸水溶液分化10秒。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。显微镜检测小鼠肺组织细胞染色情况。
2.实验结果分析
masson三色染色主要用于对胶原纤维的染色和检测。哮喘模型的肺组织由于大量的胶原沉积导致气道重塑，胶原纤维主要是由ⅰ型和ⅲ型组成，经masson三色染色后呈鲜红色。实验结果如图5，结果显示抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子组小鼠气道胶原纤维沉积面积较pbs组明显减少。本实验结果表明，抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子能够明显抑制哮喘小鼠气道胶原纤维的沉积，从而对哮喘小鼠气道重塑有防治作用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
sequencelisting
<110>华东理工大学
<120>抗egfrscfv::fth1/fth1蛋白纳米粒子在制备药物中的应用
<130>p180113452c
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<170>patentinversion3.5
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<211>436
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<213>人工序列（artificialsequence）
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<223>抗egfrscfv::fth1融合蛋白
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<213>智人（homosapiens）
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